PRA class I, PRA class II Antikor titresi ne kadar önemli? Dr.Hüseyin Tutkak Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi İmmünoloji ve Allerji Hastalıkları BD.

CDC CROSSMATCH / BÖBREK NAKLİ Patel R., Terasaki P.I. : N.Engl. J. Med. 1969; 280: 735 Rejeksiyon ( 48h) Rejeksiyon yok Positive crossmatch 24 6 Negative crossmatch 8 187 %4,1 % 80 Pozitif crossmatch: Akut greft kaybı için yüksek risk (80%) Crossmatch pozitif ise transplantasyon yapılmaz. Bazı antikorlar (anti-hla dışındakiler) direkt donör lenfositlerine karşı olmakla birlikte klinik olarak ilişkisizdir. 2

CROSSMATCH / BÖBREK NAKLİ Negatif Crossmatch Nakil yapılabilir Pozitif Crossmatch Controindication 3

CROSSMATCH (1) 1969. Standard-, direct NIH-CDC. 1969. Uzamış inkübasyon T ve B CDC. 1970. Amos (3 yıkama) ve Amos-modifiye (1 wash) T ve B CDC: yıkamalar antikomplementer faktörleri elimine eder. 1972. AHG CDC T (Johnson A.H.): İnsan anti-globulin eklenmesi hem düşük titredeki ve hem de in vitro olarak komplemanı fikse etmeyen antikorların antikorların tanımlanmasını sağlar. 1984. AHG CDC B (Gebel H.M.): AHG, B hücrelerinin eksprese ettikleri yüzey immunoglobulinlerine bağlanabilir ve durumda kompleman aktive olur, YANLIŞ POZİTİF SONUÇ İki renkli immunfloresans teknikle, B hücreleri önce floresansla konjuge anti-immünglobulinle işaretlenir ve böylece AHG nin yüzey immünglobulinlerine bağlanmasına engel olunur. 4

CROSSMATCH (2) 1983. T ve B Flow crossmatch (FCXM) (Garavoy): alıcı serumu ile inkübasyondan sonra donör lenfositleri florokromla konjuge sekonder antikorla işaretlenir (anti-insan IgG veya IgM) Anti-CD3 ve anti-cd-19 ile işaretlemeyle anti-t ve anti-b antikorları ayrı ayrı tayin edilebilir. Antikor tipi tayin edilebilir (IgG, IgM). Antikor tayini kompleman aktivasyonundan bağımsızdır. CDC den 25-250 kez daha duyarlıdır. Antikor bağlanması yarı kantitatif olarak ölçülebilir. 5

ANTI-HLA ALLOANTİKORLARI PRA Transfüzyon, Gebelik, Daha önceden organ nakli yapılmış kişiler Anti-HLA antikorları oluşma riski vardır. Anti-HLA antikorlarının organ alıcısında transplantasyondan veya retransplantasyondan önce tayini ve tanımlanması önemlidir. 6

PRA CDC (Panel Reactive Antibodies) İyi tanımlanmış panel hücreleri hasta serumunda alloantikor reaktivitesi ve spesifikliğinin tayininde kullanılır PRA, pozitif hücrelerin oranıdır. 7

ANTI-HLA ANTIBODIES The official position of ASHI (approved on June 7th 2003) Pozitif crossmatch anti-hla IgG antikorları klinik olarak önemli olup spesifik olarak donör lenfositleriyle reaksiyon verir. Pozitif CDC crossmatch transplantasyon için en önemli engeldir. 8

ALLOANTİKORLARIN TANIMLANMASI 1976. Oto antikorlar (IgG veya IgM) nedeniyle oluşan crossmatch pozitifliğinin klinik olarak önemi yoktur; - serumun otolog lenfositlerle absorbsiyonu - serumun DTT ile absorbsiyonu 1999. Anti-HLA spesifikliğinin cell line dan izole edilmiş saflaştırılmış HLA antijenlerinin mikro boncuklara kaplanarak tanımlanması (Pei R.). 2001. Anti-HLA spesifikliğinin soluble HLA antijenlerinin katı faza fikse edilerek ELISA ile tayini (Zachary A.A.). 2003. Anti-HLA antikor spesifikliğinin tek antijenin mikro boncuklara bağlanarak Flow sitometrede saptanması (Pei R.): - Daha duyarlı - Yüksek PRA mevcudiyetinde anti-hla antikorlarının analizinin kolay yapılabilmesi 9

