PAROKSİSMAL NOKTÜRNAL HEMOGLOBİNÜRİ TANISINDA YÜKSEK RİSKLİ HASTALARDA FLUORESCENT AEROLYSİN YÖNTEMİNİN GELENEKSEL TANI YÖNTEMLERİ İLE KIYASLANMASI

T.C ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ İÇ HASTALIKLARI ANA BİLİM DALI PAROKSİSMAL NOKTÜRNAL HEMOGLOBİNÜRİ TANISINDA YÜKSEK RİSKLİ HASTALARDA FLUORESCENT AEROLYSİN YÖNTEMİNİN GELENEKSEL TANI YÖNTEMLERİ İLE KIYASLANMASI Dr. Ayşe Nur GÜR UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Birol GÜVENÇ ADANA 2012

TEŞEKKÜR Tez çalışmamın her aşamasında bana özveri ile yardımcı olan bilgi ve deneyimlerini esirgemeyen tez danışmanım Prof. Dr. Birol GÜVENÇ e ve uzmanlık eğitimim boyunca bilgi ve deneyimlerini içtenlikle paylaşan İç Hastalıklar Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Murat SERT başta olmak üzere tüm değerli hocalarıma teşekkür ederim. Tez çalışmam sırasında bana yardımcı olan biyolog Hatice İrday ve teknisyen Sibel Erkoç a teşekkür ederim. Varlıkları ile bana her zaman destek olan, sevgi ve şefkatini esirgemeyen canım aileme teşekkür ederim. Ayşe Nur GÜR I

İÇİNDEKİLER Sayfa No TEŞEKKÜR... I İÇİNDEKİLER... II TABLO LİSTESİ... III ŞEKİL LİSTESİ... IV KISALTMA LİSTESİ... V ÖZET... VI ABSTRACT... VII 1. GİRİŞ... 1 2. GENEL BİLGİLER... 2 2.1. Paroksismal Noktürnal Hemoglobinüri Tanımı Ve Epidemiyolojisi... 2 2.2. Klinik... 6 2.2.1.Klasik PNH... 7 2.2.2.Başka Bir Kemik İliği Hastalığı Zemininde Gelişen PNH... 8 2.3.Tanı... 9 2.3.1Tanı İçin Gerekli Testler... 10 2.4.Tedavi... 15 2.5.Prognoz... 17 3. GEREÇ VE YÖNTEM... 19 3.1.Hasta Seçimi... 19 3.2.İstatiksel Değerlendirme... 19 4. BULGULAR... 21 5. TARTIŞMA... 33 6. SONUÇLAR VE ÖNERİLER... 38 KAYNAKLAR... 40 ÖZGEÇMİŞ... 44 II

TABLO LİSTESİ Sayfa No Sayfa No Tablo 1: Hastaların demografik özellikleri ve ilk tanı bilgiler... 21 Tablo 2: Hastaların hemoliz parametreleri... 22 Tablo 3: Hastaların PNH test sonuçları... 22 Tablo 4: Hastaların anemi ile ilgili ölçümleri... 23 Tablo 5: Hastaların kemik iliği biyopsi sonuçları... 24 Tablo 6: Hastaların diğer laboratuvar sonuçları... 25 Tablo 7: Hastaların ilk tanılarına göre FLAER test sonuçları ve FLAER sonuçlarının diğer PNH tanı testleri ile karşılaştırılması... 26 Tablo 8: Hastaların FLAER test sonuçlarına göre demografik özellikleri... 27 Tablo 9: Hastaların FLAER test sonuçlarına göre hemoliz parametreleri... 28 Tablo 10: Hastaların FLAER test sonuçlarına göre kemik iliği biyopsi sonuçları... 29 Tablo 11: Hastaların FLAER test sonuçlarına göre anemi parametreleri... 30 Tablo 12: Hastaların FLAER test sonuçlarına göre diğer laboratuvar ölçümleri...... 31 Tablo 13: Hastaların FLAER test sonuçlarına göre PVT ve Budd chiari sonuçları...... 32 III

ŞEKİL LİSTESİ Sayfa No Şekil 1: Kompleman inhibitörleri CD55 ve CD59... 2 Şekil 2: C59 eksikliğinin kompleman mekanizmasına etkisi... 3 Şekil 3: PNH hastalarında hemoliz, NO tüketimi... 5 Şekil 4: LDH, serbest hemoglobin ile anlamlı korelasyon... 5 Şekil 5: Bir FLAER görüntüsü... 12 Şekil 6: FLAER ile PNH klonlarının saptanması... 14 Şekil 7: Hastaların ilk tanılarına göre FLAER test sonuçları... 26 Şekil 8: Hastaların cinsiyetine göre FLAER test sonuçları... 27 Şekil 9: Hastaların FLAER sonuçlarına göre LDH değerleri... 28 Şekil10: Hastaların idrarda hemosiderin varlığına göre FLAER test sonuçları... 29 IV

KISALTMA LİSTESİ PNH DAF MIRL AA GPI MDS FLAER LDH NO MRI BT USG : Paroksismal noktürnal hemoglobinüri : Decay accelerating factor : Membran inhibitor of reactive lysis : Aplastik anemi : Glikozilfosfatidilinozitol : Miyelodisplastik sendrom : Fluorescent aerolysin : Laktat dehidrogenaz : Nitrik Oksit : Manyetik Rezonans Görüntüleme : Bilgisayarlı Tomografi Görüntüleme :Ultrasonografi V

ÖZET Paroksismal Noktürnal Hemoglobinüri Tanısında Yüksek Riskli Hastalarda Fluorescent Aerolysin Yönteminin Geleneksel Tanı Yöntemleri İle Kıyaslanması Giriş ve Amaç: Klasik olarak kronik intravasküler hemoliz bulguları, kemik iliği yetersizliği ve trombozla kendini gösteren paroksismal noktürnal hemoglobinüri, hematopoetik kök hücrenin klonal bir hastalığıdır. Glikozilfosfatidilinozitol çapası yardımıyla hücre zarına bağlanan bazı proteinlerin mutant hematopoetik kök hücrelerin ürünü olan olgun hücrelerde eksikliği söz konusudur. Fluorescent aerolysin testi çok güçlü bir sensitiviteye sahiptir. %0.01 oranındaki paroksismal noktürnal hemoglobinüri klonlarını saptayabilir. Gereç ve Yöntem: Çalışmaya 24 erkek (%60), 16 kadın (%40) toplam 40 hasta alınmıştır. Hastaların ilk tanı bilgilerine göre 4 hastada (%10) Paroksismal noktürnal hemoglobinüri, 11 hastada (%28) Aplastik anemi, 5 hastada (%12) Hemolitik anemi, 12 hastada (%30) Miyelodisplastik sendrom ve 8 hastada (%20) Pansitopeni görülmüştür. Bulgular: Fluorescent aerolysin testi pozitif bulunan hastaların 4 ü (%100) ilk tanıda da paroksismal noktürnal hemoglobinüri iken, 6 hastanın (%55) ilk tanıda Aplastik anemi, 1 hastanın (%20) Hemolitik anemi ve 1 hastanın (%12) ise Pansitopeni olduğu görülmüştür. Fluorescent aerolysin pozitif bulunan 12 hastanın 12 sinde de CD 55 ve CD 59 eksikliği görülürken, 12 hastanın 11 inde Asit Ham testi pozitif olarak elde edilmiştir. CD 55 ve CD 59, paroksismal noktürnal hemoglobinüri tanısında altın standart olarak kabul edildiğine göre Fluorescent aerolysin testi için duyarlılık ve seçicilik değerleri her iki ölçüt için de %100 olarak elde edilmiştir Sonuç: Fluorescent aerolysin testi, Paroksismal noktürnal hemoglobinüri tanısında spesifik tanı yöntemleri arasında klinisyenin en güvenilir kaynaklarından biridir. Anahtar sözcükler: Fluorescent aerolysin, Paroksismal noktürnal hemoglobinüri, Akım sitometri, Anemi, CD55 ve CD59 VI

