KHDAK tedavisinde moleküler patolojinin yeri Ulusal Kanser Kongresi 19-23 Nisan 2013 Dr Büge Öz İÜ Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Patoloji AD
Hiçbir çıkar ilişkim yoktur.
Akciğer adenokarsinomlarında genetik değişiklik ile ilgili son durum WT ALK KRAS EGFR KRAS EGFR ALK Her2 BRAF PI3KCA MET AKT MAP2KI ROS1 KIF5B-RET WT Hedefe yönelik tedavi 3
KHDAK için moleküler testler için klinik pratik rehberi; 12 Şubat 2013 de yayına kabul edildi 3 resmi derneğin desteği ile; CAP: Collage of American Pathologist IASLC: International Association for the Study of Lung Cancer AMP :Association for Moleculer Pathology Ocak 2004- Şubat 2012 aralığında literatür tarama Meta-analiz, randomize kontrollü araştırmalar, cohort çalışmaları, vaka serileri, karşılaştırmalı metot araştırmaları 1533 özet 521 yayın Yayınlanmadan önce sonuçlar: FDA, NCI, ASCO,NCCN ile tartışıldı.
Tüm çalışmalar/ çalışmaların çoğunluğunda ortak sonuç var; Grade A ve B düzeyinde Kanıt değeri = Recommendation (KD: A / B) Grade C düzeyinde kanıt var ; Suggestion 2. derece Öneri = 2. Ö Grade D düzeyinde kanıt/ kanıt net değil ; Uzman fikir birliği = UFB
ANA Sorular I: KHDAK hastalarında ne zaman moleküler test yapılmalı? II: EGFR Mutasyonu testi nasıl yapılmalı? III: ALK testi nasıl yapılmalı? IV: Akciğer adenokarsinomlarında diğer genler için test yapılmalı mıdır? V: Akc AdenoKA moleküler testleri nasıl uygulanmalı ve optimize edilmelidir?
ANA Soru I: KHDAK hastalarında ne zaman moleküler test yapılmalı? Soru 1: Hangi hasta EGFR mutasyonu ve ALK yeni gen düzenlenmesi için test edilmeli? Soru 2: Ne zaman EGFR mutasyonu ve ALK yeni gen düzenlenmesi test edilmeli? Soru 3: Bu testler hangi zaman aralığında yapılıp sonuçlanmalı/ sonuçlanabilir?
Soru 1: Hangi hasta, EGFR mutayonu ve ALK yeni gen düzenlenmesi için test edilmeli? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 1.1a: EGFR-TKI tedavisi düşünülen tüm hastalar klinik karakteristiklerine bakılmadan EGFR için moleküler olarak test edilmelidir. KD: A 1.1b: ALK hedef tedavisi düşünülen tüm hastalar klinik karakteristiklerine bakılmadan ALK gen düzenlenmesi için test edilmelidir. KD: B 1.2 EGFR ve ALK için Akc adenokaları/ AdenoKA komponentli tm.ler histolojik dereceye bakılmaksızın test edilmeli, saf SHK, KHK yada İHK ile adenoka komponenti olmayan BHK lar test edilmemelidir. KD:A
Soru 1 : Hangi hasta, EGFR mutayonu ve ALK yeni gen düzenlenmesi için test edilmeli? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 1.3 Biyopsi/ sitoloji gibi sınırlı materyallerde AdenoKa olasılığı tamamen dışlanamadığından (özellikle sigara içmemiş genç hasta) SHK ve KHK da test edilebilir. KD: A 1.4 Tedavi seçiminde EGFR / ALK statüsü belirlerken primer yada metastatik tm örnekleri her ikisi de çalışılabilir (aralarında fark yok). KD: A 1.5 Birbirinden ayrı multipl primer AdenoKa her biri ayrı ayrı test edilir, ancak aynı tm.ün farklı alanlarının test edilmesi gerekmez. UFB
KHDAK larında küçük materyal ile değerlendirme Adenokarsinom KHDAK-NOS Skuamöz hücreli karsinom IHK: TTF-1 + NapsinA CK 7 + (Müsin +) IHK «-» Müsin «-» KHDAK sınıflanamayan IHK: P63/ N p63 (p40) SK 5-6 Desmokollin3 Müsin «-» Literatürde oran % 5-10