ANTİ-HLA ANTİKORLARININ TAYİNİNDE KULLANILAN YÖNTEMLER Non Antijen-spesifik CDC: % PRA Specificity (class I & II?) Antijen-spesifik ELISA: Neg/Pos % PRA (class I & II) Specificity (class I & II) Flow Sitometri (FlowPRA Beads): % PRA (class I & II) Specificity (class I & II) IgG ve IgM 10

ANTİ-HLA ANTİKORLARININ TAYİNİNDE KULLANILAN YÖNTEMLER /DUYARLILIK Analysis of HLA Presensitization (PRA) W.E. Herczyk 2003 Method Pozitif (n)/toplam(n) % CDC 12/66 18% ELISA 32/66 48% Flow 48/66 73% 11

Duyarlılığı ı sınırlı yöntemler ANTİKOR TİTRESİ ve AVİDİTE PATOJENİK ANTİKORLAR KLİNİK ÖNEM EȘİK DEĞERİ ANALİTİK TAYİN EȘİK DEĞERİ DOĞAL ANTİKORLAR 29.12.2011 BODRUM 12

Yüksek duyarlılıktaki yöntemler ANTİKOR TİTRESİ ve AVİDİTE PATOJENİK ANTİKORLAR KLİNİK ÖNEM EȘİK DEĞERİ ANALİTİK TAYİN EȘİK DEĞERİ DOĞAL ANTİKORLAR 29.12.2011 BODRUM 13

Antiallograft antibodies: relevance, detection, and monitoring. MaryL, ZacharyA Current Opinion in Organ Transplantation. 15(1):2-7, February 2010. Comparisons of antibody testing assays Yöntem Avantajı Yetersizliği Uygulamalar CDC Ucuz, deneyim Canlı hücre gerektirir, HLA için spesifik değil, duyarlılığı düşük Akış sitometresi Duyarlılığı CDC den fazla, farklı hücre tipini ve Ig sınıfı/ alt tipini ayırabilir Reaktif ve donanımları pahalı, HLA için spefik değil Donör alıcı crossmatch Donör alıcı crossmatch Solid faz immünassayler (SFA) GENEL Yüksek duyarlılık ve özgüllük, az serum gerektiri, canlı hücre gerektirmez Birçok serum faktöründen etkilenir Antikor tayini ve izlenmesi, SFA-pool antijenler SFA fenotip panel SFA Single antijen En ucuz SFA Spesifikliği yok Antikor tayini ve izlenmesi, Crossmatch ile iyi korelasyon Mevcut bütün antikorları saptar, Cw, DQ ve DP ye karșı antikorları tayin edebilir, epitop veya allel spesifik antikorları tanımlayabilir Bazı antikorlar diğerleri tarafından maskelenebilir, Cw, DQ ve DP ye karşı antikorların tayininde yetersiz Tek boncukla temsil edilen antijen, değișik miktardaki antijen ve bozulmuș molekülleri kaçırılabilir, multipl antikorların toplam düzeyini vermeyebilir birçok ve Antikor spesifikliği tayin edilebilir, izlemde ve kabul edilemez antijenlerin tayininde Donör spesifik antikorların mevcut olup olmadığı 14 2010 Lippincott Williams & Wilkins, Inc. Published by Lippincott Williams & Wilkins, Inc. 2

Alloantikorlar Donör - spesifiksifik antikorlar (DSA) Anti-HLA Anti-endothelial cell antikorlar Anti-human MHC Class I chain-related genes (MICA,B) Doku spesifik antijenlere karșı antikorlar ABO isoagglutinins Non donör - spesifiksifik antikorlar Anti-HLA antikorlar Anti-MICA antikorları 15

Alloantikorlar: Hasar mekanizmaları Alloantibody-induced acute injury of the graft Lytic activation of the C : Endothelial cell injury Endothelial cell lysis Activation of platelets and the clotting system Enhancement of inflammation by recruitment of neutrophils monocytes, T and B-cells Alloantibody-induced chronic injury Sub-lytic activation of C : Activation of endothelium, platelets and Monocytes Endothelial cell apoptosis Production of pro-fibrotic growth factors: Basic fibroblast growth factor Platelet-derived growth factor Thrombospodin-1 16