ABSTRACT The Comparison Of Fluorescent Aerolysin Method With Conventional Diagnosis Techniques In High Risk Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria Patients Background and Aims: Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria which is a clonal disorder of hematopoietic stem cells manifests itself with the classic signs of chronic intravascular hemolysis, bone marrow failure, and thrombosis. Some of the mutant proteins in the cell membrane that connects with the help of the glycophosphatidylinositol anchor product of hematopoietic stem cells are deficient. Fluorescent aerolysin has an excellent sensitivity. It determines Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria clones with the rate of 0.01%. Methods: We have enrolled, 24 male (60%) and 16 female (40%), a total of 40 patients in our study. According to the initial diagnosis of patients, 4 patients (10%) have Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, 11 patients have (28%) aplastic anemia, 5 patients have (12%) hemolytic anemia, 12 patients have (30%) myelodysplastic syndrom and 8 patients (20%) have pancytopenia. Results: Patients, who had positive Fluorescent aerolysin test in the first diagnosis had Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria 4 (100%), while 6 patients (55%) initial diagnosis of aplastic anemia, 1 patient (20%) patients with initial diagnosis of hemolytic anemia, and 1 (12%) of the initial diagnosis pancytopenia observed. All of the 12 patients with positive Fluorescent aerolysin results had CD 55 and CD-59 deficiency, whereas in 11 of 12 patients were Ham positive. CD 55 and CD 59 has been regarded as the gold standard for the diagnosis of Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, the sensitivity and specificity of Fluorescent aerolysin test was 100% for both criteria. Conclusion: Fluorescent aerolysin test is the most reliable sources among of the clinician in the diagnosis Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria of among specific diagnostic methods. Key words: Fluorescent aerolysin, Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, Flow cytometry, Anemia, CD55 and CD59 VII

1. GİRİŞ Paroksismal noktürnal hemoglobinüri (PNH), intravasküler hemoliz ve venöz tromboz ile karakterize, edinsel bir genetik hastalıktır. Totipotent hematopoetik kök hücrelerde oluşan somatik mutasyon ile ilişkili bir bozukluktur. 1 PNH ilk kez 1882 yılında ayrı bir klinik antite olarak tarif edilmiştir. Tanı için kullanılan ilk temel tanı testi 1930'ların sonunda uygulamaya giren Ham testidir. Ham Testi kompleman tarafından lizise uğratılmış eritrositlerin duyarlılığını ölçen bir tanı yöntemidir. 1 PNH her iki cinste de eşit sıklıkta görülür. Hastalığın her yaşta ortaya çıkabildiği bilinmektedir. Ortalama görülme yaşı 42 dir. 1 Hastalık hematopoetik kök hücrenin edinsel, somatik bir mutasyonu sonucu oluşur ve hematopoetik sistemin üç hücre dizisini de etkiler. GPI çapası yardımıyla hücre zarına bağlanan bazı proteinlerin mutant hematopoetik kök hücrelerin ürünü olan olgun hücrelerde eksikliği söz konusudur. 4 Amerika Birleşik Devletleri verilerine göre prevalansın 2-5/1.000.000 olduğu düşünülmektedir. Hastalık yaşamı tehdit edici olup tanıdan sonraki 5 yıl içinde mortalite oranı yaklaşık %35 dir. 7 Hastalık hemolitik ve hipoplastik tip olarak iki ana klinik tabloda kendini gösterir. Hemolitik tipte kronik intravasküler hemoliz bulguları vardır. Hipoplastik tipte ise pansitopeni saptanır; bu hastaların kemik iliği biyopsisinde hipoplastik hatta aplastik bir tablo ile karşılaşılır. Bazen bu iki klinik durum birlikte bulunabilmektedir. 7 Akım sitometrinin yaygın kullanımı ile birlikte PNH eritrositlerinde GPI a bağlı bulunan CD55 ve CD59 in eksikliği gösterilmiştir. Bu anomali periferik kanda granülosit ve lenfositlerde de aynı teknikle ortaya konabilmektedir. 1 Çalışmamızda Çukurova Üniversitesi Dahiliye Hematoloji Bilim Dalında takip edilen klinik ve laboratuvar bulguları ile aplastik anemi, miyelodisplastik sendrom, hemolitik anemi, pansitopeni ve paroksismal noktürnal hemoglobinüri tanısı konulan hastalarda FLAER testinin, diğer laboratuvar parametreleri ile ilişkisini ve klinikte bize göstereceği yönü incelemeye çalıştık. Amacımız; paroksismal noktürnal hemoglobinüri tanısında akım sitometrik yöntemlerin ön plana çıkarılmasıdır. PNH tanısı alan hastalara uygun tedavi başlanacaktır. 1

2. GENEL BİLGİLER 2.1.Paroksismal Noktürnal Hemoglobinüri Tanımı Ve Epidemiyolojisi Paroksismal Noktürnal Hemoglobinüri (PNH) kronik intravasküler hemoliz ile karakterize ilerleyici, yaşamı tehdit edebilen bir hastalıktır. 1,8 Klasik olarak kronik intravasküler hemoliz bulguları, kemik iliği yetersizliği ve trombozla kendini gösteren PNH hematopoetik kök hücrenin klonal bir hastalığıdır. 1,8,12,13,14 PNH son derece nadir bir hastalık olup prevalansın 5,5/1.000.000 olduğu düşünülmektedir. 58 Sıklığın Güney Asya ve Uzak doğu ülkelerinde daha yüksek olduğu bilinmektedir. 1 1866 yılında ilk vaka anemik bir tabakçıda sabah hematürisi ile Londra da Sir William Gull tarafından tanımlanmış. 15 1882 yılında bir sendrom olarak ilk kez alman doktor Paul Strübing tarafından tanımlanmış. 16,17 1911 yılında hemolitik aneminin bu formu karakteristik hemoglobinüri ile birlikte raporlanmış ve Strübing-Marchiafava- Micheli sendromu olarak isimlendirilmiş. 18,19 Şekil 1: Kompleman inhibitörleri CD55 ve CD59 normalde tüm sağlıklı kan hücrelerinin yüzeyinde eksprese edilen iki GPI-çapalı proteindir 1. CD59 adı verilen ve reaktif lizisden sorumlu olan membran inhibitör defektinin hemolizden sorumlu olduğu bildirilmiştir. 1 Geçtiğimiz yıllarda PNH ın patogenezinde altta yatan problemin glikozilfosfatidilinozitol (GPI) molekülleri ile ilgili, N- asetilglukozaminin fosfatidilinositole dönüşümünde sorun olduğu gösterilmiş ve bu 2

aşama için gerekli olan gen PIG-A, PNH hastalarında somatik mutasyona uğradığı bildirilmiştir. 1 Klasik olarak gece hemoglobinürisi ve kronik intravasküler hemoliz bulguları ile kendini gösteren PNH, hematopoetik kök hücrenin klonal bir hastalığıdır. Hastalık hematopoetik kök hücrenin edinsel, somatik bir mutasyonu sonucu oluşur ve hematopoetik sistemin 3 hücre dizisini de etkiler. En tipik bulgu eritrositlerin, komplemanın hemolitik etkisine karşı duyarlı hale gelmesi ve böylece düşük ph da intravasküler hemolizin gelişmesidir 2. Hastalığın tanısında da bu özellikten yararlanılarak asid hemoliz ve sükroz lizis testleri geliştirilmiştir. PNH daki bozukluk, PIG-A olarak adlandırılan ve X kromozomunun kısa kolunda lokalize olan (Xp22.1) genin somatik mutasyonuna bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. 2 Bu bozukluk sonucunda glikozil fosfatidil inozitol (GPI) çapasının oluşumunda bir defekt kendini gösterir. 2 Sonuç olarak GPI çapası yardımıyla hücre zarına bağlanan bazı proteinlerin eksikliği söz konusudur. 2 Şekil 2: C59 Eksikliğinin Kompleman Mekanizmasına Etkisi 3 Son yıllarda akım sitometrinin yaygın kullanımı ile PNH eritrositleri, granülositleri ve lenfositlerinde de GPI a bağlı bulunan CD55 (Decay Accelerating Factor (DAF) ve CD59 (Membrane Inhibitor of Reactive Lysis (MIRL) un eksikliği ve bu eksikliğin ne oranda geliştiği (klon boyutu) gösterilmiştir. 31,32 3