KHDAK larında küçük materyal değerlendirme-raporlama Skuamöz hücreli karsinom (Histo-morfolojik tanı, immunhistokimya gerekli değil) Adenokarsinom (Histo-morfolojik tanı, immunhistokimya gerekli değil) KHDAK büyük olasılıkla Skuamöz H. Ka (İmmunhistokimya ile ) KHDAK büyük olasılıkla Adenokarsinom (İmmunhistokimya ile ) KHDAK NOS (immunhistokimya kesin değil/ yapılamamış) Diğer tip KHDAK (tükrük bezi tipi, vb)
Soru 1 : Hangi hasta, EGFR mutayonu ve ALK yeni gen düzenlenmesi için test edilmeli? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 1.3 Biyopsi/ sitoloji gibi sınırlı materyallerde AdenoKa olasılığı tamamen dışlanamadığından (özellikle sigara içmemiş genç hasta) SHK ve KHK da test edilebilir. KD: A 1.4 Tedavi seçiminde EGFR / ALK statüsü belirlerken primer yada metastatik tm örnekleri her ikisi de çalışılabilir (aralarında fark yok). KD: A 1.5 Birbirinden ayrı multipl primer AdenoKa her biri ayrı ayrı test edilir, ancak aynı tm.ün farklı alanlarının test edilmesi gerekmez. UFB
Yatabe Y et al. JCO 2011;29:2972-2977 EGFR mutasyon dağılımı
AKC Adenokarsinomları EGFR mutasyonlarında psödo-heterogenite Yatabe Y et al. JCO 2011;29:2972-2977
Soru 2: Ne zaman EGFR mutasyonu ve ALK yeni gen düzenlenmesi test edilmeli? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 2.1a : (7. Evreleme sistemine göre) ileri evredeki hastalar için EGFR mutasyon testi hemen tanı sırasında istenmelidir. Daha düşük evreli hastalar için tümör nüksünde/ progresyonunda da test edilebilir. KD: A 2.1b: 2.Ö (7. Evreleme sistemine göre) ileri evredeki hastalar için ALK gen düzenlemesi testi hemen tanı sırasında istenmelidir. Daha önce test edilmemiş, düşük evreli hastalar tümör nüksünde/progresyonunda da test edilebilir. KD:C
Soru 2: Ne zaman EGFR mutayonu ve ALK yeni gen düzenlenmesi test edilmeli? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 2.2a UFB Evre I, II, ve III hastalarda EGFR testinin tanı sırasında yapılması desteklenmelidir, ancak son karar bölgesel onkoloji- patoloji takımına bırakılmalıdır. 2.2b UFB Evre I, II, ve III hastalarda ALK testinin tanı sırasında yapılması desteklenmelidir, ancak son karar bölgesel onkoloji- patoloji takımına bırakılmalıdır. 2.3 Dokular EGFR ve ALK testi yapımı öngörülerek değerlendirilmelidir. (EGFR için KD:A, ALK için KD:B)
Patolojiye gelen örnekler Eksfolyatif sitoloji balgam Bronşiyal yıkama Bronşio-alveolar lavaj Aspiraston sitolojisi TTİİAB EBUS Hücre bloğu EUS Biyopsi Bronş biyopsisi Transbronşiyal biyopsi Metastatik alandan aspirasyon, tru-cut biyopsi
İmmunhistokimya ; nereye kadar?? Adeno / skuamöz için birer belirleyici, tercihan nükleer boyalar Yeterli gelmez ise iki sitoplazmik (birbirini dışlayan) primer antikor Daha fazla doku harcanmadan raporlanmalı Çift sorgulama yapan primer antikor yakında ticari olarak edinilebilecek (tek kesit ile adeno/skuamöz ayrımı ) March 2-8, 2013 Baltimore Convention Center Baltimore
Soru 3: Bu testler hangi zaman aralığında yapılıp sonuçlanmalı/ sonuçlanabilir? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 3.1 UFB EGFR ve ALK test sonuçları 2 hafta (10 işgünü içinde verilmelidir. 3.2 UFB Bu testleri ortalama 2 haftada gerçekleştiremeyen laboratuvarlar ya bu testleri 2 haftaya çekmeli yada 2 haftada yapacak laboratuvara yönlendirmelidir. 3.3UFB Final histopatolojik tanıdan sonra ortalama 3 iş gününde moleküler test lab. gönderilmeli yada aynı lab ise 24 saat içinde bu lab.da işleme başlanmalıdır.
