PAROKSİSMAL NOKTÜRNAL ERCİYES ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ PEDİATRİK HEMATOLOJİ KAYSERİ

Transkript

1 PAROKSİSMAL NOKTÜRNAL HEMOGLOBİNÜRİ VE AKIM SİTOMETRESİ Dr. TÜRKAN PATIROĞLU ERCİYES ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ PEDİATRİK HEMATOLOJİ KAYSERİ

2 Tanım PNH intravasküler hemoliz, Kİ yetmezliği ve tromboza meyil ile karakterize bir hastalıktır

3 P Strübing H van den Bergh Ham Tarihçe 1882 yılında tanımlamış Eritrositlerin CO2 ile asidifiye edildiğinde normal serumda da lizisini 50 Yıl önce enzimatik aktiviteyi gösteren testi Marchiafava-Michelis Kan h. yüzeyinde Pİ anchor kaybını X-linked PİG-A gen defekti 100 yıl sonra

4 Tanım PNH, Xp22.1de yerleşen PİG-A geninde bir bozukluğa yol açan akkiz kök hücre hastalığıdır. Hsi ED,Am J clin Pathol 2000:114

5 >100 mutasyon (+) Genetik PİG-A, X kromozomu üzerinde, diğerleri otozomlarda yerleşir Brodsky R A. ASH 2006

6 Patofizyoloji Primitif kök hücrede PİG-A geninde somatik mutasyon sonucu hematopoeitik hücrelerin yüzey y proteinleri için gerekli olan glikozil fosfatidil inositol sentezi olmaz. Buna bağlı olarak da hücre yüzeyindeki tüm GPİ-anchored proteinler eksiktir. CD55 ve 59 GP anchored kompleman regülatör proteinlerdir. Ruiter ED,J Medicine 2003:61

7 Patofizyoloji * PNH lı hastalarda normal ve PNH klonuna sahip kök hücrelerin oranı değişiktir. ğ ş Tipik hemolizli hastalarda PİG-A mutasyonuna sahip kök hücre oranı daha fazladır *AA li hastalarda ise PNH klonuna sahip kök hücre oranı daha azdır

8

9 Ertrositlerde bu proteinlerin yokluğu C3 konvertaz ve kompleman faktörlerinin depolanmasına yol açar, intravasküler hemoliz olur, serbest Hb salınır, NO tüketimi artar ve bulantı, ağrı,özefageal spazm, erektil disfonksiyon ve tromboza meyil oluşur. Granülositlerde PNH klonu >%60 ise bulgular l ortaya çıkar. Brodsky R A. ASH 2006

10 Patofizyoloji *Sağlıklı insanlarda % oranında nonklonal PNH benzeri hücre bulunabilir. Bunların % 0.01 den 01 d daha azında klonal l mutasyon veya klinik gözlenir. *PİG-A mutasyonları sağlıklı kontrollerin koloniforming hücrelerinde de (+) olabilir ama stem hücrede olmadığı için patolojik değildir. *CAMPATH-1H ile tedavi alan RA li kişilerin monosit, os T ve B lenfositlerinde e mutasyon saptanmasına rağmen PNH gelişmemiş ve tedavi sonrası mutasyon kaybolmuş. Brodsky R A. ASH 2006

11 Patofizyoloji PNH için PİG-A mutasyonu gereklidir ama hastalık için yeterli değildir. Brodsky R A. ASH 2006

12 Hastalık sinsi başlar Ailevi yatkınlık yok Epidemiyoloji Her yaşta ve her iki cinsiyette olabilir Güneydoğu Asya ülkelerinde daha sık Ortalama yaşam yıl Spontan remisyon (+) %15 Ölüm nedeni: Venöz tromboz Richards SJ,Cytometry Part B 2007:728

13 Klinik Bulgular Kronik İntravasküler t hemoliz Venöz tromboz Kİ süpresyonu PNH sıklığı: 2-5/milyon/yıl PNH, de novo veya aplastik anemiden sonra oluşabilir ouşab Brodsky R A. ASH 2006

14 Klasik PNH Sitopeni (hafif, orta) Kİ ( N, hiperplazi) Retikülositoz LDH yüksek Tromboz riski fazla GPİ-AP eksik > %60 (Granülositlerde) Eculizumab tedavisi Prednizon ( cevap kötü) Klinik Hipoplastik PNH Kİ yetmezliği A. A lerin yarısında küçük PNH klonu (+) Pansitopeni (orta, ağır) LDH N, veya hafif GPİ-AP eksik > %20 (Granülositlerde) KİT

15 Aplastik a. %15 hasta Aşikar ş PNH Klinik Aplastik a. %30-35 hasta Aplastik a. %30 35 hasta Subklinik PNH

16 Aplastik anemi PNH fenotipleri Miyeloproliferatif hastalıklar (MDS,AML) Lenfoproliferatif hastalıklar ( Non-Hodgin, Hodkin, ALL) Dworacki G,Folia Histoch Cytobiol 2005:43

17 Hiperkoagülabilite Kompleman ile platelet aktivasyonu Monosit ve granülositlerdeki fibrinolizisin bozulması

18 Komplikasyonlar İntravasküler hemoliz Hemoglobinüri Fe eksikliği Akut böbrek yetmezliği Venöz tromboz Sup. ve inf. Vena cava Hepatik venler (Budd-Chiari) Mesenter venler vs.

