ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Ayşe KÜSTÜ ALLOGENEİK PERİFERİK KÖK HÜCRE TRANSPLANTASYONUNDA VERİCİLERE (DONÖR) EŞİT DOZDA UYGULANAN İKİ FARKLI REKOMBİNANT BÜYÜME FAKTÖRÜNÜN (rhug-csf) KARŞILAŞTIRMALI ÇALIŞMASI BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2008

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ALLOGENEİK PERİFERİK KÖK HÜCRE TRANSPLANTASYONUNDA VERİCİLERE (DONÖR) EŞİT DOZDA UYGULANAN İKİ FARKLI REKOMBİNANT BÜYÜME FAKTÖRÜNÜN (rhug-csf) KARŞILAŞTIRMALI ÇALIŞMASI Ayşe KÜSTÜ YÜKSEK LİSANS BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez.../.../... Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza... İmza...... İmza.... Prof.Dr İskender EMRE Prof.Dr. Seyhan TÜKEL Doç.Dr.Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No : Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ ALLOGENEİK PERİFERİK KÖK HÜCRE TRANSPLANTASYONUNDA VERİCİLERE (DONÖR) EŞİT DOZDA UYGULANAN İKİ FARKLI REKOMBİNANT BÜYÜME FAKTÖRÜNÜN (rhug-csf) KARŞILAŞTIRMALI ÇALIŞMASI Ayşe KÜSTÜ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. İskender EMRE Yıl : 2008 Sayfa : 47 Jüri : Prof. Dr. İskender EMRE Prof.Dr. Seyhan TÜKEL Doç.Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Bu çalışmada; allojeneik periferik kök hücre transplantasyonu amacıyla iki farklı rekombinant büyüme faktörü ile mobilize edilmiş toplam 16 (filgrastim;11, lenograstim; 5) donöre uygulanan 29 seans kök hücre aferezi işlemi, mobilizasyon ilişkili yan etkiler ve mobilizasyona etkili faktörler açısından değerlendirildi. Her iki grupta da, gerek mobilizasyonun 4. gününde gerekse 5. gününde periferik kan ve elde edilen kök hücre ürününde, beyaz küre (p>0,05) ve CD34 + kök hücre sayısının (p>0,05) eşit olduğu hesaplandı. Yaş, cinsiyet ve kilonun mobilizasyona olan etkisi istatistiksel olarak anlamlı değildi. Hem lenograstim hem de filgrastimin ciddi komplikasyonlara neden olmadığı, yan etkiler açısından önemsiz farklılıklar gösterdiği, ayrıca; maliyet açısından eşit oldukları bulundu. Anahtar Kelimeler: Allojeneik Periferik Kök Hücre Transplantasyonu (AKHT), mobilizasyon teknikleri, rekombinant büyüme faktörleri (rhug-csf), granülosit koloni uyarıcı faktörler (G-CSF). I

ABSTRACT MSc THESIS COMPARISON OF EFFICIENCY BIOEQUIVALENT DOSES OF TWO DİFFERENT RECOMBİNANT HUMAN GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTORS (rhug-csf) IN STEM CELL MOBILISATION FROM HEALTHY DONORS IN ALLOGENEIC BLOOD STEM CELL TRANSPLANTATION Ayse KUSTU DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENSES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Iskender EMRE Year : 2008 Pages : 47 Juri : Prof. Dr. Iskender EMRE Prof.Dr. Seyhan TUKEL Doç.Dr. Hatıce KORKMAZ GUVENMEZ In this study, 29 stem cell apheresis procedures performed on a total of 16 donors mobilized with two different recombinant human granulocyte colony stimulating factors (filgrastim; 11, lenograstim; 5) for the purpose of allogeneic peripheral blood stem cell transplantation were evaluated with regard to complications related to growth factors and of factors that influence mobilization processes. On both of the 2 groups, it has been observed that the quantity of white blood cell (p>0,05) and CD34 + cells in peripheral blood and stem cell product are the same on the 4 th and 5 th days of the mobilization. There was no statistical difference in the effect of age, gender and weight on mobilization process. In this study, it has been shown that lenograstim and filgrastim do not cause serious complications and have inconsiderable differences in terms of side effects. Not to mention that both of the growth factors have the equivalent cost. Key Words: Allogeneic Stem Cell Transplantation (ASCT), Mobilization techniques, Recombinant Growth Factors, Granulocyte Colony- Stimulating Factors (G-CSF) II

TEŞEKKÜR Tezimin her basamağında bilgisi ve tecrübesinden yararlanmamı sağlayan, desteğini ve yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen danışman hocam, Sayın Prof. Dr. İskender EMRE ye, ayrıca sayın hocalarım Prof. Dr. Atila TANYELİ ve Doç. Dr. Birol GÜVENÇ e sonsuz saygılarımı sunarım. Tez yazımım sırasında yardımlarını esirgemeyen ve görüşlerini bildirerek gelişimime katkıda bulunan, ayrıca; hasta / yakınlarına olan özel ilgi ve alakalarından dolayı, Bio. Ferda TEKİNTURHAN ve Dr. Fatih ERBEY e teşekkür eder, şükranlarımı iletirim. Aferez işlemlerinin başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesinde emeği geçen Aferez Ünitesi çalışanlarına, hasta ve donörün bakımını yapan tüm Pediatrik KİT Ünitesi hemşire ve personellerine, Yardımlarını ve manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen değerli arkadaşlarıma, Sadece çalışma süresince değil, hayatımın her anında bana verdikleri destek ve güvenle kendimi iyi hissetmemi sağlayan, annem Hatice KÜSTÜ ve kardeşlerime, Ayrıca; çalışkanlığını ve sabrını her zaman örnek aldığım, sevgisi ve desteği ile bu günlere gelmemi sağlayan, rahmetli babam A. Kenan KÜSTÜ ye sonsuz sevgi ve teşekkürlerimi sunarım. III

İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VI ŞEKİLLER DİZİNİ... VII FORMÜLLER DİZİNİ. SİMGELER VE KISALTMALAR.. VII IX 1.GİRİŞ... 1 1.1. Kök Hücrenin Tanımı... 1 1.2. Kök Hücre Tipleri... 1 1.2.1. Embriyonik Kök Hücreler (EKH)... 1 1.2.2. Erişkin Tip Kök Hücreler... 2 1.3 Hematopoez... 3 1.3.1. Hematopoezin Kontrolü... 6 1.3.1.1. Sitokinler... 7 1.3.1.2. Hematopoietik Büyüme Faktörleri... 7 1.3.1.2.(1). G-CSF (Granulocyte-Colony Stimulating Factor)... 8 1.4. Hematopoietik Kök Hücre Transplantasyonu (HKHT)... 9 1.4.1. Tarihçesi... 9 1.4.2. Tanımı... 10 1.4.3. Tipleri 11 1.4.3.1. Otolog Kök Hücre Transplantasyonu... 11 1.4.3.2. Allojeneik Kök Hücre Transplantasyonu. 12 1.4.4. Mobilizasyon Teknikleri... 12 1.4.4.1. Rekombinant Hematopoietik Büyüme Faktörleri 13 1.4.4.1.(1). Lenograstim (Glikolize - rhug-csf) 13 1.4.4.1.(2). Filgrastim (non-glikolize-rhug-csf).. 14 1.4.5. Kök Hücre Toplanması. 14 IV

1.4.5.1. Toplama Zamanı... 16 1.4.5.2. Toplanacak Ürün Miktarı... 16 1.4.6. Yan Etkiler.... 17 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR... 18 3. MATERYAL VE METOD... 20 3.1. Materyal... 20 3.1.1. Filgrastim (non-glikolize-rhug-csf). 20 3.1.2. Lenograstim (Glikolize rhug-csf). 20 3.1.3. Donör Karakteri.... 21 3.2. Metod. 22 3.2.1. Mobilizasyon. 22 3.2.2. Kök Hücre Toplanması. 23 3.2.3. Kalite-Kontrol... 25 3.2.3.1. TMNH Sayısının Hesaplanması 25 3.2.3.2. CD34 + Hücre Miktarının Hesaplanması... 26 3.2.4. Kök Hücre İnfüzyonu 26 3.2.5. Analiz 27 4. BULGULAR VE TARTIŞMA... 28 4.1. Bulgular... 28 4.2. Tartışma... 35 4.3. Sonuçlar ve Öneriler 40 KAYNAKLAR... 41 ÖZGEÇMİŞ... 47 V