ANA Soru II: EGFR Mutasyonu testi nasıl yapılmalı? Soru 4. EGFR mutasyonu araştırılacak materyaller nasıl işlem görmeli? Soru 5: EGFR testi için gereken materyal nedir/ ne kadardır? Soru 6: EGFR testi nasıl yapılmalıdır? Soru 7: Hastalarda EGFR TKI tedavi seçiminde KRAS analizinin rolü nedir? Soru 8: Sekonder/edinsel EGFR- TKI tedavi direncinin oluşumunda önem kazanan ek test nelerdir?
Soru 4. EGFR mutasyonu araştırılacak materyaller nasıl işlem görmeli? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 4.1 UFB Patolog PCR bazlı EGFR testi için FFPG taze, donmuş yada alkol fikse doku kullanabilir. Diğer (dekalsifikasyon işlemi görmüş doku, asitli yada ağır metal içeren fiksatiften geçmiş ) doku örneklerinden kaçınılmalıdır. 4.2 UFB EGFR yada ALK testi için sitolojik materyal (hücre bloğu, smear preparatları ) da uygundur.
Hangi fiksatif???? Moleküler çalışma için uyumlu %10 tamponlu formalin, paraformaldehit, Karnovsky fiksatifi Moleküler çalışma için uyumsuz Bouvin, B5, Zenker fiksatifi, sitolojik materyalde sadece Alkol fiksatifi, civa klorid fiksatifi, Holand fiksatifi, Asit bazlı dekalsifikasyon Kemik biyopileri için EDTA dekalsifikasyonu (hızlı ve DNA hasarı daha az ) March 2-8, 2013 Baltimore Convention Center Baltimore
Soru 5: EGFR testi için gereken materyal nedir/ ne kadardır? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 5.1 UFB EGFR testi için materyalde yeterli miktar tümör olup olmadığına ve materyalin kalitesinin yeterliliğine patolog karar vermelidir. 5.2 UFB Testin validasyonu sırasında en az ne kadar tümör miktarının gerektiğine her lab kendisi karar vermelidir. 5.3 UFB Patolog her örnekte ne kadar tümör olduğunu kendi saptamalı yada bunu yapacak lab. teknisyenleri için eğitim rehberi oluşturmalıdır.
