TROMBOSİT AGREGASYONU BİO. ÜMİT AKMAN

Transkript

1 TROMBOSİT AGREGASYONU BİO. ÜMİT AKMAN

2 PRİMER HEMOSTAZ LABORATUVAR TESTLERİ TROMBOSİT SAYIMI CBC VE PERİFERİK YAYMA (TROMBOSİTOPENİ OLMADIĞINDAN EMİN OLUNMALI) KANAMA ZAMANI IVY YÖNTEMİ IN VITRO KANAMA ZAMANI (PFA-100 Platelet Function Analyzer) TROMBOSİT AGREGASYONU AKIM SİTOMETRİ ÖNEMLİ DİĞER TESTLER FİBRİNOJEN vwf:ag vwf:ris.co. vwf:cb vwf Multimer Analizi

3 TROMBOSİT AGREGASYON YÖNTEMLERİ TURBİDİMETRİK (OPTİK) AGREGOMETRİ : (BORN METHOD) BULANIKLIK FARKINA BAĞLI ÖLÇÜM İMPEDANS AGREGOMETRİ: (ELEKTRİK RESİSTANSI, INGERMAN-WOJENSKI AND SILVER METHOD) ELEKTRİK AKIMINA KARŞI OLUŞAN DİRENCE BAĞLI ÖLÇÜM TROMBOSİT SAYIM YÖNTEMİ: FİBRİNOJEN BAĞLANMASININ TETKİK EDİLMESİ: GP IIb/IIIa RESEPTÖRÜNÜN İŞARETLENMİŞ FİBRİNOJEN İLE BAĞLANMASININ RADIOIMMUNOASSAY YÖNTEMİ İLE ÖLÇÜLMESİ

4 GEREKLİ MALZEME VE MATERYALLER CİHAZ: AGREGOMETRİ (Turbidimetrik Yöntem ör.chrono-log) AÇILIR AYAKLI SANTRİFÜJ MİKRO PİPET (ör.hamilton) KARIŞTIRICI BALIK (STIR BAR) (TROMBOSİTLERİN SÜSPANSİYON HALİNDE KALMASINI SAĞLAR) KÜVET: SLİKONİZE CAM TÜP VEYA PLASTİK TÜP KAN ALIM İÇİN SODYUM SİTRATLI TÜP veya TROMBİN İNHİBİTÖRLÜ TÜP

5 TÜP TÜRÜ SODYUM SİTRATLI TÜP KANDAKİ Ca 2+ TUTALARAK PIHTILAŞMANIN DOĞAL OLARAK BAŞLAMASININ ÖNÜNE GEÇER (SİLKONİZE CAM VEYA PLASTİK TÜP) (4 ml) TROMBİN İNHİBİTÖRLÜ TÜP HİRUDİN İÇERİR. TROMBİNİ BAĞLAR. (3 ml) a) KLİNİKLERDE ALINAN KANLARIN MAKUL SÜREDE LABORATUVARA ULAŞMASI, b) KAN ALAN KİŞİLERİN TÜPLER ÜZERİNDEKİ İŞARET VE MİKTARLARA DİKKAT ETMESİ, c) KAN ALINDIKTAN SONRA TÜPLERİN ÇALKALAMADAN ALT ÜST EDİLMESİ BİR KAÇ KEZ, d) ÖZELLİKLE KLİNİKLERDEN GELEN KANLARDA PIHTI OLUP OLMADIĞINA DİKKAT EDİLMESİ GEREKMEKTEDİR.

6 HASTANIN UYMASI GEREKEN ŞARTLAR HASTA MÜMKÜNSE SON GÜNDÜR HERHANGİ BİR İLAÇ KULLANMAMIŞ OLMALIDIR. İLAÇ KULLANIMINDA TEST İLAÇTAN ETKİLENEN TROMBOSİTLERİN SİSTEMDEN TEMİZLENMESİ VE YENİLERİNİN ÜRETİLMESİ İÇİN GÜN ERTELENİR. (TROMBOSİT ÖMRÜ ORTALAMA 7-10 GÜN OLUP YAŞLANAN TROMBOSİTLER RETİKÜLOENDOTELYAL SİSTEM TARAFINDAN DOLAŞIMDAN TEMİZLENİR. ) SABAH AÇ KARNINA KAN VERMELİDİR. YAĞLI GIDALAR (SÜT, KATI YAĞ vb) PLAZMANIN LİPEMİK OLMASINA NEDEN OLABİLİR.