Antibodies against MICA Antigens and Kidney-Transplant Rejection Yizhou Zou, M.D., Peter Stastny, M.D., Caner Süsal, M.D., Bernd Döhler, Ph.D., and Gerhard Opelz, M.D. N Engl J Med, 2007, 357;13;1293-1300 17

PRE-TX Anti-HLA Antikor First transplants I POZİTİF, II Neg I Neg, II Pozitif I Neg, II Neg I Pozitif, II Pozitif 18

PRE-TX Anti-HLA Antikor Retransplants I Neg, II Neg I Neg, II Pozitif I Pozitif, II Neg I Pozitif, II Pozitif 19

CollaborativeTransplant Study, Opelz 20

CollaborativeTransplant Study, Opelz 21

PRA> %50 PRA %50 CollaborativeTransplant Study, Opelz 22

Percent Graft Survival 100 90 80 70 60 50 P<0.0001 13 th workshop 0 1 2 3 4 Years after Testing HLA antikoru yok (806) Overall (964) HLA Antikoru (158) 23

Screening for De Novo Anti-Human Leukocyte Antigen Antibodies in Nonsensitized Kidney Transplant Recipients Does Not Predict Acute Rejection Gill, John S. 1,7 ; Landsberg, David 1 ; Johnston, Olwyn 2 ; Shapiro, R Jean 2 ; Magil, Alex B. 3 ; Wu, Vivian 4 ; Tinckam, Kathryn 5,6 ; Keown, Paul 1,4 Transplantation Issue: Volume 89(2), 27 January 2010, pp 178-184 184 YON OLASILIĞI AKUT REJEKSİYON OLASILI 24

Virtual crossmatch protokolü Bingaman WA et all, Transplantation 2008, 86;1864-1868 Sensitize Hasta HLA; HLA-B*4402 Antikor HLA-B*4403 Donör HLA-B*4403 ise kabul edilemez UNOS a bu bilgi HLA-B*44 olarak girilebiliyor!!! HLA ve Antikorlar için yeni yazılım ihtiyaçı 25

Updates from the 2009 Banff Conference on Allografts and Future Directions Banu Sis, MD, FRCPC Dept of Laboratory Medicine and Pathology Alberta Transplant Applied Genomics Centre University of Alberta, Edmonton, AB Alberta Transplant Lecture Series 21 October 2009

Banff 2009 Conference on Allograft Pathology Banff, AB from August 9 to 14, 2009 263 attendees (transplant clinicians, pathologists, surgeons, immunologists, researchers) from 30 countries Discussed several aspects of solid organ transplants: Alloantibody responses Endothelial cells in rejection Genomics/proteomics approaches Non-invasive markers of rejection Updates on kidney, heart, pancreas, liver, and composite tissue allograft pathology Banu Sis, MD, FRCPC-2009 27

Accepted Organ Specific Criteria for Antibody Mediated Graft Rejection Kidney Heart Pancreas Lung Liver Bowel Hyperacute rejection + + + + + Acute humoral rejection + + + Chronic humoral rejection + Accommodation + + Lots of blanks! Banu Sis, MD, FRCPC-2009 28

Antibody Detection & Monitoring - A. Zachary Solid Phase testlerinin duyarlılığı, hücre temelli testlere göre (CDC) daha yüksek Ancak serumdaki birçok bileșen etkileyebilir Bu nedenle standartizasyonun dikkatli bir șekilde yapılmalı ve tayinlerin klinik olarak önemli eșik değerleri önemli Crossmatch tests Cytotoxicity Flow cytometry Antibody screening tests (solid phase assays) Platforms Traditional ELISA Beads: flow cytometer, Luminex fluoroanalyzer DynaChip 29

Kidney Allograft Survival 13 th, 14 th, 15 th Workshops 100 No HLA Antibody (4757) Percent Graft Survival 90 80 70 60 50 All HLA Antibodies are De novo HLA Antibody (1087) 0 1 2 3 4 Years after Testing Log-rank p<0.0001 92% 76% Banu Sis, MD, FRCPC-2009 30