Paroksismal noktürnal hemoglobinüri (PNH), eritrosit membran hasarına bağlı gelişen edinsel bir hemolitik anemidir. Bu hastalıkta eritrosit membran proteinleri CD 55 (DAF; Decay accelerating factor) ve CD 59 (MIRL; Membran inhibitor of reactive lysis) az bulunduğundan komplemanın aracılık ettiği intravasküler hemoliz olmaktadır. Hastalık kronik hemolitik anemi ile karakterize olmasına karşın, seyrinde en önemli komplikasyon olarak, özellikle abdominal venleri etkileyen trombotik olaylar görülebilir. Trombotik hadiseler sıklıkla hepatik, splenik, mezenterik, renal ve portal venlerde görülür. Paroksismal noktürnal hemoglobinüri seyrinde gelişen portal ven trombozunun tedavisinde ve atakların önlenmesinde antikoagülan tedavinin yararlı olduğu bildirilmektedir. 33,34 Temel fizyopatolojik olay eritrositlerin yüzeyinde bulunan proteinlerin anormalliğidir. Söz konusu yüzey protein anormalliği sadece eritrositler için değil, lökosit ve trombositler için de söz konusudur. Hastalıktaki temel defekt hücre membran stabilizitesini sağlayan glikozil fosfotidil inozitol (GPI) çapasının genetik bir mutasyon sonucu instabil hale gelmesidir. Bu patolojik değişime neden olan gen ise X kromozomu üzerinde yer alan PIG-A (fosfotidil glikan sınıf A) genidir. 45,46 Bu mutasyonun kazanılmış bir mutasyon olduğu bilinmektedir. 47 Normal koşullarda membran stabilitesini sağlayan proteinler decay accelerating factor (DAF), homologous restriction factor (HRF) ve membrane inhibitor of reactive lysis (MIRL) dir. PNH lı hastaların hematopoetik hücre membranlarında patolojik olarak kompleman düzenleyici yüzey proteinleri olarak adlandırılan bu proteinler yer almazlar. 47,48 Kompleman düzenleyici yüzey proteinlerinin temel işlevi C3b, C4b ve Membran Atak Kompleksi başta olmak üzere kompleman proteinleri ile ilişkiye girmek ve konvertaz enzimini parçalamaktır. Bu düzenleyici proteinlerin olmadığı PNH hastalarında kompleman sistem kontrolsüz biçimde kronik olarak aktive olmakta; hücre membran hasarı ve intravasküler hemoliz ortaya çıkmaktadır. 48,49 4

Şekil 3: PNH hastalarında hemoliz, NO tüketimine yol açar. Serbest hemoglobin, NO tüketimiyle anlamlı korelasyon gösterir. Hgb indirgenmiş durumdadır ve NO ile reaksiyona girer 6. Şekil 4: LDH, serbest hemoglobin ile anlamlı korelasyon gösterir. LDH ın bir hemoliz biyomarkeri olduğuna işaret etmektedir 6. Hastalarda oluşan damar içi hemoliz sonrasında serbest hemoglobin açığa çıkarak haptoglobulin ile bağlanır. Serbest hemoglobin haptoglobulinin doyurabileceği miktarın üstünde olursa bu hemoglobin dolaşımdaki nitrik oksit (NO) ile bağlanarak artmış NO tüketimine yol açar. 50,51 NO nun organizmadaki temel işlevlerinden biri düz kas tonusunu düzenlemektir. NO eksikliği vazokonstriksiyona ve pulmoner hipertansiyona eğilimi arttırır. Hastalarda görülen karın, baş, sırt ağrıları, erektil disfonksiyon ve özofageal spazmlardan vazokonstriksiyon ve düz kas tonusundaki artış sorumludur. 50 5

Doyurulamayan serbest hemoglobinin dolaşımda artması ve renal atılımı sonucunda tübüllerde biriken hem ve demir önce tübülonekroza ve yıllar içinde kronik böbrek yetmezliğine neden olur. Böbrek hasarının gelişiminden renal ven trombozu da bir ölçüde sorumludur. 47 Tüm PNH hastalarının %64 ünde böbrek hastalığı bildirilmiştir. 5 PNH da tromboz oluşumunun temel patolojisi kesin olarak bilinmemektedir. Bununla beraber açığa çıkan serbest hemoglobin ve buna bağlı NO tüketimi sonucu artmış trombosit aktivasyonunun tromboz gelişiminde temel rol oynadığına inanılmaktadır. 53,54 Tromboz genellikle venöz daha az sıklıkta arteriyaldir. PNH da izlenen tüm trombozların %39 u arteriyaldir. 55 Hemolitik krizlerin belirginleştiği dönemlerde trombotik ataklar da sıklaşabilir. Tromboz gelişim riski granülosit klon büyüklüğünden bağımsızdır. 55 PNH nın önceki yıllarda nonklonal olduğu görüşü egemendi. Ancak son yıllarda hastalığın klonal bir hastalık olduğu anlaşılmıştır. PNH hastalarının çevre kanında ve kemik iliği hücrelerinde GPI çapası pozitif (normal) ve negatif hücrelerin (PIG-A mutant) oluşturduğu mozaik bir yapı vardır. Bu mozaik yapı içinde yer alan mutant ve normal hücrelerin oranı hastalığın seyrinde de etkili olabilir. PIG-A mutant hücrelerin yüksek oranda olması GPI yüzey proteinlerine karşı oluşan immun yanıtın neden olduğu kemik iliği yetmezliği durumunda hematopoezin sürdürülmesi için bir avantaj oluşturabilir. 56,47 PIG-A mutant hücreler büyük olasılıkla sağlıklı bireylerin hematopoetik hücrelerinde de bulunmaktadır. Ancak bu hücrelerin PNH da olduğu gibi klonal bir ekpansiyonundan söz edilemez ve oranları düşüktür. 56 Yapılan çalışmalar PIG-A mutant hücrelerin Aplastik Anemi (AA) hastalarında %68, MDS hastalarında ise %42 ye kadar artabileceğini ortaya koymuştur. 57 2.2.Klinik Paroksismal Noktürnal Hemoglobinüri (PNH) nadir görülen, kronik intravasküler hemoliz ile karakterize ilerleyici, yaşamı tehdit edebilen bir hastalıktır. Paroksismal olduğu söylense de aslında hemoliz süreklidir ve gündüz saatlerinde de devam eder. Akşamları hemolizin belirgin hale gelmesi ve idrar renginin genellikle sabahları koyu renk alması yüzünden adının başına noktürnal sözcüğü eklenmiştir. 52 6

Öte yandan hemoglobinüri de tüm hastalarda görülmemekte ve ilk başvuru sırasında hastaların sadece %26 sında bulunmaktadır 8. Dolayısıyla, PNH ın isminin bile kliniği tam olarak yansıtmadığı söylenebilir. Paroksismal, Noktürnal ve Hemoglobinüri kliniği olmadan da PNH semptomları gözlenebilir. 5 PNH nın bilinen tiradı aşağıdaki gibidir 52 : 1. Komplemana aşırı duyarlılık sonucu oluşan intrakorpuskuler hemoliz 2. Büyük venöz damarlarda ortaya çıkan trombozlar 3. Pansitopeni Hastalık hemolitik ve hipoplastik tip olarak iki ana klinik tabloda kendini gösterir: 7 Hemolitik tipte kronik intravasküler hemoliz bulguları vardır. Hipoplastik tipte ise pansitopeni saptanır. Bu hastaların kemik iliği biyopsisinde hipoplastik hatta aplastik bir tablo ile karşılaşılır. Bazen bu iki klinik durum birlikte bulunabilmektedir. 7 Öte yandan aplastik anemi tanısıyla izlenen hastaların bir kısmında yıllar içinde PNH gelişebildiği de bilinmektedir. Hastalar çoğu kez pansitopeni ve özellikle anemiye bağlı belirti ve bulgularla hekime başvururlar. İdrar renginde ani koyulaşma diğer bir başvuru nedenidir. Nadiren venöz sistemde ortaya çıkan trombotik olaylar ilk klinik bulgu olabilir. 7 Pansitopeni saptanan bir hastada retikülositoza laktat dehidrogenaz (LDH) enzim yüksekliği de eşlik ediyorsa muhakkak PNH yönünden araştırılmalıdır. 2 2.2.1.Klasik PNH Hastalarının klinik belirtilerine bakıldığında; intravasküler hemoliz (retikülositoz, anormal derecede yüksek serum laktat dehidrogenaz ve indirekt bilirubin, buna karşın serum haptoglobulin anormal düşük konsantrasyon) ancak başka tanımlanan kemik iliği anormalliği gözlenmez. Eritroid hiperplazi ve normal iliğe yakın 7