19 Komplikasyonlar Bozuk hematopoez pansitopeni p makrositoz aplastik anemi AML ye dönüşüm Enfeksiyon sinopulmoner sepsis

20 Laboratuvar Bulguları (nonspesifik) Sitopeni (1veya daha fazla) Makrositoz, anizositoz, polikromazi Retkülositoz Nötrofil alkalen l fosfatazında f azalma Laktik dehidrogenaz artması Haptoglobin azalması Hemoglobinüri, hemosiderinüri Demir ve folik asit eksikliği

21 Laboratuvar Bulguları Kemik iliği bulguları Sitogenetik Spesifik testler -Hiperplaziden hipoplaziye kadar değişik hematopoez -Sitopeni (1veya daha fazla) -Mast hücre sayısında artma -Normal -Periferik kan veya kemik iliği örneklerinde GPİ ilişkili yüzey proteinleri (CD 55 ve CD 59) nin flow sitometrik analizi

22 Tanı testleri Klasik PNH testleri Ham Hemosiderinüri Sukroz lizis testi Hemoliz testleri Kan sayımı Retikülosit sayısı LDH Bilirubin GPİ-AP ekspresyonu

23 FC Testleri En uygun örnek: periferik kan (Kİ de olabilir) GPİ ilişkili antijen ekspresyonu - Eritrositler - Granülositler FLAER (Fluorescently Labeled Aerolysin) - Granülositler

24 FC Testleri PNH klonunu saptamak için monosit veya nötrofiller eritrositlere tercih edilir. Nedeni: Eritrosit ömrünün kısalması Transfüzyonlar Nötrofillerde PNH klonu eritrositlere göre 3 kat fazladır. Sorunlar: Ciddi nötropeni Teknik sorunlar (Ab seçimi, kapılama)

25

26

27

28 Tanı Çok renkli FC kullanılmalı Avantaj: Hızlı ve kantitatif olarak GPİ proteinlerinin çalışılması mümkün Ticari kitler: redquant ve cellquant floresan beadleri kullanarak hücrelerde CD 55 ve CD 59 un boyanmasını ve analizini i i yapar. Hsi ED,Am J clin Pathol 2000:114

29 Taze PNH örneğinin Biocytex Redquant ve Cellquant Kiti ile analizi. CD55- ve 59- için kapılama alfa ve beta beadleri kullanılarak yapıldı. R2 bölgesindeki nötrofiller CD55 ve 59 için kapılandı ve yönteme uygun olarak analiz edildi.

30 Tanı *10000 eritrosit sayılmalı Anormal hücre >%3 *5000 granülosit sayılmalı Anormal hücre >%3 Her 2 kit için 4 markerin (CD55,59, 66 ve 14) 3 ü anormal ise (>%3 den daha fazla hücrede ekspresyon azalmış ise) PNH kabul edilmeli Hsi ED,Am J clin Pathol 2000:114

31 FLAER-flourescently labeled l aerolysine Proaerolizin 52-k Da luk Aeromonas hydrophiliadan oluşan bir toksindir. GPİ-anchored proteinler, proaerolizin için reseptördür. Floresan proaerolizin variant (FLAER) GPİ- anchora bağlanır. PNH lı hücreler bu toksine dirençlidir. Brodsky R A. ASH 2006

32 FLAER-flourescently labeled l aerolysine Bu teknik ile küçük bir klonu (%0.5) dahi saptamak mümkündür. Proteolizini işlemek için gerekli enzimi yüzeyine bağlama yeteneği olmadığından bu teknik eritrositlerde kullanılamaz FLAER, CD 59 dan daha hassastır, stabildir ve çok pahalı değildir Brodsky R A. ASH 2006

33 CD33, CD45 ve CD14 ün FLAER ile boyanmış normal periferal kan örneği. R2 bölgesinde kapılanan hücreler normal monosit fenotipini gösterir (CD45+, CD33 parlak, CD14+ ve FLAER+). R3 bölgesinde kapılanan hücreler nötrofil fenotipini gösterir (CD45 zayıf, CD33 zayıf, CD14 zayıf ve FLAER+). R4 bölgesinde kapılanan hücreler lenfosit fenotipini gösterirr (CD45 kuvvetli, CD33-, CD14- ve FLAER+). Monosit ve nötrofillerin %0.5 ten azı CD14-,FLAER- PNH fenotipini i i gösterir.