Percent Graft Survival 100 90 80 70 60 50 DSA are most detrimental KIDNEY: ALL Workshops All HLA Antibodies are De novo No Antibody (1096) DSA (57) Non-DSA Antibody (145) Log-rank p=0.0037 0 1 2 3 4 Years after Testing Banu Sis, MD, FRCPC-2009 31

Heart Allograft Survival: ALL WS Percent Graft Survival 100 90 80 70 60 50 All HLA Antibodies are De novo No HLA Antibody (287) HLA Antibody (141) Log-rank p=0.0036 Years after Testing Banu Sis, MD, FRCPC-2009 32

Lung Allograft Survival : All WS 100 Percent Graft Survival 90 80 70 60 50 40 No HLA Antibody (99) HLA Antibody (32) All HLA Antibodies are De novo Log-rank p=0.0302 0 1 2 Dr.H.TUTKAK 2.TİGED 3 KONGRESİ- 4 Years after Testing BODRUM Banu Sis, MD, FRCPC-2009 29.12.2011 33

Liver Allograft Survival: ALL WS 100 No HLA Antibody (269) Percent Graft Survival 90 80 70 60 50 HLA Antibody (65) All HLA Antibodies are De novo Log-rank p=ns (0.1282) 0 1 2 3 4 Years after Testing Banu Sis, MD, FRCPC-2009 34

ALLOGRAFT SURVIVAL Organ 1 Year 5 Years 10 Years Kadavra - Böbrek 91% 68% 42% Canlı Donör- Böbrek 95% 79% 54% Karaciğer 83% 67% 52% Kalp 87% 72% 49% Akciğer 84% 48% 19% Transplants performed between 1995-2004; OPTN/SRTR Annual Report 2006 35

DÜŞÜK TİTRELİ VE / VEYA NONCOMPLEMENT- FIXING ANTİKORLAR (CDC-, FCXM+) TARTIŞILAN KONU Bu antikorlar klinik olarak kabul edilemez riskli mi? Veya bu antikorlar otomatik olarak antikor aracılıklı hiperakut rejeksiyona neden mi oluyor? Bu antikorun tesbit edilmesi alıcıya organ nakli kararını değiştirmeli mi? 36

DÜŞÜK TİTRELİ VE / VEYA NONCOMPLEMENT- FIXING ANTİKORLAR (CDC-, FCXM+) Incidence : - First transplants 15% - Re-transplants 34% Early Graft Loss (< 3 months): FCXM + FCXM - First transplants 20% 5% Re-transplants 60% 15% (HM Gebel et al. Am J of Transplant 2003; 3: 1488) 37

DÜŞÜK TİTRELİ VE / VEYA NONCOMPLEMENT- FIXING ANTİKORLAR (CDC-, FCXM+) SONUÇ Önemli klinik sonuçları olabilen düşük titreli ve/veya noncomplement-fixing anti-hla antikorları sadece akış sitometresi gibi duyarlı yöntemlerle tayin edilebilirler Bu antikorlar önemli bir risk faktörü olarak görünmekteler 38

SADECE B HÜCRE POZİTİF CROSSMATCH KLİNİK ÖNEMİ? B hücre CDC pozitif crossmatch Oto-crossmatch Serumu CDC den daha duyarlı olan akış sitometresi veya ELISA gibi solid faz assayler 39

T HÜCRE CURRENT NEGATIVE HISTORIC POSITIVE (CNHP) POZİTİF Hastanın immünolojik geçmiş öyküsünün izlenmesi Her 3 ayda bir (EFI) veya her ayda bir (ASHI) PRA testi. 40

T HÜCRE CURRENT NEGATIVE HISTORIC POSITIVE (CNHP) POZİTİF YORUM: 1970: Eskiye yönelik olarak bir kez pozitiflik tesbit edilmiş ise Tx için kontraendike olarak kabul edilirdi. 1982 (Cardella): CNHP (pozitif) ve CNHN (negatif) alıcılarda bir yıllık graft survival farkı yok. Birçok merkez sensitize hastalarına crossmatch testini current serum örneğini kullanarak yapıyor (Son durum?). 41

THE CLINICAL SIGNIFICANCE OF CURRENT NEGATIVE HISTORIC POSITIVE (CNHP) CDC CROSSMATCH FOR T-CELLS (III) (HM Gebel et al. Am J Transplant 2003; 3: 1488) 42