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 1.1. HKHT Endikasyon Kategorisi...11 Çizelge 3.1 Filgrastim Ürün İçeriği...20 Çizelge 3.2 Lenograstim Ürün İçeriği...21 Çizelge 4.1 Donör Karakterleri ve İşlem Bilgileri...28 Çizelge 4.2. İkinci Gün Kök Hücre Ürün Değerleri......31 Çizelge 4.3. Yaş Dağılımına Göre Periferik Kan Sonuçları...33 Çizelge 4.4. Cinsiyet Dağılımına Göre Periferik Kan Sonuçları...33 VI

ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. Hematopoietik Kök Hücre Farklılaşması.5 Şekil 1.2. Kök ve Progenitör Hücrelere Etkili Sitokinler; Lokal ve Humoral Faktorlerin Etkinlikleri...6 Şekil 1.3. İnsan G-CSF inin Moleküler Yapısı....8 Şekil 4.1. Kök Hücre Aferezinin I. Gününde Periferik Kan Değerleri.. 29 Şekil 4.2. I. Gün Kök Hücre Ürün Değerleri..31 Şekil 4.3. Filgrastim ve Lenograstim Grubunda I. ve II. Gün Ürün Değerleri..32 Şekil 4.4. Mobilizasyona Bağlı Karşılaşılan Yan Etkiler ve Görülme Sıklıkları...34 VII

FORMÜLLER DİZİNİ SAYFA Formül 3.1. Periferik Kandaki TMNH Sayısının Hesaplanması... 23 Formül 3.2. Periferik Kandaki CD34 + Kök Hücre Sayısının Hesaplanması 24 Formül 3.3. TMNH (10 8 / Kg) Sayısının Hesaplanması...26 Formül 3.4. CD34 + Kök Hücre (10 6 /Kg) Miktarının Hesaplanması.26 VIII

SİMGELER ve KISALTMALAR AA ACD-A AKHT ALL APKHT BK CD CFU CHO Cys DNA EKH EPO ETKH G-CSF GM-CSF GVHH HBF Hct HKH HKHT HLA HPH ICM IL İCa KİT LT-CIC : aplastik anemi : asit sitrat dekstroz formül A : allojeneik kök hücre transplantasyonu : akut lenfoblastik lösemi : allojeneik periferik kök hücre transplantasyonu : beyaz küre sayısı : cluster designation : colony forming unit (koloni oluşturan ünite) : chinese hamster ovary : sistein aminoasiti : deoksiribonükleik asit : embriyonik kök hücre : eritropoietin : erişkin tip kök hücre : granlocyte colony stimulating factor (granulosit koloni uyarıcı faktör) : granulocyte macrophage colony stimulating factor (granulositmakrofaj koloni uyarıcı faktör) : graft versus host hastalığı : hematopoietik büyüme faktörü : hematokrit (kırmızı kan yüzdesi) : hematopoietik kök hücre : hematopoietik kök hücre transplantasyonu : human leucocyte antigen (insan lökosit antijeni) : hematopoietik progenitör hücre : ınner cell mass (iç hücre tabakası) : interlökin : iyonize kalsiyum : kemik iliği transplantasyonu : long term culture initiating cell (uzun zamanlı kültür başlatıcı hücre) IX

M-CSF :megacaryocyte colony stimulating factor (megakaryosit koloni uyarıcı faktör) MEPH : multipotent erişkin progenitör hücre MKH : mezenkimal kök hücre MNH : mononükleer hücre sayısı MNS : mutlak nötrofil sayısı NHL : non-hodgin lenfoma OKHT : otolog kök hücre transplantasyonu OPKHT : otolog periferik kök hücre transplantasyonu PKHT : periferik kök hücre transplantasyonu rhug-csf :recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rekombinant insan granulosit koloni uyarıcı faktör) SCF : stem cell factor (kök hücre faktörü) Thr : treonin aminoasiti TKH : toplam kan hacmi TM : talasemi major TMNH : toplam mononükleer hücre sayısı TPO : trombopoietin X

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ 1. GİRİŞ 1.1 Kök Hücrenin Tanımı Canlılarda kendini yenileyebilme, farklılaşabilme kabiliyeti bulunan hücrelere kök hücre denir. Bu hücrelerin; dokuya has özellikleri yoktur, spesifik değillerdir ve uygun bir sinyalle karşılaşmadıkları sürece farklılaşmazlar. Kök hücreler; Uygun bir çevreye yerleşme, Çoğalma, Kendini yenileme ve idame ettirme, Hasarlanmış dokuyu yeniden oluşturma özelliklerine sahiptir. 1.2 Kök Hücre Tipleri Kök hücreler başlıca Embriyonik Kök Hücre (EKH) ve Erişkin Tip Kök Hücre (ETKH) olarak iki gruba ayrılırken, farklılaşma kapasitelerine göre de üç sınıf altında toplanırlar. Bunlar; Totipotent Kök Hücre; vücuttaki tüm hücrelere dönüşebilecek potansiyele sahip, ilk embriyonel hücredir. Erken embriyonel dönemde 4 hücreden 8 hücreye kadar olan blastomerleri içerir, Pluripotent Kök Hücre; tüm germ dizisine (endoderm-ektoderm-mezoderm) ait dokuları oluşturabilme kapasitesinde olan hücrelerdir. Multipotent Kök Hücre; daha sınırlı farklılaşma kapasitesine sahip hücrelerdir. 1.2.1 Embriyonik Kök Hücreler Blastokistin (1 haftalık embriyo) Inner Cell Mass (ICM) olarak adlandırılan iç hücre tabakasından elde edilerek kültür ortamında üretilen hücrelerdir. Ancak, kültür ortamında embriyonun normal gelişimindeki gibi hareket etmezler. Pluripotent özellikte olan bu hücreler; ektoderm, endoderm ve mezodermden oluşan yaklaşık 1

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ 250 çeşit hücreyi oluşturabilirler. Farklılaşma ve kendini yenileme kapasitesine sahiptirler. Kültür ortamlarında, farklılaşmadan 1-2 yıl üremelerini sürdürebilirler (Herzog ve ark., 2003). 1.2.2 Erişkin Tip Kök Hücreler Erişkinde farklılaşmış bir dokuda bulunan farklılaşmamış hücre grubudur. Kendilerini yenileme potansiyeli olan bu hücreler, kaynaklandıkları dokunun özelleşmiş hücre tiplerini oluşturdukları gibi başka dokuların da hücrelerine dönüşebilirler. Çizgili kas, beyin, karaciğer ve kemik iliği gibi birçok dokuda bulunmaktadır. ETKH nin en iyi tanımlanmış örneği Hematopoietik Kök Hücrelerdir (HKH). Oldukça heterojen bir grup olarak kabul edilen HKH ler; kemik iliğinden, umbilikal kord kanından ve büyüme faktörleri ile mobilize edilmiş periferik kandan izole edilebilirler. Bu hücreler, ın-vivo engraft olabilme (yamalanma) özelliğine sahiptir. Multipotent özellik taşıyan HKH ler, kemik iliğinde 1 / 10 15 bin, periferik kanda 1 / 10 5 oranında bulunurlar. En önemli özellikleri; Lineage belirteçlerinin olmaması (Lin - ) ve hücre yüzey antijeni olarak CD34 +, CD38 - ve CD33 - olmalarıdır. Hematopoietik potansiyelli kök hücrelerin saflaştırılmasında kullanılan diğer önemli belirteçler VEGFR-2, CD90, CD117, CD164, CXC-Kemokin Reseptör 4, p- glikoprotein, Sca-1, AA4, CD133 ve CD45 dir. Ayrıca, HLA-DR (Human Leukocyte Antigen) ekspresyonu zayıf (+) veya negatiftir (Watt, 2003). HKH ler, progressif olarak, daha olgunlaşmış hematopoietik progenitör hücreleri (HPH) oluştururlar. Kök hücreler, genellikle hücre siklusunun G 0 (dinlenme) fazında bulunurken, progenitörler siklusa girmiş, proliferasyon ve diferansiyasyon kapasiteleri daha sınırlı hücrelerdir. Lineage dizileri belirlenmiş (Lin + ) bu hücreler, sınırlı sayıda sitokinlere yanıt verirler. HPH nin matürasyonu ile olgun kan ve immün sistem hücreleri ve endotel hücreleri meydana gelir. Bu hücreler morfolojik olarak normal görünümlü lenfositlere benzerler ve onlardan ayırt edilemezler (Quesenberry ve Colvin, 2001). 2