normal morfoloji, ancak tesadüfi olmayan karyotipik anormallikler klasik PNH ile uyumludur. 8 2.2.2.Başka Bir Kemik İliği Hastalığı Zemininde Gelişen PNH Bu alt kategorideki hastaların klinik ve laboratuvar bulgularında hemoliz varlığı saptanırken aynı zamanda eş zamanlı olarak, tanımlanmış kemik iliği anormalliği bulunur. Kemik iliği analizi ve sitogenetik yöntemler PNH ın aplastik anemi, miyelodisplastik sendrom (MDS) ya da diğer miyelopati (örneğin, miyelofibroz) ile birlikte olup olmadığını belirlemek için kullanılır. Kemik iliği anormalliğini saptamak için standart kriterler kullanılır (örneğin: aplastik anemi, MDS, ya da miyelofibrozis). Tesadüfi olmayan kromozomlarda anomali bulma, belirli bir kemik iliği anormalliği ile ilişkili (örneğin, kromozom anormallikleri diagnostik katkıda bulunabilir 5q, 7 ve 20q) tanıyı koymada yardımcı olmaktadır. 8 PNH ya bağlı semptomların genellikle non-spesifik olması ve hastalığın oldukça nadir görülmesi nedeniyle tanı 1-10 yıl süreyle gecikebilir. 1 Klinik bulgular değişkendir. 5 80 PNH hastasının değerlendirildiği çalışmada ilk başvuru sırasında görülen semptom ve bulgular: 8 Anemi semptomları %35 Hemoglobinüri %26 Hemorajik semptom ve bulgular %18 Aplastik anemi %13 Gastrointestinal semptomlar %10 Hemolitik anemi ve sarılık %9 Demir eksikliği anemisi %6 Tromboz veya emboli %6 İnfeksiyonlar %5 Nörolojik semptom ve bulgular %4 8

Hastalarda hemosiderin idrar sedimentinde hemen her zaman görülür ve böbreklerde birikimi MRI veya BT taramasında da farkedilebilir. Hastalarda hepatosplenomegali olmaksızın düşük haptoglobulin ve retikülositozis gibi hemoliz bulgularının varlığı uyarıcıdır. 59 Kemik iliği incelemesinde eritroid hiperplazi ve demir depolarının boşaldığı izlenir. Azalmış demir depoları intravasküler hemoliz sonrası idrar yoluyla atılan demir kaybı sonucu ortaya çıkar. Anemi retikülositoz ile beraberdir. Kemik iliği hipoplastik olabilir ve çoğu kez morfolojik bulgular aplastik anemiye benzer. Hipoplastik kemik iliği saptanan hastalarda nötropeni ve trombositopeni de anemiye eşlik eder. 59 Trombozun neden olduğu klinik durumların en önemlilerinden biri Budd-Chiari sendromudur. Hastalık seyri sırasında oluşan hepatik ven trombozu kimi zaman ani ve son derece ağırdır ve ölümcül olabilir. Yavaş seyirli ve sinsi formları karaciğer yetmezliği ile sonlanabilir. PNH lı hastalarda abdominal ve serebral ven trombozu açısından da her zaman dikkatli olmak gerekir. Dermal ven trombozu ağrılı, kırmızı nodüller ile kendini belli eder. Bu hastalarda deri nekrozları nadiren ortaya çıkar. 59 PNH hastalarında böbrek fonksiyon bozukluğu bir diğer önemli sorun olup trombotik olaylardan sonra ikinci sık ölüm nedenidir. Bu hastaların %64 ünde renal yetmezlik geliştiği, bu olguların %21 inde ise 10 yıllık takip sonucunda son dönem böbrek yetmezliğinin ortaya çıktığı bildirilmiştir. 60 Bir hastada hemoglobinüri, açıklanamayan hemoliz, makrositoz, açıklanamayan sitopeni, açıklanamayan tromboz veya kemik iliği yetersizliği bulguları varsa hasta mutlaka PNH açısından araştırılmalıdır. 10 PNH düşünülen bir hastanın ayırıcı tanısında Paroksismal soğuk hemoglobinürisi ve diğer hemolitik anemi yapan nedenler ile arteriyal ve venöz oklüzyon yapan patolojiler göz önünde tutulmalıdır. 59 2.3.Tanı Hastalığın tanısının konabilmesi için öncelikle klinisyenin PNH yı ayırıcı tanıda aklına getirmesi gereklidir. Hemoliz, sitopeniler ve tromboz varlığı veya öyküsü hekim için uyarıcı olmalıdır. Klasik PNH olgularında hemoliz ve artmış serum LDH düzeyleri daima beklenen bulgulardır. Bu nedenle Coombs negatif veya daha doğru bir deyişle sferositik olmayan hemolitik anemi varlığında şistositler veya belirgin infeksiyon 9

bulguları da yoksa hemoglobinüri eşlik etsin veya etmesin PNH dan şüphe edilmelidir. Böyle bir olguda bulgulara trombozun, demir eksikliğinin ve/veya sitopenilerin eklenmesi PNH şüphesini artırmalıdır. 7 Aplastik anemili (AA) olgularda daha tanı sırasında düşük de olsa bir PNH klonu tespit edilebilmektedir. İmmunosupresif tedavi görenlerde takip sırasında bu PNH klonu artabilmekte ve klasik PNH klinik bulguları gelişebilmektedir. Yapılan araştırmalar PNH klonu tespit edilen AA lı olgularda immunosupresif tedavi başarısının daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Bu nedenle AA da tanı sırasında PNH klonu araştırılması önemlidir. Bu hastaların takibinde de LDH ve retikülosit sayımı rutin olarak istenmeli, şüphe halinde PNH klonu araştırılmalıdır. AA lı hastalarda 6 ay veya 1 yıl aralarla PNH klonu varlığının düzenli olarak kontrol edilmesi önerilir. 7 Miyelodisplastik sendromlu (MDS) bazı hastalarda PNH klonu varlığı bildirilmiştir. PNH klonu gösterilen hastaların tamamı refrakter anemili olgular olması sebebiyle sadece refrakter anemili MDS hastalarında şüphe varlığında PNH klonu araştırılması önerilir. 7 Üçüncü önemli endikasyon alışılmadık yerlerde venöz tromboz gelişen olgulardır. Bu şekilde trombozları olan bir PNH olgusunda klinik tabloya hemen daima hemoliz ve/veya sitopeni bulguları eşlik eder. PNH da arteryel trombozlar görülse de hastalık genellikle venöz sistemde trombozlarla seyreder. Bu nedenle başka klinik veya laboratuvar bulgu olmaksızın tek başına arteryel tromboz varlığı PNH yönünden araştırmayı gerektirmez. 7 2.3.1.Tanı İçin Gerekli Testler PNH tanısı zor hastalıklar arasındadır. PNH nın tanısında kullanılan eski test Asit Ham testidir. Bu testte eritrositler, asidifiye edilmiş serum ile inkübe edilir. Böylece alternatif yolla kompleman aktivasyonu ortaya çıkar ve PNH hücreleri lizise uğrar. 49 Ancak ne yazık ki, bu test spesifik ve duyarlı olmayan bir testtir ve standardı yoktur. 5 Test manuel olarak yapılmakta, yapan kişinin tecrübesi, laboratuvar koşulları ve uygulama tekniği gibi subjektif koşullardan direkt olarak etkilenmektedir. Ancak, tarihi öneminden dolayı günümüzde halen bir çok hekim ve klinik tarafından 10