7 SANTRİFÜJ AÇILIR AYAKLI SANTRİFÜJ KULLANILIR. PRP (TROMBOSİTTEN ZENGIN PLAZMA) 700 RCF DE 7 DAKIKA SANTRİFÜJ EDİLİR. PRP DE PLATELET SAYISI <100 BİN OLMAMALI PPP (TROMBOSİTTEN FAKİR PLAZMA) 2500 g DE 7 DAKIKA SANTRİFÜJ EDİLİR REFERANS PLAZMA PPP DE PLATELET SAYISI <10 BİN OLMALI

8 ÇALIŞMA Cihaz çalışma yöntemine göre ayarlanır. Trombositten fakir plazma (kör tüp) cihazın referans kısmına yerleştirilir. Her hastanın kendi fakir plazması (referans plazması) kullanılmalıdır. Trombositten zengin plazma örneği pipetle sitratlı tüpten Buffy-coat a en yakın bölümden 500 µl (her bir test için) alınır. (Alınan PRP içine kırmızı küre kontaminasyonu olmamalı.) Alınan örnek silikonize tüpe (küvet) konur. Hasta silikonize tüpteki PRP örneği cihazın inkübasyon alanında 3 dakika inkübe (37 0 C) edilir. İnkübasyon sonunda silikonize tüpe karıştırıcı (stirr-bar) konur. Ölçüm alanına yerleştirilir. Çalışmaya başlanır. PRP

9 ZAYIF AGONİSTLER ADP HANGİ TESTLERİ ÇALIŞABİLİRİZ TEST ADI PİPETLENECEK PRP HACMİ FİNAL DERİŞİM REAKTİFMİKTARI 1 µl DÜŞÜK DOZ 500 µl 2 µ M 3 µl YÜKSEK DOZ 500 µl 6 µ M EPİNEFRİN 0.5 µl 500 µl 10 µ M GÜÇLÜ AGONİSTLER COLLAGEN 0.5 µl 500 µl 1 µg/ml (KAYNAK AT TENDONU) TROMBİN 50 µl 500 µl 1 Unit ARACHIDONIC ACID RİSTOSETİN 5 µl 500 µl 0.5 mm 5 µl YÜKSEK DOZ 500 µl 1.25 mg/ml 2 µl DÜŞÜK DOZ 500 µl 0.5 mg/ml

10 Trombosit Fonksiyon Bozuklukları Trombosit adezyon bozuklukları: Bernard Soulier sendromu,gp Ib/IX Eksikliği Trombosit aggregasyon bozuklukları: Glanzmann trombastenisi (GPIIb-IIIa eksikliği) Sekresyon bozuklukları: Release bozuklukları ve granül bozuklukları Gri platelet sendromu Plazma faktör eksikliklerine bağlı trombosit işlev bozuklukları: von Willebrand Hastalığı, Afibrinojenemi

11 AGREGASYON REAKTİF ASPİRİN ETKİSİ VON WILLEBRAND BERNARD SOULIER SEKRESYON BOZUKLUĞU GLANZMANN S THROMBASTHENIA ADP İKİNCİL DALGA İZLENMEZ NORMAL İKİNCİL DALGA İZLENMEZ İZLENMEZ KOLLAJEN NORMAL, NORMAL NORMAL İZLENMEZ AZALMIŞ AZALMIŞ EPINEFRIN İKİNCİL DALGA İZLENMEZ NORMAL NORMAL İKİNCİL DALGA İZLENMEZ İZLENMEZ RISTOSETIN NORMAL İZLENMEZ, NORMAL AZALMIŞ, AZALMIŞ AZALMIŞ, NORMAL NORMAL HAFİF ARTMIŞ TİP2B PSEUDOvWH TİP 2B VE PSEUDO vwh DA RİSTOSETİNLE (DÜŞÜK DOZ) NORMAL VEYA YÜKSEK AGREGASYON CEVABI VERİR PSEUDO vwh DA PLATELET YÜZEYİNDE GP I ANTİJENİ DEFEKTİ VARDIR. BU DEFEK BAĞLANMAYI ARTIRIR vwh TYPE 2B DE PLAZMADA BÜYÜK vwf MULTİMERLERİ YOKTUR.