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ Hematopoietik organlardan elde edilen HKH ler; kemik, kıkırdak, nöral hücreler, pnömositler, kas, deri, endotel, epitel hücreleri ve hepatositler gibi hücreleri oluşturma kapasitesine sahiptirler (Lakshmipathy ve Verfaillie, 2005). HKH lerin yanında, hematopoietik organlarda farklı progenitör/kök hücre tipleri de bulunur ve Mezenkimal Kök Hücreler (MKH), Multipotent Erişkin Progenitör Hücresi (MEPH) ile Hemanjioblast olarak sınıflandırılır. MKH ler; kemik iliği kökenli hücrelerdir. Osteoblastik, adipositik ve kondrositik seriye farklılaşabilirler. İnsanda HLA-A,B,C ekspresyonu gösterirken HLA-DR ekspresyonu göstermezler, bu nedenle hipo-immünojenik veya non-immünojenik olarak nitelendirilirler. Doku mühendisliğinde kemik, kıkırdak, kemik iliği stroması, kas, yağ ve tendon rejenerasyonunda, gen tedavisinde, vasküler destek ve nöronal çevre temininde önemlidirler. MEPH; besin desteği fakir kültür ortamında çok yavaş büyüme gösterir. MHC- Klas1 antijeni içermezler, aktif telomerlerini korudukları için yaşlılık işareti göstermeden çoğalırlar. Osteoblast, kondroblast, adipoblast, iskelet, miyoendotel seri ve hepatosite farklılaşırlar. Hemanjioblastlar; hematopoezde (kan yapımı) ve damar endotelinin yapımında görev alırlar (Reyes ve ark., 2002 ). 1.3 Hematopoez (Kan Yapımı) Kan dokusu; yaşam süreleri birkaç saatten (nötrofiller) birkaç yıla kadar (hafıza hücreleri) değişen, 8 farklı hücre grubundan oluşmaktadır. Bunlar; T-lenfositler, B-lenfositler, Monosit / Makrofajlar, Nötrofiller, Eozinofiller, Bazofiller, Eritrositler ve Trombositler olarak adlandırılmaktadır (Hampson ve ark., 1996). Tüm bu kan hücrelerinin hayat boyu çoğalması, farklılaşması ve olgunlaşması hematopoietik sistem tarafından gerçekleştirilir. İlk 6 haftalık dönemde embriyonik yolk kesesinde (ilk hematopoietik organ), daha sonra, fetal karaciğer ve dalakta (6-28 hafta), son olarak da, hayat boyu devam edecek şekilde kemik iliğinde gerçekleşen hematopoez; pluripotent kök hücreler, kemik iliği mikroçevresi ve büyüme faktörleri/düzenleyici proteinler arasında 3

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ gerçekleşen interaksiyon ve denge ile sağlanır. Kemik iliği mikroçevresi; HKH ler, fibroblast, endotelyal hücreler, makrofajlar ve adiposit/yağ hücrelerini içeren stromal hücrelerden oluşur (Liffick, 1997). Tüm kan hücreleri, kemik iliğinde bulunan pluripotent kök hücrelerden oluşur. Bu orijinal, tanımlanabilen prekürsör hücreler, tüm lenfositlerin oluştuğu lenfoid kök hücrelere ve diğer tüm kan hücrelerinin öncüsü myeloid kök hücrelere dönüşür. Lenfositler, olgunlaşmasını kemik iliği ve lenf bezlerinde tamamladıktan sonra dalak, lenf bezleri ve diğer lenfoid organlara giderler ve gerekli durumlarda salınırlar. Diğer tüm kan hücreleri ise kemik iliğinde olgunlaşır ve buradan salınırlar (Haen, 1995 ). Hematopoez sırasında, kök hücreler progenitör hücrelere dönüşür. Progenitörler, kemik iliği aspiratlarında morfolojik olarak tanımlanabilen prekürsör hücreleri oluşturur ve son olarak da matürasyon ile olgun kan hücreleri meydana gelir (Şekil 1.1.). Bu dönüşüm sırasında, ilkel hücrelerden olgunlara gidildikçe proliferatif kapasite azalmakta, diferansiyasyon artmaktadır (Williams, 2000). 4

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ Şekil 1.1. Hematopoietik Kök Hücre Farklılaşması (Williams, 2000) Kİ; Kemik iliği, CFU; Colony-Forming Unit, S; spleen; GEMM; Granulosit, Eritrosit, Monosit, Megakaryosit; BFU; Burst-Forming-Unit, GM; Granulosit- Monosit, EOS; Eozinofil, BASO; Bazofil, MEG; Megakaryosit. 5

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ 1.3.1. Hematopoezin Kontrolü Hematopoietik sistem; kanama ve infeksiyon gibi fizyolojik streslere karşı doğru ve hızlı cevap verebilmek için, iki düzenleyici sistemden oluşan, esnek bir kontrol mekanizmasına sahiptir. Bunlardan ilki, birçok hücre tarafından sentezlenerek dolaşıma verilen sitokinler ve büyüme faktörleri gibi düzenleyiciler tarafından gerçekleştirilen humoral kontrol mekanizmasıdır. İkinci bir kontrol sistemi ise, kemik iliği mikroçevresinde stromal ve hematopoietik hücreler arasında hücre-hücre etkileşimi ile gerçekleşen lokal kontrol mekanizmasıdır. Hematopoez; başlangıçta lokal, olgunlaşma ilerledikçe humoral kontrol mekanizmalarının etkisi ile farklı büyüme faktörlerinin ve/veya sitokinlerin rol aldığı bir feedback mekanizması ile yönetilir (Şekil 1.2.) (Teseta ve Dexter, 1999). Şekil 1.2. Kök ve Progenitör Hücrelere Etkili Sitokinler; Lokal ve Humoral Faktorlerin Etkinlikleri (Teseta ve Dexter, 1999) SCF = Stem Cell Factor; LIF = Leukemia Inhibitory Factor; IL= Interlökinler; Epo=Eritropoetin 6

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ 1.3.1.1 Sitokinler Günümüzde, hematopoietik gelişimin düzenlenmesinde görev alan büyüme faktörü ve sitokinlerin, 20 den fazla çeşidi tanımlanmış, dizi analizi yapılmış ve klonlanabilmiştir. Tüm sitokinler, hücre spesifik membran reseptörlerini bağlayarak bir veya daha fazla intraselülar sinyal iletim sistemini aktive ederler. Birçoğu, 20-40 kd moleküler ağırlığa sahip küçük proteinlerdir ve genellikle glikolize formdadır. Glikolizasyon, sitokinlerin plazma yarı ömrü, çözünürlüğü ve protein yapısı üzerinde önemli rol oynar. Ayrıca sitokinler, hücrelerin diziye spesifikleşmesinden çok çoğalmasını ve progenitör hücrelerin yaşam sürelerinin sürdürülmesini sağlarlar. Farklı sitokinler, progenitör hücre gelişiminin farklı basamaklarında görev alır. Örneğin, EPO (Eritropoietin), TPO (Trombopoietin) ve M-CSF (Macrophage-colony stimulating factor); eritroid, megakaryosit ve makrofaj progenitörlerinin maturasyonu üzerinde etkinken, IL-3 (Interleukin-3), GM-CSF (Granulocytemacrophage colony stimulating factor), G-CSF (Granulocyte-colony stimulating factor) ve IL-4 (Interleukin-4); hücre siklusunun G 0 fazında etkinliğini göstererek hücrelerin çoğalmasında rol oynar (Ogawa, 1993). 1.3.1.2 Hematopoietik Büyüme Faktörleri Hematopoietik büyüme faktörleri (HBF), glikoproteinlerin kompleks bir ailesidir. Pluripotent kök hücrelerin farklılaşıp çoğalmasını +/- yönde düzenlerken, spesifik reseptörleri aracılığıyla, olgun kan hücrelerinin fonksiyonlarını da regüle eder (Groopman ve ark., 1989). Reseptörler, plazma membranındaki sinyal proteinleri ve stoplazmik protein kinazların yanında, hücredeki gen aktivasyonunu da sağlarlar (Taniguchi, 1995). HBF ler, genellikle tek bir seriye ait hücrelere farklılaşmayı sağlamazken G-CSF ve GM-CSF gibi daha spesifik olanları da bulunmaktadır (Groopman ve ark., 1989). 7