kullanılmaya devam edilmektedir. Testin uluslararası tanı kılavuzları tarafından sensitivite ve spesifitesinin düşük olması nedeniyle artık önerilmediği bilinmelidir. Günümüzde akım sitometri PNH lı eritrosit ve granülositlerdeki anormal PNH klonunu teşhis etmekte oldukça yararlıdır. Son yıllarda kabul gören temel görüş, granülosit klonunu değerlendirmenin eritrosit klonunu değerlendirmekten çok daha değerli olduğudur. Çünkü eritroid seri hücrelerde mevcut PNH klonunun değerlendirmesi damar içi hemoliz ve eritrosit transfüzyonu gibi faktörler yüzünden nesnel olmayabilir. 10,59,61 Akım sitometrik olarak hücrelerde CD59 (MIRL), CD55 (DAF) ekspresyonunun olmadığının gösterilmesi tanı için önemlidir. Doğru değerlendirme için CD55 ve CD59 yüzey antijenlerinin birlikte çalışılması gerekmektedir. 59,61 Akım sitometrik değerlendirmede ideal olarak çevresel kan kullanılır. 5 Akım sitometride kullanılan Floresean aerolizin (FLAER) de günümüzde kullanılan testlerden biridir. 24,59,61 Bu testin esası akım sitometrik ölçüm sırasında FLAER in GPI çapasına spesifik olarak bağlanmasına dayanır. FLAER in granülositlere bağlanmasındaki yetersizlik, PNH tanısı için çoğu zaman yeterli olmaktadır. Ancak kliniğin AA ile beraber olduğu ve granülosit sayısının azaldığı durumlarda değerlendirme zorlaşabilir. 24 Klinik Sitometri Derneği Kılavuzlarında PNH Açısından Akım Sitometri İle Değerlendirilmesi Önerilen Hasta Grupları: 10 Hemoglobinüri veya artmış plazma hemoglobin kanıtı ile intravasküler hemoliz Aşağıdakilerden birine eşlik eden açıklamayan hemoliz: o Demir eksikliği, o Karın ağrısı veya ösefagus spazmı, o Tromboz (aşağıya bakınız), o Granülositopeni ve/veya trombositopeni o Diğer edinsel coombs-negatif, non-şistositik, enfeksiyöz olmayan hemolitik anemi o Olağandışı özellikleri olan tromboz: o Beklenmeyen bölgelerde tromboz 11

o Hepatik venler (Budd-Chiari sendromu) o Diğer intra-abdominal venler (portal, splenik) o Serebral sinüsler o Dermal venler o Eşlik eden hemolitik anemi bulguları (yukarı bakınız) o Açıklanamayan sitopeni o Kemik İliği Yetmezliği Kanıtı: o Şüpheli veya kanıtlanmış aplastik veya hipoplastik anemi o Unilineage displazili refrakter sitopeni o Yeterli araştırmaya rağmen sebebi açıklanamayan diğer sitopeniler PNH hastalarında serum LDH ve retikülosit sayısında artış, haptoglobulin değerinin kimi hastalarda 0 (sıfır) noktasına kadar azalması, hemoglobinüri ve hemosiderinüri varlığı saptanabilir. Hastalarda lökosit alkalen fosfataz düzeyi düşüktür. Ancak bu konvansiyonel testler PNH tanısı için spesifik olmakla beraber tanı koydurucu olarak kabul edilmemektedir. 61 PIG-A gen mutasyonunun varlığının gösterilmesi gündelik pratik içinde genellikle pek mümkün değildir. 5 Akım sitometrisinin yaygın kullanımı ile birlikte PNH lı eritrositler üzerinde GPİ ile membrana bağlı bulunan CD55 ve CD59 un eksikliği gösterilmiştir. PNH klonu periferik kanda granülosit ve lenfositler üzerinde de aynı teknikle ortaya konabilmektedir. Akım sitometri ile granülositlerdeki defekt daha erken (hemolizden de önce) saptanabilmektedir. 7 Şekil 5: Bir Akım sitometri görüntüsü GPİ çapası yardımıyla hücre membranına bağlanan proteinlerdeki eksikliğin akım sitometrik yöntemle ortaya konulması PNH tanısı için altın standarttır. Eritrositlerde artmış kompleman hassasiyetini ölçen ve uzun yıllar PNH tanısında 12

kullanılmış olan asit hemoliz ve sükroz lizis gibi yöntemlerin günümüzde tanı değeri düşüktür. Bu nedenle kullanılmalarına gerek yoktur. Son zamanlarda spesifik olarak GPİ çapasına bağlanan FLAER (fluorescent aerolysin) kullanılarak lökositlere GPİ ile bağlı antijenler belirlenebilmektedir. 7 Akım Sitometrik İnceleme Akım sitometride hücrenin büyüklüğü, hücrenin içyapısı ve hücrede incelemek istediğimiz antijene ait işaretlediğimiz monoklonal antikorun floresansı ölçülmektedir. 9 Akım sitometrik inceleme özellikle çevresel kan örneği ile yapılmalıdır. Genç hematopoetik hücrelerde GPİ çapa proteinlerinin ekspresyonları düşük olduğundan kemik iliği örneklerinde inceleme önerilmez. Akım sitometrik incelemede en sık kullanılan monoklonal antikorlar anti-cd59 ve anti-cd55 tir. Nadir olan konjenital eksiklikleri dışlayabilmek için genellikle en az iki antikorun birlikte kullanılması önerilir. Çeşitli çalışmalarda iki farklı hücre dizisinde bu incelemenin yapılması önerilmekle birlikte en önemli hücre dizisi nötrofillerdir. Nötrofiller, monositler ya da eritrositler birlikte değerlendirilebilir. 7 PNH da CD55 ve CD59 ekspresyon düzeyi için belirli bir eşik değer tanımlanmamıştır. Ancak nötrofillerde %10 un altında bir PNH klonu varlığında belirgin hemoliz gözlenmediği bilinmektedir. Yine de klon büyüklüğü %1 olan hastaların PNH semptomları açısından takip edilmesi gerekmektedir 7. Akım sitometri ile hücrelerin eksprese ettikleri antijenlere karşı monoklonal antikorlar kullanılarak kan ya da kemik iliği gibi karışık populasyonda belli bir hücrenin belirlenmesi ve ayrılması yapılabilir. 27 İmmünofenotiplemenin tıpta kullanım alanları: 37,38,39,40 Lenfoma ve lösemi immünofenotiplemesi (KLL, ALL, AML, KML) Hematolojik hastalıkların belirlenmesi (ITP, nötrofil fonksiyon defektleri) İmmün yetmezliklerin teşhisi Kemoterapi etkinliğinin izlenmesi Otoimmün hastalıkların tanısı Transplantasyon öncesi ve sonrası hasta durumunun gözlemlenmesi Allerjik hastalıklarda 13

Günümüzde en sık lösemi, lenfoma ve miyelom hastalarında kullanılır. Lösemi immünofenotiplemesinde en sık kullanılan örnekler kan ve kemik iliğidir. Sağlıklı bir insan ile lösemili bir insanın kan örnekleri arasında dramatik farklılıklar mevcuttur. Sağlıklı insanlarda kan profili kesindir ve bilinir. Ancak lösemili hastalarda profil çok değişkendir. Bu alanda kök hücre çalışmalarında özellikle akım sitometrik analizlerle tedaviler yönlendirilebilmektedir. 41 FLAER Tekniğinin Avantajları Sitometrik akım tekniği, defektli hücrelerde bulunan GPI genine bağlı proteinleri belirlemede tercih edilen yöntemdir ancak her ne kadar PNH tanısı için gerekli olsa da, tutulmuş hücreleri tesbit etmek için kullanılan standart bir metodoloji bulunmamaktadır. GPI antijenleri için en uygun saptama yönteminin FLAER olduğuna dair kanıtlar her geçen gün artmaktadır. 10 FLAER çok güçlü bir sensitiviteye sahiptir. %0.01 oranındaki PNH klonlarını saptayabilir. Diğer bir avantajı defektli ve normal kan elemanları ayırımını çok net yapması ve lizise neden olmamasından gelir. 10 Şekil 6: FLAER ile PNH klonlarının saptanması 11 FLAER küçük anormal granülositlerin saptanmasında CD59 dan daha hassas belirleme özelliğine sahiptir. FLAER, PNH hastalarında GPI çapasının tesbitinde oldukça avantajlı görünse de, FLAER PNH daki eritrosit klonlarını değerlendirmek için 14