12

13 TROMBOSİT FONKSİYON BOZUKLUKLARI Hermansky-Pudlak sendromu Dense Granül ADP ß-tromboglobulin Platelet faktör 4 α-granül Gri platelet sendromu Lizozom Chédiak- Higashi anomalisi Hydrolase Platelet-derived Growth Factor Fibrinojen Faktör V Gri platelet sendromunda periferik yaymada trombositler hayalet gibi gri soluk renkte görülür.

14 TROMBOSİT AGREGASYON vwf Gp Ib Dense Granül Thrombasteni Release Defects ADP IIb IIIa D IIb IIIa ADP IIb IIIa D E Fibrinojen Afibrinojenemi

15 0 COLLAGEN İLE AGREGASYON Agregasyon YÜZDE 100 Reaktif ekleme Baseline Trombositlerde şekil değişikliği a b c ZAMAN (Dak:sn) a b c Agonist ile uyarılmayı takiben ilk anda trombositler diskoid yapıdan sferik forma dönüşür (şekil b). Bu sırada, agregometre turbiditede hafif bir artış kaydeder. Bu transformasyon trombosit agregasyonu için şart değildir. Örneğin, epinefrin kaydedilebilen birşekil değişikliğine neden olmadan agregasyon oluşturur

16 TROMBOSİT SFERIK FORM AKTİVE HALİ TROMBOSİT DISKOID FORM İSTİRAHAT HALİ FLOPODIAL UZANTILAR

17 100 ADP İLE AGREGASYON Sekonder Agregasyon (İkincil dalga) Agregasyonun ilk aşaması tersinebilirdir. Trombosit aktivasyonunu başlatan agonistler zayıf ve güçlü olarak sınıflanırlar. Güçlü agonistler (kollajen, trombin vb.) agregasyonun engellendiği şartlarda dahi (örn. Glanzman trombastenisi) granül sekresyonunu uyarabilirler. Zayıf agonistler (ADP, epinefrin vb.) ise yalnız başlarına granül sekresyonunu uyaramazlar; ancak agregasyonu uyarabilirler. Agregasyon neticesinde sekresyon gerçekleşebilir. YÜZDE Agregasyon plato Trombositlerde şekil değişikliği Reaktif ekleme 0 Baseline ZAMAN (Dak:sn)

18 100 RİSTOSETİN İLE AGREGASYON YÜZDE Reaktif ekleme 0 Baseline ZAMAN (Dak:sn) BİO. ÜMİT AKMAN

19 0 EPİNEFRİN İLE AGREGASYON Sekonder Agregasyon (İkincil dalga) Epinefrinle plateletlerde kaydedilebilen bir şekil değişikliğine neden olmadan agregasyon oluşur. YÜZDE Primer Agregasyon (birincil dalga) Agregasyon plato 100 Reaktif ekleme Baseline BİO. ÜMİT AKMAN ZAMAN (Dak:sn)

20 ADP İLE AGREGASYON 0 YÜZDE Disagregasyon Reaktif ekleme 100 Baseline SEKRESYON BOZUKLUĞU Fibrinojen ile GPIIb/IIIa bağlanması başlangıçta tersinebilir bir reaksiyondur. Divalan iyonların ya da agonistlerin ortadan kalkması ile fibrinojen reseptöründen ayrılabilir. Trombosit sekresyonunu uyaramayacak kadar düşük konsantrasyonda ADP veya epinefrin kullanılarak ya da sekresyon bozukluğu olan trombositlerle agregasyon incelendiğinde küçük bir agregasyon dalgası ortaya çıktığı, ancak agregasyonu amplifiye edecek yoğun ve α granül içerikleri salınamadığından dolayı trombositlerin fibrinojen moleküllerinden ayrılarak çözündükleri (= disagregasyon) izlenir.