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ 1.3.1.2.(1). G-CSF (Granulocyte-Colony Stimulating Factor) İnsan G-CSF geni, 17. kromozomun q11-q22 bölgesinde kodlanır. 174 aminoasit içeren (Demetri ve Griffin, 1991) ve 20 kd luk moleküler ağırlıkta (Groopman ve ark., 1989), Sistein (Cys) 36 ve 42 ile 64 ve 74 arasında bulunan iki adet disülfid bağa sahip, Treonin 133 (Thr133) den glikolizasyona uğramış bir glikoproteindir (Şekil 1.3.) (Asano, 1991). Şekil 1.3. İnsan G-CSF inin Moleküler Yapısı (Asano, 1991) Gal: D-galaktoz, GalNAc:N-asetilgalaktozamin, NeuAc: N-asetilnöraminikasit G-CSF; granülosit seriye ait progenitör hücrelerin çoğalmasını, farklılaşmasını ve aktivasyonlarını arttıran büyüme faktörüdür. Kemik iliğinin uyarılması ile prekürsör ve olgun nötrofilik granülositlerin üretilmesi ve fonksiyonlarının düzenlenmesini sağlar. Endotelyum, makrofajlar ve diğer immun sistem hücreleri tarafından üretilir. Normalde, G-CSF üretimi çok düşük bir miktarda gerçekleştirilir ve nötrofil sayısına bağlı olarak feed-back mekanizması ile kontrol edilir (Demetri ve Griffin, 1991). Moleküler kontrol cyclin-d1 in aktivasyonu ile sağlanır. cyclin-d1, hücre döngüsü sırasında G 0 /G 1 fazını kısaltarak S fazına geçişi hızlandırır. Ayrıca, hücre 8

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ olgunlaşmasını indükleyerek olgun granülositlerin aktivasyonlarını arttırır, apoptozisi engelleyerek granülositik hematopoietik hücrelerin canlılığını sağlar (Metcalf, 1996). G-CSF, etkisini spesifik reseptörleri aracılığıyla göstermektedir. Bu reseptörler, 759-812 aminoasit içeren tek zincirli polipeptidlerdir, intrinsik tirozin kinaz aktivitesi yoktur ve G-CSF ye yüksek affinite ile bağlanırlar (Demetri ve Griffin, 1991). G-CSF; Nötrofil koloni hücrelerinin farklılaşmasını ve çoğalmasını, Megakaryositik ve granülosit-makrofaj koloni büyüme faktörlerinin (M-CSF, GM-CSF) uyarılmasını, Myelositlerin kısa süreli çoğalıp gelişmesini, HKH lerin sayısının arttırılmasını, Nötrofillerin olgunlaşma süresinin kısalması, kana geçmelerinin tetiklenmesi, yaşam süreleri ve aktivitelerinin arttırılmasını sağlar (Adachi ve ark., 1994). 1.4 Hematopoietik Kök Hücre Transplantasyonu 1.4.1 Tarihçesi Dünyada ilk olarak 1960 lı yıllarda başlamış ve 1980 lı yıllarda yaygınlaşmış olan kemik iliği transplantasyonu (KİT), Türkiye de 1980 lı yıllarda bir tedavi olarak klinik uygulamalara girmiştir. Ülkemizde, ilk KİT merkezi, 1984 yılında Gülhane Askeri Tıp Akademisi (GATA) nde TUBİTAK Projesi ile kurulmuştur. Tıp literatürüne geçmiş olan kayıtlı ilk Otolog KİT, 1984 yılında GATA da solid tümörlü, erişkin bir hastaya yapılmıştır. Yine aynı merkezde, 1985 yılında Akut Lenfoblastik Lösemili (ALL) erişkin bir hastaya, doku grubu kısmen uygun bir akrabasından Allojeneik KİT uygulanmıştır. İlk pediatrik nakil ise, Talasemi Majör (TM) tanısı ile takip edilen bir hastaya aynı merkezde, 1988 yılında yapılmıştır. Farklı HKH kaynaklarının bulunması, hazırlama rejimlerindeki yeni uygulamalar, monoklonal antikorların kullanımı ve non-myeloablatif hazırlama rejimlerinin uygulanması ile KİT, yerini periferik kök hücre transplantasyonu (PKHT) na bırakmıştır. 1990 lı yıllardan sonra bu alanda önemli gelişmeler 9

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ kaydedilmiş, böylelikle, HKHT na bağlı komplikasyonlar ve ölüm oranları ciddi derecede azalmıştır. Ülkemizde, ilk Otolog Periferik Kök Hücre Transplantasonu (OPKHT), Ankara Ünv., Tıp Fakültesi, İbn-i Sina Hastanesi nde, Non-Hodgin Lenfoma lı (NHL) bir hastaya 1992 yılında uygulanmıştır. İlk Allojeneik Periferik Kök Hücre Transplantasyonu (APKHT) ise, aynı merkezde, doku uygunluğu tam, kardeş vericiden Aplastik Anemili (AA) bir hastaya 1993 yılında yapılmıştır (Arpacı, 2006).. 1.4.2 Tanımı HKHT, bir çok hematolojik hastalığın tedavisinde başvurulan son yöntem olarak geliştirilmiştir (Çizelge 1.1.) (EBMT, 2000) ve HKH lerin kullanımı ile tüm hematopoietik sistemin yeniden yapılandırılması amaçlanmıştır (Duncombe, 1997). Özellikle, standart doz kemoterapiye yanıt vermeyen (refrakter) ya da yeterli cevabın alınamadığı hastalarda, yüksek doz kemoterapi uygulaması ile mevcut hastalığı yok etmek, tümör yükünü azaltmak, immunsupresyon sağlamak ve kemik iliğinde yeterli boşluk oluşturmak hedeflenir (Appelbaum, 2000). Kemik iliğinden, mobilize periferik kandan ve/veya umbilikal kordon kanından toplanan kök hücreler, yüksek doz kemoterapi sonrasında hastaya infüze edilir. Bu hücreler, hastanın kemik iliğine göç eder ve yerleşir (Srour ve ark., 2001). Uygun mikroçevre sağlandığında, 7-10 gün içerisinde kemik iliğini tekrar yapılandırmaya ve olgun kan hücrelerini oluşturmaya (engrafman) başlar. Engrafmanın uygun sürede sağlanması, kemoterapi sonrası derin pansitopenideki hastanın hayatta kalabilmesi için, klinik açıdan son derece önemlidir (To ve ark., 1997). 10

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ Çizelge 1.1. HKHT Endikasyon Kategorisi (EBMT, 2000) Allojeneik Kök Hücre Transplantasyonu Otolog Kök Hücre Transplantasyonu Ciddi aplastik anemi (AA) Talasemi majör (TM) Orak hücreli anemi (OHA) Kronik myeloid lösemi (KML) Akut myeloid lösemi (AML- I. ve II. tam remisyon) Akut lenfoblastik lösemi (ALL- I. ve II. tam remisyon) Ciddi immün yetmezlik Multiple myeloma (MM) Metabolik hastalıklar Hodgin ve non-hodgin lenfoma (HL-NHL) Akut lenfoblastik lösemi Hodgin Lenfoma (II. tam remisyon) Multiple Myeloma Solid tümörler (meme, rahim, nöroblastoma) Otoimmün hastalıklar Kronik lenfositik lösemi Kronik myeloid lösemi Akut myeloid lösemi Hodgin ve non-hodgin lenfoma (I. tam remisyon) 1.4.3 Tipleri HKHT; Otolog Kök Hücre Transplantasyonu (OKHT) ve Allojeneik Kök Hücre Transplantasyonu (AKHT) olarak iki ana başlık altında incelenmektedir; 1.4.3.1 Otolog Kök Hücre Transplantasyonu Yüksek doz kemoterapi sonrasında pansitopeniye girmiş (eritrosit, trombosit ve beyaz küre yapımı baskılanmış) hastaların kemik iliğini desteklemek amacıyla, daha önce hastadan elde edilmiş, mobilize periferik kan veya kemik iliği kaynaklı kök hücrelerin, hastanın kendisine verilmesidir. OKHT de amaç kür değil, hastalıksız sağ kalım süresini uzatmak ve yaşam kalitesini arttırmaktır. 11