T HÜCRE CURRENT NEGATIVE HISTORIC POSITIVE (CNHP) POZİTİF Bu alıcılara nakil yapıldığında ilk 3 ayda antikor aracılıklı rejeksiyon sıklığı fazla Bununla birlikte bu alıcıların büyük bölümüne başarılı nakiller yapılabiliyor SONUÇ Yayınlanmış veriler geçmişinde pozitif crossmatch tesbit edilen alıcılara nakil yapılabildiğini ve kesin risk faktörü olarak görülemeyeceğini gösteriyor. 43

CROSSMATCH TEMELİNDE ANTİKOR ARACILIKLI RED VEYA ERKEN GRAFT KAYBININ DEĞERLENDİRİLMESİ Donör reaktif, HLA spesifik IgG antikoru, nakil öncesi crossmath POZİTİF ise RİSK YÜKSEK, geçmișinde pozitiflik saptanmıș ise orta derecede riskli (HM Gebel et al. Am J Transplant 2003; 3: 1488) 44

ANTIBODY-MEDIATED REJECTION (AMR) Consensus Opinion from the Antibody Working Group (Transplantation 2004; 78: 181) AMR = Antibody mediated rejection, Hyperacute AMR : high titer of DSA; alteration of graft function and, nearly always, graft loss within 24 hours post-transplant due to pre-formed DSA. Accelerated AMR: low titer of DSA; rejection occurs after 24 hours; no response to standard therapy. Acute AMR: de novo production of DSA or post-desensitization restart of DSA production; rejection from 1 week to 3-6 months post-transplant; no response to standard therapy. Late or chronic AMR: de novo production of DSA; usually 1 year posttransplant; few symptoms but progressive; poor or no response to standard therapy. 45

7 6 5 4 3 2 1 0 THE TYPE OF HLA-A EPITOPES INVOLVED IN THE PRODUCTION OF DS-Abs (I) 62-G/Q 65-R 66-N 67-V 70-H/Q 74-D 76-A 77-N 79-G 80-T 81-A 82-L 83-R 90-D 95-I 97-M 105-S 114-Q/R 116-D 127-K 142-T 144-K 145-H 151-H 166-D 167-G 193-A 194-V 207-S 246-S 253-Q 276-P 294-F 298-I 299-A/T 334-M 32 different epitopes (with a total of 76 amino-acid residues) Highest frequency: 127-K (Lys)=9,2%; 116-D (Asp)=7,9%; 62-G (Gly)/Q (Gln)=6,6% 46

THE TYPE OF HLA-A EPITOPES INVOLVED IN THE PRODUCTION OF DS-Abs (II) 47

THE TYPE OF HLA-B EPITOPES INVOLVED IN THE PRODUCTION OF DS-Abs (I) 8 7 6 5 4 3 2 1 0 9-H 11-A 12-M 45-T 67-Y 77-N/S 80-I/N 16 different epitopes (with a total of 45 amino-acid residues) 81-A 82-L Highest frequency: 77-N (Asn)/S (Ser)=17,8%; 81-A (Ala)=13,3%; 80-I (Ile)/N (Asn)=11,1%; 82-L (Leu)=11,1%; 83-R (Arg)=11,1%; 163-E (Glu)/L (Leu)/T (Thr)=11,1% 83-R 113-H 131-S 152-E 156-D 48 163-E/L/T 194-I 305-T

THE TYPE OF HLA-B EPITOPES INVOLVED IN THE PRODUCTION OF DS-Abs (II) 49

CLINICAL RELEVANCE OF ANTI-HLA ANTIBODIES DEVELOPED AFTER KIDNEY TRANSPLANTATION A. Piazza, E. Poggi, L. Borrelli, G. Ozzella, P.I. Monaco, D. Settesoldi, D. Fraboni, S. Scornajenghi, C. Cortini, A. Iacona, C.U. Casciani, D. Adorno 9 Congresso Nazionale AIBT, Pesaro 19-21 Settembre 2002 Anti-DSA Analysis using FlowPRA 60,0% 51,4% 40,0% 27,0% 21,6% 20,0% Preliminary data in: 0,0% anti-hla class I & II anti-hla class II anti-hla class I A. PIAZZA, et all. Impact of donor-specific antibodies on chronic rejection occurrence and graft loss in renal transplantation. Transplantation 2001; 71: 1106-1112. B. A. PIAZZA, et all. Relevance of post-transplant HLA class I and class II antibodies on renal graft outcome. Transplant Proc 33(1-2): 478-480, 2001 50