kullanılamaz. Çünkü eritrositlerin yüzeyinde Proaerolysin ile işlenebilecek proteolitik enzimler bulunmaz. PNH için basit FLAER testleri yeterli olabilirken, aplastik anemi ve miyelodisplazi gibi PNH klonlarının nadir gözlendiği durumlarda daha sofistike yaklaşımlar geliştirilmektedir. 11 PNH veya akut lösemi hastalarında, pansitopeni olabileceğini göz önüne alarak sitometri verilerini çok dikkatli değerlendirmek gerekmektedir. İncelenen materyalde blastların olması hatalı bir şekilde PNH tanısını düşündürebilir. FLAER analizinde, non PNH hematolojik anormallikler tesbit edildiğinde anormal blast varlığını konfirme etmek için kan örneği alınıp bakılmalıdır. FLAER in, multiparametreli akım sitometrisi ile birlikte kombine edilmesi tanı için daha geniş imkanlar sağlamaktadır. Aynı zamanda PNH klonlarının farklı açılardan izlenmesi şüphelenilmeyen miyeloproliferatif hastalıkların saptanmasında yardımcı olabilir. 11 2.4.Tedavi PNH ın klasik tedavi yöntemleri arasında folik asit, demir, eritrosit transfüzyon desteği, kortikosteroidler, androjen hormonlar, antikoagülanlar ve eritropoezi stimule eden ajanlar yer almaktadır. Bu tedavi yöntemleri kesin kür sağlamadığı gibi uzun süreli kullanımda ciddi yan etki riskleri taşımaktadır. 8,53,62 Ciddi ve sık hemolitik kriz öyküsü olan hastalarda folik asit takviyesi mutlaka yapılmalıdır. Belirgin ve sabit biçimde hemosiderinüri izlenen hastalarda demir eksikliği gelişmesi doğaldır. Genel olarak demir replasman tedavilerinin hemolitik krizleri tetikleyebileceği düşünülse de oral demir tedavilerinin iyi tolere edildiği ve demir eksikliğine bağlı olarak aneminin derinleşmesini önlediği gösterilmiştir. Bu nedenle semptomatik hastalarda demir replasman tedavisi düşünülebilir. Eritrosit transfüzyon desteği PNH hastaları için önemlidir. 59 İnfeksiyonlar kompleman aktivitesini artırdığından PNH hastalarında önemli sorun yaratırlar. Bu hastalarda infeksiyon ile tetiklenen hemoliz hemoglobin değerlerinde ani düşmelere neden olabilir. 59 Kortikosteroid kullanımı kompleman aktivitesinde azalmaya neden olarak hemolizi önleyebilir veya azaltabilir. Ancak steroid tedavisi ile elde edilen yanıt genellikle tatmin edici değildir. Kortikosteroid dozunun 15

ciddi PNH olgularında belirgin biçimde artırılması gerekebilir. Ancak ciddi yan etkiler nedeniyle yüksek doz ve uzun süreli steroid tedavi genellikle önerilmez. 61 PNH da tüm ölümlerin %40 ila 67 si tromboz nedeniyledir. 53 INR değeri 2-3 arasında olacak biçimde etkin warfarin proflaksisi ile tromboz riski önemli ölçüde azalmaktadır. 63 Ancak bu korumanın kanama riskini de artırabileceği akılda tutulmalıdır. Yapılan çalışmalar aspirin proflaksisinin etkin olmadığını göstermektedir. 60 PNH hastalarında tromboz geliştiğinde uygulanacak antikoagülan tedavi klasik tedaviden farksızdır. 5 PNH da son yılların en popüler tedavisi eculizumab tedavisidir. Eculizumab etkisini kompleman C5 seviyesinde terminal kompleman blokajı yaparak gösteren humanize bir monoklonal antikordur. Yapılan klinik çalışmalar, eculizumab kullanımının PNH lı hastalarda intravasküler hemolizi hızla engellediğini ortaya koymaktadır. 61,64,65 Sağlıklı kişilerle karşılaştırıldığında PNH lı hastalarda 10-20 kat daha yüksek olan LDH düzeyi eculizumab tedavisi sonrası ilk dozdan itibaren normal seviyelere inmekte, intravasküler hemoliz bulguları gerilemektedir. Tedavi ile hastalarda karın ağrısı azalır, letarjik hal hızla düzelir. Bunlara ek olarak eritrosit transfüzyon gereksinimi de belirgin azalır veya yok olur. 59,61,64,65 Eculizumab aynı zamanda tromboz riskinde de azalmaya neden olur. Yapılan çalışmalar, riskin eculizumab kullanan hastalarda 5-10 kat azaldığını göstermektedir. 53,61 Dahası öyküsünde tromboz olduğundan warfarin tedavisi alan ancak bu tedavi altında yine de trombotik atak görülen hasta sayılarında da eculizumab sonrası belirgin azalma izlenmiştir. 53 Diğer taraftan eculizumab böbrek fonksiyonlarının korunmasına ve bazı hastalarda düzelmesini sağlarken pulmoner hipertansiyona bağlı semptomları da ortadan kaldırabilir. 66,67 Dolayısıyla PNH klonu sınırda olan ve şiddetli hemolizi olan hastalarda eculizumab önemli bir tedavi seçeneği oluşturur. 53 Eculizumab tedavisi ilk 4 dozu 7±2 günde bir kez 600 mg ve 5. Haftadan itibaren 14±2 günde bir kez 900 mg olarak uygulanır. İlaç kompleman sistemi bloke ederek etki gösterdiğinden başta Neisseria meningitidis olmak üzere Streptococcus pneumoniae ve Haemophilus influenzae gibi kapsüllü bakterilere bağlı enfeksiyon riskini artırabilir. Bu nedenle ilaç öncesi hastaların tetravalan meningokok aşıları ile aşılanması gerekmektedir. 10,64,65 Aşılanmış hastalarda yıllık neisseria sepsis riski %0,5 dir. 61 16

Allo-HKHN hastalığın tek küratif tedavisi olmasına karşın yüksek mortalite riskine sahiptir. 68 Uluslararası PNH Araştırma Grubu (International PNH Interest Group) nun çalışmaları allo-hkhn tedavisinin sonuçları ile ilişkili oldukça değerli bilgiler sunmaktadır. 66 Singeneik ikizlerden hazırlama rejimi uygulamadan yapılan 7 allo-hkhn uygulamasından 4 ü başarısız olmuştur. Deneyimler hastalarda myeloablatif bir hazırlama rejimi kullanmanın gerektiğini göstermektedir. Tam uyumlu vericiden yapılan allo-hkhn sonrası 5 yıllık sağ kalım %58-75 arasında değişmektedir. Azaltılmış yoğunlukta HKHN veya mini allo-hkhn tedavisi bu oranları daha da iyileştirebilir. 64 Allo-HKHN ile elde edilen deneyimlerde morbidite ve mortalite oranları yüksek olduğundan allo-hkhn nin sadece seçilmiş hastalarda uygulanması hâkim görüştür. Allo-HKHN tedavisini yaşamı tehdit edici sitopenileri olan veya eculizumab ile kontrol edilemeyen ve engellilik yaratan hemoliz veya trombozu olan hastalara uygulanmasını önerenler vardır. 61 PNH da günümüzde kür sağlayabilen tek tedavi yöntemi allojenik kök hücre nakli (Allo-KHN) dir. Allo-KHN nin HLA doku grubu uygun vericilerle yapılsa dahi nakille ilişkili ciddi morbidite ve mortalite görülmesi nedeniyle gerçekten çok gerekli ve seçilmiş hastalarda başvurulacak bir tedavidir. 1,34,36 2.5.Prognoz Nadir görülmesi nedeniyle epidemiyolojik veriler çok net olmamakla beraber tanıdan sonraki 5 yıllık mortalite %35 olup, ortalama yaşam süresi yaklaşık 10 yıl olarak kabul edilmektedir. 1 10 yıldan uzun süreyle sağ kalabilen hastalarda spontan remisyon şansı %34 dür. PNH klonu küçük olan hastalarda da yaşam süresi 22 yıla kadar yükselmektedir. 1 Yakın zamanda yayımlanan ve eculizumab ile yapılan uzun süreli sağkalım çalışması sonucu eculizumab ile tedavi edilen PNH hastalarının 8 yıl sonunda sağkalım oranlarının yaş ve cinsiyeti aynı olan sağlıklı bireyler ile benzer; PNH lı hastalardan ise 7 yıl sonunda istatistiksel olarak anlamlı şekilde daha yüksek olduğu gösterilmiştir. 67 Klinik seyirleri her ne kadar farklı olsa da AA bileşeni ön planda olan PNH hastaları ile klasik PNH hastalarının prognozları arasında önemli bir değişiklik olduğunu söylemek pek mümkün değildir. 53 PNH da esas ölüm nedeni akut gelişen 17

trombozdur. Bununla beraber böbrek yetmezliği, pulmoner hipertansiyon, kemik iliği yetmezliği ve enfeksiyonlar ölüme neden olabilir. Lösemik dönüşüm çok nadirdir. 69 18