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ 1.4.3.2 Allojeneik Kök Hücre Transplantasyonu Hematolojik malignansilerde, kemik iliği yetmezliklerinde ve doğuştan immün yetmezliklerde sıklıkla kullanılan bir tedavi yöntemidir. HLA uyumlu vericiden toplanan kemik iliği, mobilize periferik kan ve/veya kordon kanı kaynaklı kök hücrelerin, hazırlama rejimi ile myeloablatif (kemik iliği baskılanmış) hale getirilmiş hastaya verilmesi ve hastada vericinin hemato-immünopoietik sisteminin yapılandırılmasıdır (Lanier ve ark., 1997). HLA sistemi; insanlarda 6. kromozomun kısa kolunda bulunan ve HLA-loci olarak adlandırılan 12 genetik bölgeden oluşmaktadır. HLA allelleri Klas-I (HLA- A,B,C) ve Klas-II (HLA-DR, DQ, DP) antijenlerini kodlamaktadır. Klas-I antijenleri vücuttaki tüm çekirdekli hücre yüzeylerinde, Klas-II antijenleri ise monositler, B-lenfositler, T-lenfositler ve dendritik hücre gibi savunma hücrelerinin yüzeylerinde kodlanmaktadır. HLA molekülleri antijenik peptidleri bağlayarak spesifik immün cevabın oluşmasını sağlarlar (Benichou ve ark., 1997). Kemik iliği, B ve T lenfositler ile makrofajları da içerir. Bundan dolayı, AKHT da hasta ile donör arasındaki HLA doku uygunluğunun tam veya neredeyse tam olması tercih edilmekte, böylelikle transplantasyona bağlı komplikasyonlar büyük oranda önlenerek transplantasyonun başarısını arttırmak hedeflenmektedir. HLA uygunsuz AKHT yapıldığında ise hem donörün hem de hastanın T-hücreleri harekete geçecek, sonuçta oldukça fatal seyreden, şiddetli ve akut graft rejeksiyonu ile GVHH (Graft Versus Host Hastalığı) gözlenecektir (Lanier ve ark., 1997). AKHT sonrası, ilk 3-12 ayda hastada derin immün yetmezlik gözlenir. T-hücre düzeyleri azalmıştır. Hastanın kan grubu yaklaşık 60 gün içerisinde vericinin kan grubuna değişir (Schmitz ve ark., 1996). 1.4.4. Mobilizasyon Teknikleri Normalde periferik kanda dolaşan kök hücre sayısı, transplantasyon için yetersiz miktardadır (1 / 10 5 ). Kemoterapi ve/veya rekombinant insan büyüme faktörlerinin (rhug-csf) kullanılması; kök-progenitör hücrelerin kemik iliğinden 12

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ mobilizasyonunu sağlar ve periferik kandaki miktarlarını yaklaşık 100 kat arttırır. Kemoterapi, OKHT planlanan hastalarda tek başına da bir mobilizan ajan olarak kullanılabilmektedir. Ancak, sağlıklı vericilerde sadece büyüme faktörleri kullanılmalıdır (Kessinger ve Armitage, 1987). Büyüme faktörleri ve sitokinler kullanılarak; granülosit seriye ait kök-progenitör hücrelerin periferik kana mobilizasyonu, çoğalması, farklılaşması, aktivasyonu, apoptozisin engellenmesi ile hücrelerin yaşam süresinin uzatılması sağlanabilmektedir. Ek olarak, PKHT sonrası derin nötropenide olan hastaların kemik iliğinin hareketlenmesi, olgunlaşma süresinin kısaltılması (7 günden 1,5 güne kadar) ve olgun nötrofillerin kemotaksis ile fagositoz yeteneklerinin arttırılması mümkün olabilmektedir (Lieschke ve Burgess, 1992). G-CSF ve GM-CSF; mobilizasyonda en sık kullanılan büyüme faktörleridir. Görülen yan etkiler ve mobilizasyon etkinliği açısından G-CSF, GM-CSF e göre daha avantajlı bulunduğundan G-CSF kullanımı daha yaygındır (Kröger ve ark., 2000). Bunların dışında kullanılan diğer sitokinler ise; TPO, FLT 3 Ligand (FLT- 3L), Stem Cell Factor (SCF) ve IL-8 dir (Filshie, 2002). Günümüzde, klinik kullanımda yaygın olarak uygulanmakta olan iki çeşit rhug- CSF bulunmaktadır. 1.4.4.1. Rekombinant Hematopoietik Büyüme Faktörleri 1.4.4.1.(1). Lenograstim (Glikolize - rhug-csf) Yapı ve konformasyonu, normal insan G-CSF sinin aynısı olarak oluşturulmuş, rekombinant formdur (Kubota ve ark., 1990). Tek polipeptid zincirden oluşmuş, 174 aminoasit içeren, 20 kd ağırlığa sahip bir glikoproteindir. Cys36 ve Cys42 ile Cys64 ve Cys74 arasında oluşan iki adet disülfid köprüye sahiptir. Serbest bir sisteini (Cys 17) ile Thr133 e bağlı bir karbonhidrat zinciri bulunmaktadır. Bu karbonhidrat yapı, moleküler ağırlığın yaklaşık olarak % 4 ünü oluşturmakta ve D-galaktoz (Gal), N-asetilgalaktozamin (GalNAc) ve N-asetilnöraminikasit (NeuAc) içermektedir. İnsan hücre dizisinden mrna nın ayrıştırılması ve cdna laboratuarlarında bir 13

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ vektör aracılığıyla memeliye (CHO-Chinese hamster ovary) verilmesi ile üretilmektedir. Yapısında bulunan karbonhidrat zincir, stabilite, farmakokinetik, reseptör affinitesi, antijenite ve glikoproteinlerin biyolojik aktivitesi için önemli rol oynamaktadır. Değişik sıcaklık ve ph değerlerinde etkinliğini kaybetmez, proteolizlere karşı dayanıklıdır. Böylelikle oda sıcaklığında birkaç yıl saklanabilir. Ayrıca, granülositlerin süperoksit üretimini de düzenlemektedir (Lenograstim Product Monograph). 1.4.4.1.(2). Filgrastim (non-glikolize-rhug-csf) Escherichia coli (E. coli) ye insan G-CSF geninin yerleştirilmesi sonucu, rekombinant DNA teknolojisi ile kültür ortamında üretilmiştir. 175 aminoasit içeren 18,8 kd ağırlığında, insan DNA dizi analizine göre düzenlenmiş, N-terminal ucuna metionin (met) eklenmiş, non-glikolize formda bir proteindir. Bakterilerin protein üretimi, memelilerinkine oranla tam gelişmemiş olduğundan, Filgrastim, doğal molekül ile yapısal olarak tam özdeş değildir. Normal insan G-CSF si etkisini diziye spesifik gösterirken, Filgrastim; doza bağlı olarak nötrofilde, alkalen fosfataz seviyesinde ve kemik iliğinde myeloid:eritroid oranında artış gösterir (Filgrastim Product Monograph). 1.4.5. Kök Hücre Toplanması HKHT amacıyla kemik iliğinin elde edilmesi, ameliyathane koşullarında ve genel anestezi ile mümkündür. Kemik iliği, pelvis kemiğinden aspirasyon yöntemi ile elde edilir (hasta/donörün toplam kan hacminin en fazla %10 u oranında) ve steril koşullarda heparin ile antikoagüle edilir. İçerdiği artefakt, eritrosit ve yağ hücrelerini uzaklaştırmak amacıyla, laboratuar koşullarında saflaştırıldıktan sonra hastaya infüze edilir. 1971 yılında, insan periferik kanında kök/progenitör hücrelerin görülmesi, daha sonrasında aferez cihazlarının kullanıma girmesi ve büyüme faktörleri ile mobilize 14