21 NORMAL AGREGASYON

22 SEKRESYON BOZUKLUĞU 2 µm ADP İLE SEKONDER AGREGASYON İZLENMEMİŞTİR. 6 µm ADP İLE AGREGASYON İZLENMİŞTİR. Release Defects 2 ve 6 µm ADP İLE SEKONDER AGREGASYON İZLENMEMİŞTİR. Storege Pool Deficiency

23 RİSTOSETİNLE BOZUK AGREGASYON (VON WILLEBRAND HASTALIĞI BERNARD SOULIER SENDROMU) VWF eksikliğine bağlı olarak gelişen vwh hem primer hem de sekonder hemostaz bozukluğuna neden olur. Bernard Soulier Sendromunda trombosit sayısı düşük, trombositler iri (MPV yüksek) olur. Bernard Soulier: Flow sitometrik olarak cd42 (GP Ib/IX) özelliği saptanabilir.

24 BERNARD SOULIER ve vwh MIX TESTİ MİX HAZIRLAMA HASTA TROMBOSİT NORMAL PLAZMA VEYA KRİYOPRESİPİTAT HAZIRLANAN MIX PLAZMA RİSTESETİN REAKTİFİYLE ÇALIŞILIR RİSTOSEİNLE NORMAL AGREGASYON İZLENİRSE vwh RİSTOSETİNLE NORMAL AGREGAYON İZLENMEZ İSE BERNARD SOULIER DİR

25 PSEUDO vwh ve 2B vwh MIX TESTİ MİX HAZIRLAMA 1 2 NORMAL TROMBOSİT HASTA TROMBOSİT HASTA PLAZMA NORMAL PLAZMA DÜŞÜK DOZ (0,5 mg/ml) RİSTOSETİNLE AGREGASYON İZLENİR TİP 2B DÜŞÜK DOZ RİSTOSETİNLE AGREGASYON İZLENİR Reaktif eklenmeden Kriyoprespitat eklendiğinde de agregasyon izlenir. PSEUDO vwf

26 KOLLAJENLE UZAMIŞ LAG FAZI KOLLAJENLE 60 SANİYEDEN UZUN LAG FAZI KOLLAJENLE UZAMIŞ LAG FAZI TROMBOSİT FONKSİYON BOZUKLUĞUNU İŞARET EDER

27 GLANZMANN TROMBASTENİSİ GP IIb/IIIa eksik veya hatalıdır.bu hastalıkta antikoagülansız yapılan periferik yaymada trombositlerin küme yapmadığı ve dağınık durdukları gözlemlenir. Flow sitometride CD41 ve CD61 eksikliği saptanabilir. ADP ve EPİNEFRİN İLE AGREGASYON 2 6 µm ADP İLE AGREGASYON

28 GLANZMANN TROMBASTENİSİ RİSTOSETİN İLE KOLLAJEN İLE AGREGASYON AGREGASYON GP IIb / IIIa fibrinojen reseptörü eksikliğinde trombosit agregasyonu gerçekleşmez. Glanzman trombastenisi ristosetinle agregasyon gözlenenir ki aslında aglütinasyondur vwf köprüleri aracılığıyla trombositlerin yan yana gelmeleridir.

29 GLANZMANN TROMBASTENİSİ GP IIb/IIIa İNHİBİTÖR TESBİTİ MİX HAZIRLAMA HASTA KONTROL NORMAL TROMBOSİT NORMAL TROMBOSİT HASTA PLAZMA NORMAL PLAZMA MIX HAZIRLANIR 30 DAKİKA İNKÜBASYON HASTA VE KONTROL MIX TROMBİN VE/VEYA KOLLAJENLE ÖLÇÜM