3.GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Hasta Seçimi Bu çalışmaya Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Dahiliye Hematoloji Bilim Dalında 2010 ve 2012 tarihleri arasında takip edilen 24 ü erkek, 16 sı kadın olmak üzere toplam 40 hasta dahil edildi. Çalışmanın başlangıcında Çukurova Üniversitesi Etik Kurulu ndan onay alındı. Hastalardan yazılı onam alındı. Hastaların anamnezleri alındı. Hastalara tam fizik muayene yapıldı. Tüm hastalardan biyokimyasal tetkikler için venöz kan örnekleri alındı. Çalışmaya dahil edilen tüm olgularda tam kan sayımı (lökosit, hemoglobin, hematokrit, MCV, platelet), retikülosit, direk coombs testi, indirek coombs testi, ferritin, demir, TIBC, folat, B12, BUN (Kan Üre Azotu), Cr (Kreatinin), AST (Aspartat Amino Transferaz), ALT (Alanin Amino Transferaz), LDH (Laktat Dehidrogenaz), total bilirubin, direk bilirubin düzeyleri, HbsAg, AntiHbs, AntiHCV çalışıldı. Periferik yaymalar hematoloji bölümü tarafından değerlendirildi. Hastalara kemik iliği aspirasyon ve biyopsisi yapıldı. İdrarda hemosiderine bakıldı. Asit Ham testi yapıldı. Akım sitometrik yöntemle CD55 ve CD59 düzeyine bakıldı. FLAER testiyle PNH klonu araştırıldı. Çalışmamızda kullandığımız kitler tez için bağış olarak alındı. Hastalara USG ve Portosplenik Renkli Doppler USG yapıldı. 3.2.İstatistiksel Değerlendirme Verilerin istatistiksel analizinde SPSS 19.0 paket programı kullanıldı. Kategorik ölçümler sayı ve yüzde olarak, sayısal ölçümlerse ortalama ve standart sapma (gerekli yerlerde ortanca ve minimum - maksimum) olarak özetlendi. Kategorik ölçümlerin FLAER sonuçları arasında karşılaştırılmasında Ki Kare test istatistiği kullanıldı. FLAER sonuçları arasında sayısal ölçümlerin karşılaştırılmasında varsayımların sağlanması durumunda Bağımsız gruplarda T testi (Student s T test), sağlanmaması 19

durumunda ise Mann Whitney U testi kullanıldı. Tüm testlerde istatistiksel önem düzeyi 0.05 olarak alındı. 20

4.BULGULAR Çalışmaya 24 erkek (%60), 16 kadın (%40) toplam 40 hasta alınmıştır. Hastaların yaş ortalamaları 39±14,7 yıl olarak elde edilmiştir. Hastaların ilk tanı bilgilerine göre 4 hastada (%10) PNH, 11 hastada (%28) Aplastik anemi, 5 hastada (%12) Hemolitik anemi, 12 hastada (%30) MDS ve 8 hastada (%20) Pansitopeni görülmüştür. Hastaların hastalık süresi ortalaması 62,1±74,4 ay olarak elde edilmiştir. Tablo 1. Hastaların demografik özellikleri ve ilk tanı bilgileri Ölçümler Özet Ölçüt* Cinsiyet Erkek Kadın Yaş İlk tanı PNH Aplastik anemi Hemolitik anemi MDS Pansitopeni Hastalık süresi 24 (%60) 16 (%40) 39±14,7 34,5 (19-87) 4 (%10) 11 (%28) 5 (%12) 12 (%30) 8 (%20) 62,1±74,4 24 (1-264) * Özet ölçüt, cinsiyet ve tanı için sayı (yüzde), yaş ve hastalık süresi için ortalama±s.sapma, medyan (min-maks) olarak verilmiştir. Hastaların hemoliz parametreleri incelendiğinde, retikülosit ortalaması 3,72±5,55; LDH ortalaması 788,4±1371,8; indirekt bilirubin ortalaması 1,42±1,58 olarak elde edilmiştir. Hastaların hiç birinde coombs testi pozitif değilken, 7 hastada (%17) idrarda hemosiderin görülmüştür. 21

Tablo 2. Hastaların hemoliz parametreleri Ölçümler Retikülosit LDH Özet Ölçüt* 3,72±5,55 2,1 (0,02-34) 788,4±1371,8 243 (76-7334) Coombs testi Negatif 40 (%100) İdrarda hemosiderin Negatif Pozitif İndirekt bilirubin 33 (%83) 7 (%17) 1,42±1,58 0,85 (0,2-7,1) * Özet ölçüt, coombs testi ve idrarda hemosiderin için sayı (yüzde), diğer ölçümler için ortalama±s.sapma, medyan (min-maks) olarak verilmiştir. Tablo 3. Hastaların PNH test sonuçları Ölçümler Sayı (%) CD55 ve CD59 düzeyi Normal Eksik Asit Ham Testi Negatif Pozitif FLAER Negatif Pozitif 28 (%70) 12 (%30) 29 (%72,5) 11 (%27,5) 28 (%70) 12 (%30) Hastaların takipleri sırasında tekrar edilen PNH testleri sonucunda ilk tanıda PNH tanısı almış 4 hastaya ilave olarak toplam 12 hastada (%30) CD 55 ve CD 59 düzeyi düşük, yine aynı 12 hastanın FLAER test sonucu pozitif, 11 hastanın ise Asit Ham testi pozitif olarak elde edilmiştir. 22

Tablo 4. Hastaların anemi ile ilgili ölçümleri Ölçümler Hemoglobin Hematokrit Platelet MCV Demir TIBC B12 Folat Ferritin Ortalama±SSapma Medyan (Minimum-Maksimum) 8,14±1,55 8,25 (3,6-11,3) 24,04±4,65 24,15 (10,6-33) 116975±101180,4 84500 (3400-410000) 87 ±12,6 86 (60-114) 117,8±69,5 107,5 (7-286) 289,5±72,1 288 (158-538) 361,6±285,2 278 (95-1380) 15,9±32,3 8,1 (2-200) 604,1±968,7 226,5 (1,7-3879) Hastaların anemi ile ilgili ölçümleri yukarıdaki tabloda sunulmuştur. Beklendiği üzere tüm hastalarda hemoglobin ve hematokrit değerleri normal değer aralıklarının altında ölçülmüştür. Hastaların hepatit markerları incelendiğinde ise, tüm hastalarda HbsAg ve Anti HCV negatif iken, AntiHbs pozitif olarak elde edilmiştir. 23

Tablo 5. Hastaların kemik iliği biyopsi sonuçları Ölçümler Özet Ölçüt Kemik iliği biyopsi Normoselüler ilik dokusu Hiposelüler ilik dokusu Hiperselüler ilik dokusu Kabul etmemiş 12 (%30) 12 (%30) 11 (%28) 5 (%12) Hastaların kemik iliği biyopsi sonuçları incelendiğinde, 12 hastada (%30) normoselüler ilik dokusu, 12 hastada (%30) hiposelüler ilik dokusu, 11 hastada (%28) hiperselüler ilik dokusu elde edilmiştir. 5 hasta ise (%12) biyopsi yapılmasını kabul etmemiştir. Hastaların diğer laboratuvar sonuçları aşağıdaki tabloda sunulmuştur. Bu tabloya göre 3 hastada (%7) portal ven trombozu, 2 hastada ise (%5) Buddchiari pozitifliği görülmüştür. 24