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ edilmiş periferik kandan yüksek miktarda kök hücre toplanabildiğinin gösterilmesi ile 1985-86 yıllarından sonra PKHT kullanımının önemi artmıştır. Günümüzde, OKHT nın neredeyse tamamı, AKHT nın ise büyük bir bölümü periferik kan kök hücreleri ile yapılmaktadır. Bunun en önemli nedenleri; Kemik iliği toplama işleminin genel anestezi altında gerçekleştirilmesi, Toplama (aspirasyon) işlemine bağlı uzun süreli ağrı ve infeksiyon tehlikesi, Ürünün işlenmesi sırasında meydana gelen kök hücre kayıpları, Otolog transplantlarda, rezidüel tümörlerden kaynaklanan metastaz/relaps görülme olasılığı, Periferik kandan toplanan üründe daha fazla CD34 + hücre bulunması ve buna bağlı olarak trombosit ile nötrofil engrafman süresinin daha kısa olmasıdır. Ayrıca, PKHT de daha yüksek oranda akut ve kronik GVHH görülmesine rağmen, birçok çalışmada transplanta bağlı mortalite, relaps oranı ve yaşam süresi üzerinde önemli farklılıklar olmadığı gösterilmiştir. Periferik kandan kök hücre toplama işlemlerinde kullanılan çeşitli aferez cihazları bulunmasına rağmen, tüm cihazlar, antikoagüle edilen kanın santrifüj yöntemi kullanılarak komponentlerine ayrılması prensibi ile çalışmaktadır. Hasta/donörden alınan tam kan, antikoagüle edilir ve cihazın santrifüj sistemine gönderilir. Santrifugasyon ile tam kan; plazma, trombosit, lenfosit-monositgranülosit (Buffy coat) ve eritrosit tabakası olarak, spesifik gravitelerine göre, farklı katmanlara ayrılır. Kök/progenitör hücrelerin morfolojik olarak lenfositlere benzediği düşünüldüğünden, toplama işlemlerinde trombosit ile granülositlerin arasındaki tabaka toplanır. Toplanan ürünün Hematokrit düzeyi (Hct) %2-3 arasında olmalıdır. Burada amaç, dondurularak saklanan ve daha sonra eritilen ürünlerin infüzyonunda hemolizi ve hemolize bağlı gelişen böbrek fonksiyon bozukluğunu önlemektir. Ayrıca Hct yükseldikçe ürünün granülosit içeriği artmakta ve lenfosit içeriği azalmaktadır. Bu da, aferez tekniğiyle elde edilen ürünün CD34 + hücre miktarında düşüşe neden olmaktadır. Üründe trombosit içeriği de düşük tutulmalıdır. Böylece, hasta/donörün trombositopeniye girmesi ve üründe agregasyon/ pıhtılaşma olasılığı engellenmiş olmaktadır (Ramakrishna, 2005). 15

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ 1.4.5.1. Toplama Zamanı Toplama işlemlerinde temel amaç, az sayıda aferez işlemi ile yeterli miktarda CD34 + hücre toplanmasını sağlamaktır. Bundan dolayı, uygun toplama zamanına karar vermek çok önemlidir. OPKHT ile ilgili yapılan çok merkezli çalışmalar; günlük 5-10 µg/kg G-CSF enjeksiyonunu takiben ve hasta nötropeniden çıkarken, beyaz küre (BK) sayısı 1.0X10 9 /L ve CD34 + kök hücre sayısı 20/µL olduğunda afereze başlamanın gerektiğini ortaya koymuştur. APKHT da ise, donöre 10µg/Kg/gün den 5 gün G-CSF verildiğinde ve 5-6. günlerde toplama işlemi yapıldığında, tek seansta yeterli miktarda (4-5X10 6 /Kg) CD34 + hücre toplanabileceği gösterilmiştir (Ramakrishna, 2005). 1.4.5.2. Toplanacak Ürün Miktarı Başarılı bir engrafmanın sağlanabilmesi için, uygun sayıda ve canlı kök hücrenin infüze edilmesi gereklidir. Kök hücre miktarını ölçmek amacıyla mononükleer hücre (MNH), CD34 + hücre tayini, koloni sayımı (CFU; colony forming unit), LT-CIC (Long term-culture initiating cells) ve viabilite (canlılık) testleri gibi farklı yöntemler kullanılmaktadır. CFU ve LT-CIC sonuçlarının tanımlanabilmesi zaman gerektirdiği için klinikte kullanılmamaktadır. Engrafmanın sağlanması, mutlak nötrofil sayısı (MNS) 0.5X10 9 /L ve trombosit sayısı 20 X10 9 /L olması ile tanımlanmaktadır. Bir çok merkezde bu değerlerin sağlanabilmesi için hastanın kilosu başına minimum 2-2.5 X 10 6 / Kg CD34 + hücre ve 2-6 X 10 6 / Kg MNH toplanmasının gerekliliği vurgulanmıştır. Bir çalışmada ise HLA uygun vericiden yapılan APKHT sonrası 8.3 X 10 6 / kg CD34 + hücre verilmesinin kronik GVHH riskini arttırdığı bildirilmiştir (Jansen ve ark., 2002). 16

1. GİRİŞ Ayşe KÜSTÜ 1.4.6. Yan Etkiler APKHT da donörde görülebilecek yan etkiler mobilizasyona bağlı olabileceği gibi aferez işlemine de bağlı olabilir. Mobilizasyonda kullanılan, G-CSF e bağlı olarak gelişebilecek yan etkiler sıklıkla omurga, kalça ve leğen kemiğinde oluşabilen kemik ağrısı, baş ağrısı, kas ağrısı, mide bulantısı-kusma, halsizlik, uyku hali ve injeksiyon yerinde kızarıklıktır. Ayrıca serum LDH, ALP ve BUN değerlerinde artış olabilir. BK ve MNH deki artışlar ile trombosit miktarındaki düşüş doza bağlı oluşabileceğinden, G-CSF dozu düşürülerek komplikasyon riski önlenebilir. Aferez işlemleri sırasında ise, iğne giriş yerlerinde kızarıklık, şişlik ve hafif kanama olabilir. İşlemlerde genellikle antikoagülan olarak Asit-Sitrat-Dekstrozformül-A (ACD-A) kullanılır. ACD-A; etkinliğini, bileşiminde bulunan sitratın kandaki iyonize kalsiyumu (İ.Ca) bağlaması sonucu, koagülasyon kaskadını bozarak gösterir. Bundan dolayı, aferez işlemleri sırasında, kandaki İ.Ca seviyesi düşeceğinden, donörlerde hipokalsemi gözlenebilir. Hipokalsemi sonucunda, bulantıkusma, kas krampları, hipotansiyon da gelişebilir. Bu tarz durumlarda, damar içine ve/veya oral alım ile kalsiyum desteği yapılması önerilmektedir. Donörün total kan hacmine bağlı olarak, ekstrakorporeal dolaşımdaki kan miktarının yüksek olması da hipotansiyon riskini arttırır. Ayrıca, toplanan aferez ürününün hacmine, içeriğine ve kullanılan aferez cihazının ekstrakorporeal hacmine bağlı olarak, geçici bir süre için, Hct ve trombosit sayısı da azalabilir (Anderlini ve ark., 1996) Bu çalışmada, günümüzde başta hematolojik malignansiler olmak üzere birçok hastalıkta tedavi seçeneği olarak kullanılan APKHT de elde edilen kök hücre ürününün daha kaliteli olmasını, böylelikle transplantın daha başarılı sonuçlanabilmesini ve donörlerin minimal etkilenmesini sağlamak için kullanılan iki farklı büyüme faktörünün (Lenograstim&Filgrastim) etkinliğini değerlendirmek ve varsa olası farklılıkları belirlemek amaçlanmıştır. 17

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşe KÜSTÜ 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR De Arrıba ve ark. (1997), akciğer kanseri (Evre-II,III,IV) tanısı ile takip edilen, yaş ortalaması 43 (31-57) olan toplam 30 hastaya eşit dozda glikolize ve nonglikolize rhug-csf uygulamış ve uygulamanın 3. gününde kök hücre toplama işlemine başlamıştır. Aynı miktarda CD34 + hücre toplandığı zaman sonuçları değerlendirdiklerinde, ne toplanan ürünün içeriğinde ne de mobilizasyon ve toplama işlemlerinin maliyetlerinde bir farklılık olmadığını gözlemlemişlerdir. Hoglund ve ark. (1997), yaş ortalaması 27 (19-44) olan, 32 sağlıklı, erkek vericinin sonuçlarını değerlendirdikleri çalışmada, 5 gün boyunca 10 µg/kg/gün, filgrastim ve lenograstim kullanımında karşılaşılan yan etkilerde önemli bir farklılık olmadığını kaydetmişlerdir. Ayrıca, her iki ajanın da CD34 + hücre mobilizasyonunda aynı kinetiğe aynı zaman diliminde ulaştığını göstermişlerdir. Chaisiripoomkere ve ark. (2001), yaşları 21-41 olan, 26 sağlıklı vericinin sonuçlarını analiz etmiştir. Buna göre; beyaz küre, granülosit, lenfosit, monosit, CD34 + hücre ve CFU-GM miktarları mobilizasyonun 5. gününde maksimuma ulaşmakta, fakat kırmızı küre, hematokrit ve trombosit sayısı 0. güne göre daha düşük olarak tespit edilmektedir. Sonuçta; kök hücre toplanması için en uygun zamanın mobilizasyonun 5. günü olduğunu belirtmişlerdir. Shimizu ve ark. (2002), 49 vericinin sonuçları üzerinde yapmış oldukları çalışmada; 45 yaş altındaki vericilerden, 45 yaş üstü olanlara göre çok daha fazla miktarda CD34 + hücre toplandığı sonucuna varmıştır. Fischer ve ark. (2005), donör karakterleri ve mobilizasyon tekniği arasında farklılık olmayan, 191 kadın, 409 erkek donörü değerlendirdikleri ve 18 yaş üstünü erişkin olarak kabul ettikleri bir çalışma sonucunda; yaş, boy ve kilonun mobilizasyon üzerine etkili olmadığını, fakat cinsiyetin çok önemli bir faktör olduğunu belirtmiş ve özellikle lenograstim alan erkek grubunda, kadınlara oranla daha fazla sayıda periferik CD34 + kök hücre bulunduğunu vurgulamıştır. Hüttmann ve ark. (2005), farklı tanılarla takip edilen ve yüksek doz kemoterapi sonrasında otolog kök hücre transplantasyonu olan 261 hastanın sonuçlarını değerlendirdikleri çalışmada; G-CSF tedavisi, lökosit engrafmanı ve hastanede kalış 18