34 CD33 CD45 CD33, CD45 ve CD14 ün FLAER ile boyanmış taze PNH örneği. R2 deki CD14- monositler (%71) FLAER- PNH fenotipini gösterir (alt sol). R3 teki nötrofiller (%51) CD14- FLAER-PNH fenotipini göstermektedir (alt orta).

35 YÖNTEM (Eritrositler) *4 ml PBS+2 μl kan *1800 devirde 5 dk santrifüj edilip üst kısım pipet ile alınıp atılır *Hafif vortekslenir, 200 μl PBS eklenir *CD55(10 μl)+cd 59(10 μl) bulunan tüpe hazırlanan karışımdan 100 μl eklenip votekslenir *Buz dolabında (+4 C0) 45 dk. beklenip vortekslenir *300 μl PBS eklenip vortekslenir *1800 devirde 5 dk. Santrifüjden sonra üst kısmı pipetle atılır *350 μl cell wash veya PBS eklenip Flowda okunur

36 Granülositlerde normal C55 ve CD59 ekspresyonu

37

38 Kantitatif ölçümün önemi Granülositlerdeki PNH klonu >%50 ise tromboz riski yüksektir PNH klonu düşük aplastik anemiden, yüksek PNH klonuna sahip hemolize doğru ilerleme olabilir Anti C5a (eculizumab) nın tedavi edici etkisi değerlendirilebilir rhcd59-p nin düzeltici etkisinin monitorizasyonu

39 FC Testleri Eritrositlerde kantitatif değerlendirmeye göre (transfüzyon almamışlarda): N ekspresyon (Tip I), Kısmi yokluk k (Tip II), Tam yokluk (Tip III), Vakaların çoğu (%20) tip III tür. Sorunlar: Eritrosit transfüzyonu Teknik sorunlar (aglütinasyon, Ab seçimi)

40 Tanı CD55 ve CD59 azalmış ise: Tip1 CD55 kısmen azalmış ise: Tip 2 Thomason RW,Am J Clin Pathol 2004:122 CD 59 eksikliği hemoliz veya diğer klinik semptomlardan sorumludur

41 Gupta R,Int Lab Hem 2007:29 Litik testler: Asidik veya düşük ş iyonik medyumda eritrositlerin kompleman lizisine yatkınlığı artar Asidifiye serum lizis (Ham) testi Sukroz hemoliz testi Dezavantaj: Kantitatif değil Transfüzyon alanlarda nonspesifik Jel kart testi: Ag-Ab reaksiyonuna dayalı bir tarama testi. ti CD55,59 59 eksik eritrositleri itl i saptar FCMI: Eritrosit, lökosit ve plateletlerde 1 veya daha fazla GPI-anchored proteinin yokluğunu veya farklı ekspresyonlarını gösteren hassas bir test

42 Gupta R,Int Lab Hem 2007:29 FLAER( floresan aerolizin) assay: Eritrositlerde kullanılır ama PNH klonunu saptamada sınırlıdır. Eritrositlerde glikoforin proaerolizine zayıf bağlanır.

43 PNH daki Hemolitik Durum PNH lı eritrositlerin yaşam süresini hesaplamak için; W/100=RxM/( (100-R)x 120+RxM) W: %eritrosit (CD 59 -) R: %retikülosit (CD59 -) M: CD59(-) eritrosit ömrü(gün) Ninomiya H. Inter J Lab Hematol 2008;30

44 Ayırıcı Tanı Paroksismal soğuk hemoglobinürisi Soğuk antikor sendromu HEMPAS (Herediter Eritroblastik Multinüklearite Pozitif Asidifiye Serum lizis)

45 Tedavi *KİT *İmmünosüpresyon (ATG+Cys-A) *Büyüme faktörleri *Destek tedavisi (uzun süreli antikoagülan, Fe ve folat desteği, eritrosit süsp.) *Eculizumab (anti C5) hemolizi azaltır

46 Eculizumab Tedavisi C5 e karşı ş Mo Ab Terminal yolu inhibe eder Neisseria enf. için aşılanmalı a a (2 hf önce) 600 mg/hf x 4 iv 900 mg/2 hf x 6 ay Yan etkiler: baş ağrısı, nazofaenjit,sırt ağrısı, ÜSYE İntravasküler hemoliz ve transfüzyon ihtiyacını azaltır. Tromboz riskini azaltıyor mu? Brodsky R A. ASH 2006

47

48 PNH daki Hemolitik Durum W/100=RxM/( (100-R)x 120+RxM) W/100=RM/((100-R)120)+RM 100/W=((100-R)120)+RM/RM 100/W=ı+((100-R)120)/RM (100/W)-ı=(100-R)120)/RM M= =(100-R)(120)W/R(100-W) W)