30 GP IIb/IIIa İNHİBİTÖRÜ POZİTİF NORMAL TROMBOSİT+ NORMAL PLAZMA HASTA PLAZMA+ NORMAL TROMBOSİT

31 GP IIb/IIIa İNHİBİTÖRÜ POZİTİF

32 GP IIb/IIIa İNHİBİTÖRÜ NEGATİF HASTA PLAZMA+ NORMAL TROMBOSİT NORMAL TROMBOSİT+ NORMAL PLAZMA

33 YILLARI ARASINDA TOPLAM 617 HASTA ÇALIŞILMIŞTIR HASTA SAYISI YÜZDE (%) SEKRESYON BOZUKLUĞU ,3 VON WILLEBRAND HASTALIĞI GLANZMANN S THROMBASTHENIA 48 7,8 BERNARD SOULIER 7 1,1 NORMAL TOPLAM DISTRIBUTION OF PLATELET AGGREGATION TESTS RESULTS IN A REFERENCE LABORATORY 1Yahya Büyükaşık, 2Zelal Adıbelli, 1Nihan Erarslan, 1Nilgün Sayınalp, 1Ebru Koca, 1Deniz Çetiner, 1Salih Aksu, 1Hakan Göker, 1İbrahim C. Haznedaroğlu, 1Şerafettin Kirazlı, 1Osman I. Özcebe1 Hacettepe University, Department of Internal Medicine, Division of Hematology, 2 Hacettepe University, Department of Internal Medicine, Ankara, TURKEY

34 DENEYSEL HATAYA SEBEP OLAN NEDENLER TROMBOSİT SAYISI PRP >100 BİN OLMALI BU SEBEPTEN HASTA TROMBOSİT SAYISI >50 BİN OLMALI (TAM KAN SAYIMI VE PERİFERİK YAYMA) KAN ALIM KAN ANTİKOAGÜLAN OLARAK %3.2 - %3.8 LİK TRİSODYUM SİTRATLI (9 KISIM KAN + 1 KISIM SİTRAT) TÜPLERE ALINMALI, TÜP PLASTİK VEYA CAM TÜP İSE SİLİKONİZE OLMALI PIHTILI, AŞIRI LİPEMİK VEYA AŞIRI HEMOLİZLİ OLMAMALI LABORATUVARA ULAŞMA VE ÇALIŞMA ZAMANI TEST 30 DAKİKA İLE 3 SAAT İÇERİSİNDE ÇALIŞILMALI ALINAN KAN SOĞUK ORTAM İLE TEMAS ETMEMELİDİR. KAN ALINDIKTAN SONRA KAPAĞI AÇILMADAN ODA SICAKLIĞINDA ( C) BEKLETİLEBİLİR. HASTAYA BAĞLI SEBEPLER İLAÇ KULLANIMI

35 TROMBOSİTLERİ ETKİLEYEN İLAÇLAR ANTİBİYOTİKLER Penicillins, cephalosporins, nitrofurantion, miconazole THIENOPYRIDINES Ticlopidine, cloidogrel (P2Y12 inhibe eder) GP IIb/IIIa ANTOGONİSTLERİ Abciximab, tirofiban, eptifibatide PLATELET camp SEVİYESİNİ DEĞİŞTİREN İLAÇLAR Prostacyclin, iloprost, dipyridamole, Cilostazol ANTİKOAGÜLANLAR ve FİBRİNOLİTİK AJANLAR Heparin, streptolinase, tissue plasminogen activator,urokinase, e-aminocaproic acid KEMOTERAPÖTİK AJANLAR Mithramycin, daunorubicin, BCNU ÇEŞİTLİ İLAÇLAR Serotonin antagonists, antihistamines, radiographix contrast drugs, PSİKOTROPİK İLAÇLAR Imiprimine, amitriptyline, nortrypaline, chlorpromazine, flufenazine, trifluoperazine, haloperidol ANESTEZİK İLAÇLAR Dibucaine, tetracaine, metycaine, cyclaine, butacaine, nepercaine, procaine, cocaine, plaquenil, halothane KARDİYOVASKÜLER İLAÇLAR Nitroglycerin, isosorbide dinitrate, propranolol, nitroprusside, nifedipine, verapamil, diltiazem, quinidine

36 SUNUMA KATKILARIDAN DOLAYI PROF. DR. YAHYA BÜYÜKAŞIK HOCAMIZA TEŞEKÜRLERİMİ SUNUYORUM. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ HASTANELERİ İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI HEMATOLOJİ BİLİM DALI BİO. ÜMİT AKMAN