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayşe KÜSTÜ süresi ile işlemlerin toksisitelerini karşılaştırmışlardır. Sonuç olarak; lenograstim ve filgrastim gruplarında farklılık olmadığını, klinik kullanımda eşit olduklarını sunmuşlardır. Martino ve ark. (2005), yaş ortalamaları 42 (16-63), vücut ağırlıklarının ortalaması ise 72 Kg (47-113) olan 101 sağlıklı vericiye yapılan 230 seans kök hücre aferezi işleminin sonuçlarına ilişkin yapmış oldukları değerlendirmede, Lenograstim (n=46) ve Filgrastim (n=55) in periferik CD34 + hücre sayısını ve toplanan CFU-GM miktarını eşit etkilediğini göstermiştir. Ayrıca; vericiler üzerindeki yan etkilerin (kemik ağrısı, başağrısı, mide bulantısı, ateş, splenomegali) aynı oranda geliştiğini vurgulamışlardır. Ings ve ark. (2006), yapmış oldukları karşılaştırmalı çalışmada, Lenograstim ile Filgrastim in, 400 sağlıklı verici üzerindeki etkisini değerlendirmiştir. Sonuçta; yaş, cinsiyet ve ağırlığın mobilizasyona minimal etki yaptığını, toplanan CD34 + hücre miktarının önemsiz derecede farklı olduğunu, buna karşılık yalnız Lenograstim kullanıldığında, daha fazla miktarda CFU-GM toplandığını gözlemlemişlerdir. 19

3. MATERYAL VE METOD Ayşe KÜSTÜ 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal 3.1.1. Filgrastim (non glikolize rhug-csf) Ticari adı Neupogen (Amgen, Thousand Oaks, CA, USA) dir. Spesifik aktivitesi 100.000 IU/µg dır. Tek kullanımlık, 1 ml veya 1.6 ml lik şırıngalarda, 300 µg veya 480 µg aktif madde içeren formlarda bulunmaktadır. Filgrastim ürün içeriği Çizelge 3.1. de özetlenmiştir (Filgrastim Product Monograph). Çizelge 3.1. Filgrastim Ürün İçeriği 300 µg / 1.0 ml vial 480 µg / 1.6 ml vial Filgrastim 300 µg 480 µg Asetat 0.59 mg 0.94 mg Sorbitol 50.0 mg 80.0 mg Tween 80 0.04 mg 0.064 mg Sodyum 0.035 mg 0.056 mg 300 µg / 0.5 ml şırınga 300 µg 0.295 mg 25.0 mg 0.02 mg 0.0175 mg 480 µg / 0.8 ml şırınga 480 µg 0.472 mg 40.0 mg 0.032 mg 0.028 mg 3.1.2. Lenograstim (Glikolize rhug-csf) Ticari adı Granocyte (Aventis Pharma, Maisons Aalfort Cedex, France) dır. Daha önceleri formülünde insan albumini bulunan Granocyte, patojenlerle kontaminasyonu engellemek amacı ile yeniden formüle edilmiştir. 1.4 ml steril su içeren viallerde 368 µg bulunur, final konsantrasyonu 263 µg/ml dir. Spesifik aktivitesi 127.760 IU/µg dır. Ürün içeriği Çizelge 3.2. de özetlenmiştir. Tek kullanımlık şırıngalarda bulunmakla birlikte iki farklı dozda pazarlanmaktadır (Lenograstim Product Monograph). 20

3. MATERYAL VE METOD Ayşe KÜSTÜ Çizelge 3.2. Lenograstim Ürün İçeriği Granocyte 13 Granocyte 34 Lenograstim D-mannitol L-arjinin L-fenilalanin L-metionin Tween 20 Hidroklorikasit 105 µg 25 mg 10 mg 10 mg 1 mg 0.1 mg ph 6.5 263 µg 25 mg 10 mg 10 mg 1 mg 0.1 mg ph 6.5 3.1.3. Donör Karakteri AKHT de; kök hücre toplanacak, uygun donörün belirlenmesindeki en önemli parametre; HLA doku grubu uygunluğudur. Bundan sonra ise, klinik hekimi tarafından yapılan fizik muayene sonucunda donörün, gerek mobilizasyon gerekse aferez işlemi için uygun bulunmasıdır. Bu çalışmaya; 9 u kadın, 7 si erkek olmak üzere 16 donörde yapılan 29 allojeneik periferik kök hücre toplama işlemi dahil edildi. Donörlerin; 6 sı erişkin, 10 u ise pediatrikti. Yaş ortalamaları 19.1 (8-35), ortalama vücut ağırlıkları ise 53.1 Kg (24.3-79.5) dı. HLA doku uygunluğu tüm donörler için %100 dü (HLA fullmatch). Yapılan fiziksel muayenede donörlerin mobilizasyon rejimi uygulanarak kök hücre toplanması için uygun olduğuna karar verildi. Mobilizasyona başlamadan önce tüm donörlerin viral profilleri (HbSAg, anti-hbs, anti-hcv, anti-hiv-1,2, anti- CMV) araştırıldı, hepsi negatif olarak tespit edildi. Alıcı ile vericiler arasında, majör kan grubu antijenleri, minör eritrosit antijenleri ve Rh subgrupları açısından uygunluk testleri yapıldı. Sadece 2 donörde majör uygunsuzluk belirlendi. Uygunsuzluk tespit edilenlerde, sırasıyla: Donör; A Rh (+), AB Rh (+), hasta ise; 0 Rh (+), B Rh (+) idi. 21

3. MATERYAL VE METOD Ayşe KÜSTÜ 3.2. Metod Retrospektif olarak tasarlanan bu çalışmada, iki farklı rekombinant büyüme faktörü (glikolize rhug-csf ve non-glikolize rhug-csf) ile mobilize edilerek allojeneik periferik kök hücre toplanan sağlıklı donörler değerlendirildi. G-CSF in uygulanma şekli ve dozu, klinik doktoru tarafından, daha önce yapılan çalışmaların sonuçlarına göre belirlendi. Bu çalışmada değerlendirilen işlemler; Çukurova Üniversitesi Balcalı Hastanesi Pediatrik KİT Ünitesi ve Terapötik Aferez, Kök Hücre ve Kriyoprezervasyon Ünitesi nin işbirliği ile gerçekleştirildi. Yapılan çalışmada amaç; sağlıklı vericilere eşit dozda uygulanan lenograstim ve filgrastimin, allojeneik periferik kök hücre mobilizasyonunda; 1. Periferik kanda ve toplanan üründeki CD34 + hücre miktarında, 2. Elde edilen üründeki mononükleer hücre (MNH) sayısında, 3. Hedef doza ulaşmak için gerekli aferez işlem sayısında ve 4. Büyüme faktörü uygulamasına bağlı yan etkilerde, etkinliğini ve varsa farklılığını araştırmak, 5. Aynı zamanda mobilizasyona etkili diğer faktörleri (Yaş, cinsiyet, vb.) değerlendirmektir. Tüm donörler, G-CSF mobilizasyonunun yan etkileri ve olası riskler hakkında bilgilendirildi. Yasal olarak, 18 yaş üstü donörlerin kendisinden, 18 yaşından küçük olanların ise yasal vasisinden, mobilizasyon protokolü için onay formu alındı. Periferik kök hücre aferezi işlemi için ayrıca hasta ve/veya velisinden yazılı/bilgilendirilmiş onay formu temin edilerek dosyalandı. Ek olarak, retrospektif olarak tasarlanan bu çalışma için, Ç.Ü Tıp Fakültesi Etik Kurulu nun yazılı onayı alındı. 3.2.1. Mobilizasyon Filgrastim veya lenograstim alacak donörler random seçildi. Hastaya (Alıcı) kök hücre naklinin yapılacağı gün (yüksek doz kemoterapinin bitiminden 24 saat sonra), 22