Tablo 6. Hastaların diğer laboratuvar sonuçları Ölçümler Lökosit Total bilirubin Direkt bilirubin BUN Kreatinin AST ALT Portal ven trombozu Negatif Pozitif Budd Chiari Negatif Pozitif Özet Ölçüt 3548,2±2252,9 2865 (600-11700) 1,7±1,66 1,1 (0,3-7,4) 0,28±0,25 0,2 (0,1-1,3) 13,4±6,91 12,5 (4-37) 0,67±0,26 0,6 (0,3-1,6) 35,5±33,9 23 (12-188) 27,2±19 19,5 (7-85) 37 (%93) 3 (%7) 38 (%95) 2 (%5) * Özet ölçüt, PVT ve Budd Chiari için sayı (yüzde), diğer ölçümler için ortalama±s.sapma, medyan (min-maks) olarak verilmiştir. FLAER testi pozitif bulunan hastaların 4 ü (%100) ilk tanıda da PNH iken, 6 hastanın (%55) ilk tanıda aplastik anemi, 1 hastanın (%20) ilk tanıda hemolitik anemi ve 1 hastanın (%12) ise ilk tanıda pansitopeni olduğu görülmüştür. FLAER pozitif bulunan 12 hastanın 12 sinde de CD 55 ve CD 59 eksikliği görülürken, 12 hastanın 11 inde Asit Ham testi de pozitif olarak elde edilmiştir. CD 55 ve CD 59, PNH tanısında altın standart olarak kabul edildiğine göre FLAER testi için duyarlılık ve seçicilik değerleri her iki ölçüt için de %100 olarak elde edilmiştir. 25

Tablo 7. Hastaların ilk tanılarına göre FLAER sonuçları ve FLAER sonuçlarının diğer PNH tanı testleri ile karşılaştırılması FLAER Ölçümler Negatif Pozitif Sayı (%) Sayı (%) İlk tanı PNH Aplastik anemi Hemolitik anemi MDS Pansitopeni CD55 ve CD59 düzeyi Normal Eksik Asit Ham testi Negatif Pozitif 0 (%0) 5 (%45) 4 (%80) 12 (%100) 7 (%88) 28 (%100) 0 (%0) 28 (%97) 0 (%0) 4 (%100) 6 (%55) 1 (%20) 0 (%0) 1 (%12) 0 (%0) 12 (%100) 1 (%3) 11 (%100) FLAER test sonucu Negatif Pozitif 100% 80% 100% 88% 45% 55% 0% 20% 0% 12% PNH Aplastik anemi Hemolitik anemi MDS Pansitopeni Şekil 7: Hastaların ilk tanılarına göre FLAER test sonuçları 26

Tablo 8. Hastaların FLAER test sonuçlarına göre demografik özellikleri FLAER Ölçümler Negatif Pozitif P Özet Ölçüt* Özet Ölçüt* Cinsiyet Erkek 14 (%58) 10 (%42) 0,049 Kadın 14 (%88) 2 (%12) Yaş 40,3±16,4 35 (19-87) 36±9,3 34 (23-57) 0,404 Hastalık süresi 47±65,3 24 (1-264) 97,3±84,9 84 (3-228) 0,074 * Özet ölçüt, cinsiyet için sayı (yüzde), diğer ölçümler için ortalama±s.sapma, medyan (minmaks) olarak verilmiştir. Hastaların cinsiyetine göre FLAER test sonuçları değişkenlik göstermektedir. Buna göre erkeklerin %42 si, kadınlarınsa %12 sinde FLAER pozitifliği görülmüştür. Hastaların FLAER test sonucuna göre yaş ortalamaları benzerken, FLAER pozitiflerin hastalık süresi FLAER negatiflerin hastalık sürelerine göre sınırda anlamlı olacak şekilde daha yüksek bulunmuştur. Şekil 8: Hastaların cinsiyetine göre FLAER test sonuçları 27

Tablo 9. Hastaların FLAER test sonuçlarına göre hemoliz parametreleri FLAER Ölçümler Negatif Pozitif P Özet Ölçüt* Özet Ölçüt* Retikülosit 2,63±2,33 1,8 (0,1-10) 6,27±9,27 3,35 (0,02-34) 0,192 LDH 305,9±301,4 204,5 (76-1366) 1914,3±2115 1231,5 (122-7334) 0,001 İdrarda hemosiderin Negatif 28 (%100) 5 (%42) <0,001 Pozitif 0 (%0) 7 (%58) İndirekt bilirubin 1,46±1,83 0,75 (0,2-7,1) 1,33±0,82 0,95 (0,5-3,3) 0,102 * Özet ölçüt, idrarda hemosiderin için sayı (yüzde), diğer ölçümler için ortalama±s.sapma, medyan (min-maks) olarak verilmiştir. Şekil 9: Hastaların FLAER sonuçlarına göre LDH değerleri 28

Hastaların hemoliz parametreleri incelendiğinde, FLAER test sonucuna göre retikülosit ve indirekt bilirubin değerlerinin benzer, LDH değerlerinin istatistiksel olarak farklı olduğu görülmüştür. Buna göre FLAER pozitif hastaların LDH seviyeleri FLAER negatif olan hastaların LDH değerlerine göre daha yüksek bulunmuştur. Ayrıca idrarda hemosiderin varlığına göre de FLAER test sonucu değişim göstermektedir. Buna göre FLAER negatif hastaların hiç birinde idrarda hemosiderin pozitif bulunmazken, FLAER pozitif hastaların ise %58 inde idrarda hemosiderin pozitif olarak elde edilmiştir. Şekil 10: Hastaların idrarda hemosiderin varlığına göre FLAER test sonuçları Tablo 10. Hastaların FLAER test sonuçlarına göre kemik iliği biyopsi sonuçları FLAER Ölçümler Negatif Pozitif P Sayı (%) Sayı (%) Kemik iliği biyopsi Normoselüler ilik dokusu 8 (%29) 4 (%33) Hiposelüler ilik dokusu 7 (%25) 5 (%42) 0,770 Hiperselüler ilik dokusu 9 (%32) 2 (%17) Kabul etmemiş 4 (%14) 1 (%8) Hastaların kemik iliği biyopsi sonuçlarına göre FLAER sonucu değişim göstermemektedir. 29

Tablo 11. Hastaların FLAER test sonuçlarına göre anemi parametreleri FLAER Ölçümler Negatif Orta±SSapma Pozitif Orta±SSapma P Medyan (Min-Maks) Medyan (Min-Maks) Hemoglobin 8,2±1,46 8,25 (4,7-11,3) 7,99±1,79 8,25 (3,6-10) 0,706 Hematokrit 24,3±4,2 24,6 (15-33) 23,4±5,7 24 (10,6-31) 0,604 Platelet 126085,7±107604,9 84500 (7200-410000) 95716,7±84684,6 73600 (3400-243000) 0,391 MCV 86,8±13,9 90,5 (60-114) 87,3±9,7 84 (77-105) 0,902 Demir 123,9±71,9 109,5 (7-286) 103,8±64,1 104,5 (29-220) 0,409 TIBC 294,3±78,9 293 (158-538) 278,3±54 270,5 (192-357) 0,525 B12 344 ±272,7 275,5 (95-1380) 402,8±321,1 320,5 (113-1297) 0,556 Folat 18,1±38,2 8 (2,7-200) 10,9±8,5 8,1 (2-31) 0,805 Ferritin 457,6±689,2 240,5 (1,7-3118) 945,9±1406,8 134,5 (12-3879) 0,919 Hastaların anemi parametrelerine göre FLAER sonucu değişim göstermemektedir. 30

Tablo 12. Hastaların FLAER test sonuçlarına göre diğer laboratuvar ölçümleri FLAER Ölçümler Negatif Orta±SSapma Pozitif Orta±SSapma P Medyan (Min-Maks) Medyan (Min-Maks) Lökosit 3806,4±2492,3 2935 (1030-11700) 2945,8±1477,7 2700 (600-5970) 0,274 Total bilirubin 1,67±1,87 0,95 (0,3-7,4) 1,76±1,08 1,25 (1-4,6) 0,052 Direkt bilirubin 0,21±0,14 0,2 (0,1-0,7) 0,42±0,38 0,25 (0,1-1,3) 0,069 BUN 13,04±7,38 11 (4-37) 14,25±5,86 13 (7-31) 0,617 Kreatinin 0,64±0,29 0,6 (0,3-1,6) 0,74±0,16 0,75 (0,5-1) 0,267 AST 23,9±11 20 (12-52) 62,6±51,2 43 (19-188) 0,024 ALT 24,6±15,2 18 (7-70) 33,1±25,6 22 (10-85) 0,201 Hastaların diğer laboratuvar ölçümlerine göre AST ölçümü dışındaki tüm ölçümlerde FLAER test sonucu değişim göstermemektedir. AST sonucunda ise FLAER pozitif grubunda AST ölçümü FLAER negatif grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı olacak şekilde daha yüksek bulunmuştur. 31