DSA /TRANSPLANTASYON 60% 51,3% 30,8% 40% P = 0,0001 20% 0% 12,8% Acute Rejection P = 0,0001 6,0% Graft Loss Anti-DS Positive Patients Anti-DS Negative Patients 51

PREDICTING KIDNEY GRAFT FAILURE BY HLA ANTIBODIES: A PROSPECTIVE TRIAL Paul I. Terasaki and Miyuki Ozawa Am J Transplant 2004; 4: 438 Post tx with antibody Post tx, no antibody 52

Virtual crossmatch protokolü Bingaman WA et all, Transplantation 2008, 86;1864-1868 -Saptanan antikor MFI değeri 2000 nin üzerinde ise, bu HLA antijenli donör kabul edilmez -Antikor MFI değeri 1000-2000 arasında ise zayıf pozitif crossmatch gibi ișlem görebilir, hastaya duyarlı olarak yaklașım Antikor MFI değeri 1000 nin altında olan HLA antijenleri kabul edilebilir. 53

Flow crossmatch/virtual cross match Muhtemel Açıklama FC-XM pozitif Virtual XM negatif FC-XM yanlıș pozitif Virtual XM yanlıș negatif Klinik olarak önemsiz antikorların hücre yüzeyine bağlanması Donör HLA sı eksik saptanmıș HLA alleli tek antijen flow bead panelinde yok FC-XM negatif Virtual XM pozitif FC-XM yanlıș negatif FC-XM tek antijen flow bead den daha az duyarlı Virtual XM yanlıș pozitif Amico P et all, Curr Opin Organ Transplant,2009, 14:656-661 İn vivo olarak HLA molekülünde mevcut olmayan tek antijen flow bead de denatüre epitoplara karșı antikorlar 54

Yanlıș negatif virtual crossmatch Donör spesifik non HLA antikorları - Endotelyal hücre antikorları - MHC class I chain related gene A - Glutatyon S-Transferaz T1 - Anjiotensin-reseptör antikorları H-Y Yanlıș negatiflik donör HLA antijenin eksik tayini (HLA-C, HLA-DP) HLA alleli tek antijen flow bead panelinde yok İn vivo olarak HLA molekülünde mevcut olmayan, tek antijen flow bead de denatüre epitoplara karșı antikorlar IgM antikorları? Amico P et all, Curr Opin Organ Transplant,2009, 14:656-661 55

Yanlıș pozitif virtual crossmatch Tek antijen kaplı boncukta teknik nedenlerle olabilen pozitiflik. HLA molekülleri hazırlama esnasında denatüre olabilir ve ürünleri HLA molekülünde in vivo olarak mevcut olmayan yeni epitoplar olarak reaksiyon verebilir. Tek antijen kaplı boncukla gerçekten HLA-DSA tesbit edilebilir, fakat sınırlı klinik önemi olabilir. Bu nedenle majör karekterisrik klinik olarak önemli HLA-DSA lar tayin edilmelidir. Bu konuyla ilgili çalıșmalar devam etmektedir. Amico P et all, Curr Opin Organ Transplant,2009, 14:656-661 56

DSA / Antikor aracılıklı rejeksiyon Donör spesifik antikor düzeyleri rejeksiyonun ne kadar hızlı olabileceğini belirler. 29.12.2011 BODRUM 57

Alloantikorlar Gerek önceden mevcut gerekse de novo alloantikorlar mevcut ise, hiperakut, akut ve kronik rejeksiyon gelișebilir. Nakil sonrası antikor takibi Alıcının humoral yanıtını izlemek İmmünsüppresif tedavinin optimizasyonu 29.12.2011 BODRUM 58

Teșekkürlerimle Semahat Akbay Dilek Aslan Mustafa Özdemir Füsun Alpan Berat Șahinbaș Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi İmmünoloji Laboratuvarı 29.12.2011 Romatoloji Kongresi - Dr.H.Tutkak