Materyal seçiminde Önemli noktalar, Test duyarlılığını negatif etkileyenler Materyalde tümör hücre oranı %40 ın altında ise mutasyonu saptayamayabilir Tümör hücrelerinin en çok olduğu blok seçilmeli (%50 den fazla) ve alan işaretlenip sadece o alan çalışılmalı Enflamasyon ve nekrotik alanlar olmamalı Kemik metaz. biyopsisi dekalsifikasyon nedeniyle sorun!! Fiksasyon çok önemli; küçük doku için 6-12 sa. ve büyük dokular için 12-48 saat. %10 tamponlu Formalin fiksasyonu Alkol (sitolojik materyalde) özellikle FISH uygulamasını olumsuz etkiliyor
Soru 6: EGFR testi nasıl yapılmalıdır? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 6.1 Laboratuvarlar EGFR için valide edilmiş ve yeterli performansı olduğu kanıtlanmış herhangi bir test yöntemi kullanabilir. KD:B 6.2 UFB Lab. en az %50 tümör içeren materyalden EGFR testi yapabilmeli, gerektiğinde %10 kadar tm içeren materyal var ise daha hassas metotlar uygulanabilmeli-yada böyle bir lab a gönderilmeli. 6.3 UFB Mutasyonu saptayacak yöntem %1 yada daha fazla klinik önem taşıyan tüm mutasyonları gösterebilecek bir yöntem olmalıdır. 6.4 EGFR- TKI tedavisi belirlemede EGFR için İHK yöntemi kullanılamaz. KD:A 6.5 EGFR- TKI tedavisi belirlemede gen kopya sayısı saptanması (FISH yada CISH) önerilmez. KD:B
DAHA FAZLA tümör hücresine gereksinim var! Tanısal materyal için biyopsi teknikleri ve elde edilen doku volümü Biyopsi başına hücre sayısı Önerilen Biyopsi sayısı 21g asp. iğnesi 19g asp iğnesi Tran b biyopsi BT eşliğinde İAB 100 150 300 500 4 4 4 2-3 50 ml reak 75 ng DNA Sonunda 3-6 pmol. DNA
Screening technologies Mutation araştırma metotları Method PCR direct sequencing Sensitivity (% of mutant DNA ) Pyrosequencing 5-10 % PCR / dhplc / HRMA (Melt analysis ) Fragment analysis Genscan- PCR/SSCP Scorpion arms 1% Comments 10-30 % Require at least 50 neoplastic cells in the sample 5% Only screening for mutation 5% Only screening for mutation Targeting technologies Chip micro-array 1% PNA/ LNA Clamp 0.1-1 % Me PCR-sequencing 0.1-1% Sec Gen sequencing 0.01 %
Soru 7: Hastalarda EGFR TKI tedavi seçimi için KRAS analizinin rolü nedir? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 7.1 EGFR TKI tedavisi belirlenirken KRAS mutasyonu statüsünü belirlenmesi şartı aranmaz. KD:B
Soru 8: Sekonder/edinsel EGFR- TKI tedavi direncinin oluşumunda önem kazanan ek testler nelerdir? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 8.1 Eğer laboratuvar EGFR kinaz inhibitörlerine sekonder direnç gösteren durumları örneğin %5 kadar hücrede görülebilen EGFR T790M mutasyonu gibi mutasyonları saptayabiliyorsa bunlara bakılabilir. KD:B
EGFR inhibitörlerine sekonder direnç SCLC transformation 6% MET amplification 4% PIK3CA 5% MAPK1 amplification 5% Unknown 15% Her2 amplification 12% EGFR T790M +/- amplification 50% 31
ANA Soru III: ALK testi nasıl yapılmalıdır? Soru 9. ALK testi için hangi yöntem kullanılmalıdır? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 9.1 Lab ALK testi için dual break-apart probu içeren FISH testi uygulamalıdır. İmmunhistokimya, eğer dikkatlice valide edildiyse FISH e gidecek materyalin seçimi için kullanılabilir. KD:B 9.2 RT-PCR ın FISH yöntemi yerine kullanılması önerilmez. KD:B
ALK İmmunhistokimya değerlendirmesi Histo-skor =(H-Skoru) semi-kantitatif; Yaygınlık ve yoğunluk derecelendirilmesi +,++,+++ pozitif 0 1+ 2+ 3+
Soru 9. ALK testi için hangi yöntem kullanılmalıdır? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 9.3 UFB Patolog ALK FISH testinin uygulanacağı kesitlerin seçiminde, tümör paterninin algılanması, sitoloji ve materyalin kalitesinin tayininde mutlaka rol almalıdır. 9.4 UFB Patolog ALK FISH preparatının yorumlanmasında ya direkt olarak yada solid tümör FISH uygulaması yapacak olan sitogenetik/ teknisyeninin eğitiminde yer almalıdır. 9.5 UFB ALK inhibitörlerine sekonder direncin geliştiği durumda ALK ilişkili sekonder mutasyonların saptanması için test uygulanması gerekmez.