3. MATERYAL VE METOD Ayşe KÜSTÜ donörün (verici) periferik kök hücre aferezi işlemine alındığı ilk veya ikinci gün olarak ayarlandı ve buna göre mobilizasyona başlandı. Tüm donörlere; günlük 10 µg/kg/gün, tek doz ve subkutan olarak G-CSF enjeksiyonu yapıldı. Günlük G-CSF uygulamasına, kök hücre toplama işlemi bitene kadar devam edildi. Donör, bu süre boyunca, olası komplikasyonlara karşı hastanede gözlem altında tutuldu. 3.2.2. Kök hücre toplanması G-CSF uygulamasının 4. gününden başlayarak, donör periferik kanındaki MNH ve CD34 + hücre miktarı belirlendi. Bu amaçla; her sabah, G-CSF enjeksiyonundan tam 2 saat sonra alınan ve EDTA içeren tüplere konulan, 1-2 ml lik periferik kan örnekleri kullanıldı. Kan sayımı ve CD34 + hücre düzey ölçümü, Ç.Ü. Balcalı Hastanesi Merkez Laboratuarı nda yapıldı. CD34 + hücre düzey ölçümü, akım sitometrik (FACSCalibur, Becton Dickinson, Germany, EPICS XL-MCL, Fa Beckman Coulter, Germany) yöntemle tayin edildi. Alınan sonuçlara göre periferik kök hücre miktarı hesaplandı. Periferde yeterli miktarda CD34 + kök hücre ( 20/µL) bulunduğu gün, toplama işlemine başlandı. Periferik kandaki CD34 + kök hücre miktarını belirlemek için, öncelikle periferde bulunan, toplam mononükleer hücre (TMNH ) sayısı (tam kan sayımında belirtilen, BK alt gruplarından mononükleer hücrelerin toplamı) bulundu (Formül 3.1.). Formül 3.1. Periferik Kandaki TMNH Sayısının Hesaplanması TMNH (10 3 / µl) = Lenfosit (Lym) (10 3 / µl) + Monosit (Mono) (10 3 / µl) Bu sonuçla birlikte, akım sitometrik analizde belirlenen, TMNH içerisindeki CD34 + kök hücre yüzdesinin değerlendirilmesi ile CD34 + kök hücre sayısı hesaplandı (Formül 3.2.) 23

3. MATERYAL VE METOD Ayşe KÜSTÜ Formül 3.2. Periferik Kandaki CD34 + Kök Hücre Sayısının Hesaplanması CD34 + kök hücre sayısı / µl = MNH (10 3 / µl) x (%) CD34 + hücre Tüm işlemlerden önce ve sonra, donörden, tam kan sayımı (Hemogram) yapıldı. Koagülasyon parametreleri (PTZ, INR, aptt, Fibrinojen) ve böbrek ile karaciğer fonksiyon testlerini de içeren bazı biyokimyasal testler (BUN, Kreatinin, AST, ALT, Sodyum, Potasyum, Total/İyonize Kalsiyum (T/İ.Ca)) çalıştırıldı. Hiçbir donörün laboratuar testlerinde anormal bir sonuç gözlenmedi. Aferez işlemi için, donörlerin periferik venleri kontrol edildi ve uygun bulunanlara 16-18G (gauge) intraket kullanılarak damar yolu açıldı. Periferik venleri uygun olmayanlara ise, çift lümenli 9-12 F (French) hemodiyaliz kateteri takıldı. İşlemler; sürekli akım tekniği ile çalışan hücre ayırım cihazları (CS-3000 Plus, Baxter, Germany, AS.TEC 204, Fresenius, Germany) kullanılarak yapıldı. Cihazlarda yapılan işlem ayarları; donörün giriş BK, Hct ve trombosit değerine göre hesaplandı. Ayrıca, cihazın tam kan alış hızı, donörün toplam kan hacmi (TKH) ve damar yolunun yeterli çalışmasına göre ayarlandı. Her işlemde, ortalama 7.0 L (4.2 10 L) kan işlendi ve donörlere 1-3 seans işlem yapıldı. Aferez işlemleri sırasında, antikoagülan olarak ACD-A kullanıldı. ACD-A : kan oranı 1:10-13 arasında tutuldu. Böylelikle hem üründe agregat oluşması engellendi, hem de yeterli antikoagülasyon sağlanmış oldu. Fazla miktarda ACD-A kullanıldığından, donörlerin hipokalsemiye girmesini engellemek amacı ile donörün kilosuna oranla kalsiyum infüzyonu yapıldı. İki işlem dışında donör TKH sinin 2-3 katı işlendi. Bu işlemlerde, hasta ile donörün vücut ağırlıkları göz önüne alınarak yapılan hesaplamalara göre, TKH nin 1.5 ve 3.7 katı işlendi. TKH leri; cinsiyet ve boy:kilo oranına bağlı olarak vücut yağ kitle indeksinin değerlendirildiği, Gilcher in 5 ler Kuralına (Gilcher, 1996 ) göre hesaplandı. İşlemlere, kök hücrelerin periferde en fazla sayıda bulunduğu zaman olarak düşünülen, G-CSF verilmesinden 3 saat sonra başlandı. Ortalama 3-4 saat süren 24

3. MATERYAL VE METOD Ayşe KÜSTÜ işlemler boyunca, donörler, kardiyolojik olarak monitörize edildi ve her 30 dakikada bir vital bulguları takip edilerek kaydedildi. İşlem sonlarında, ortalama 169 ml (50 386 ml) kök hücre ürünü toplandı. Ürün hacimleri, kullanılan aferez sistemine ve işlenen kan hacmine bağlı olarak farklılık gösterdi. Toplanan ürünün etkinliğini değerlendirmek amacı ile 1 ml lik örnekler alındı. Örnek alma sırasında, bakteri kontaminasyonunu engellemek amacıyla, steril yöntemler kullanıldı. Alınan örnekler, tam kan sayımı yapılabilmesi için, yoğunluklarına göre 1:5-1:10 oranında dilüe edildi. Dilüsyon, serum fizyolojik veya sistemlerin özel solüsyonları kullanılarak yapıldı. Tam kan sayımı sonucuna göre, ürün; CD34 + hücre miktarı ölçümünün sağlıklı bir şekilde yapılabilmesi için, 20000 BK / µl olacak şekilde PBS (Phospate Buffer Saline) ile dilüe edildi. Alınan sonuçlara göre, üründen, hastanın her bir kilosu için toplanan TMNH (10 8 / Kg) ve CD34 + kök hücre (10 6 / Kg) miktarı hesaplandı. Ç.Ü. Balcalı Hastanesi Pediatrik KİT Merkezi nin ön gördüğü yeterli doz miktarı; 4 X 10 8 TMNH / Kg ve 5 X 10 6 CD34 + kök hücre / Kg dır. Bu miktardan az ürün toplandığı durumlarda, hastada uygun zamanda engrafman sağlanamayacağı düşünüldüğünden, aferez işlemleri tekrarlanarak yeterli doz tamamlandı. 3.2.3. Kalite ve Kontrol 3.2.3.1. TMNH (10 8 /Kg) Sayısının Hesaplanması Kök hücre ürünü içerisindeki toplam mononükleer hücre miktarı, üründen alınan tam kan sayımı sonucunda elde edilen değerlere göre hesaplanır. Bu amaçla, beyaz küre alt gruplarının da (Lenfosit, monosit, granülosit, bazofil ve eozinofil) analiz edilebildiği, 18-20 parametre çalışabilen, modern cihazlar (Becton Dickinson, Germany) tercih edildi. Hastanın her bir kilosu için toplanan TMNH miktarı Formül 3.3. e göre hesaplandı. 25