ANA Soru IV: Akciğer adenokarsinomlarında diğer genler için test yapılmalı mıdır? Soru 10. Akciğer Kanserinde diğer moleküler testlerin yapımı uygun mudur? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 10.1 EGFR testi tüm diğer genetik testler arasında önceliği almalıdır. KD:A, 10.2 2.Ö Bugün için Akc AdenoKa için EGFR testi ardından ALK testi dışında diğer literatürde yer alan moleküler testlerin yapılması için yeterli düzeyde kanıt yoktur. KD:C
ANA Soru V: Akc AdenoKA moleküler testleri nasıl uygulanmalı ve optimize edilmelidir? Soru 11. Tüm adenokarsinomlar hem EGFR hem de ALK için test edilmeli midir? Soru 12. EGFR ve ALK test sonuçları nasıl raporlanmalıdır? Soru 13. EGFR ve ALK testleri nasıl valide edilmelidir? Soru 14. Bu testlerle ilgili Kalite-kontrol güvencesi nasıl sürdürülmelidir?
Soru 11. Tüm adenokarsinomlar hem EGFR hem de ALK için test edilmeli midir? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 11.1 UFB Her lab kendi içinde testlerin efektifliğine göre testlerin algoritmasını belirleyebilir, testlerin sırasından çok tamamlanma süresi daha fazla önem taşır. Soru 12. EGFR ve ALK test sonuçları nasıl raporlanmalıdır? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 12.1 UFB EGFR test raporu ve ALK FISH raporu bir sonuç ve testin uygulaması ile ilgili verileri içermeli, onkologlar tarafından ve konunun uzmanı olmayan patologlar tarafından kolayca anlaşılabilmelidir.
Akc KHDAK larında prediktif belirleyicilerin saptanmasında CTF algoritması Adenokarsinom, KHDAK, AC fenotipi ( IHK) EGFR mutasyon analizi, KRAS (isteğe bağlı???) mutasyon analizi ALK IHK Skorlama ALK FISH
Soru 13. EGFR ve ALK testleri nasıl valide edilmelidir? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 13.1 UFB EGFR testi ve ALK FISH testi validasyonu diğer moleküler test ve FISH testlerinde olduğu gibi yapılmalıdır. Soru 14. Bu testlerle ilgili Kalite-kontrol güvencesi nasıl sürdürülmelidir? ÖNERİLER (Kanıt değeri= KD) 2. Derece Öneri :Ö (Uzman fikir birliği:ufb) 14.1 UFB Laboratuvarlar benzer şekilde kalite kontrol ve kalite güvencesi politikası ve prosedürleri oluşturmalıdır. Ayrıca diğer klinik lab. yöntemlere edinilenlere benzer yeterlilik belgesine sahip olmalıdır.
CTF Patoloji deneyimi Mart 2013 EGFR 456 hasta: pozitiflik %15.6 %15.6 NEGATİF POZİTİF ALK 230 hasta: pozitiflik %5.9 diğer pozitif
Türkiye de son durum; KHDAK için tanı sırasında problemler: Kötü kalite fiksasyon- optimal olmayan doku işlemleri, Tümörlerde tip tayininde sorunlar Moleküler test için doku saklanmaması Her test için ayrı ayrı lab. a gönderilmesi Moleküler test için geçen sürenin uzunluğu Seçilmiş- kalifiye laboratuvar tayini/ istihdamı Laboratuvar kalite kontrol / sertifikasyon Geri ödeme sorunları
Review and Analysis BioView s unique Touch- Screen the ideal solution for easy and intuitive cell selection and segmentation
Analysis ALK Hybridized FFPE Lung Tissue - Challenges Sample Characteristics Auto fluorescence 3 Dimensional sample Per-cell analysis and report requires accurate cell segmentation as apposed to ratio based designed tests
Review and Analysis - Cell Selection Operator selects 50 cells from captured fields Operator selects additional 50 cells from captured fields, in case equivocal result obtained after 50 cells are selected
Dikkatiniz için teşekkürler