ANTİ HLA ANTİKORLARI ve TAYİN YÖNTEMLERİ Yrd. Doç.Dr. Hilmi Tozkır Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi
KONULAR ve AKIŞ PLANI NEDİR? NASIL OLUŞUR? NELERE NEDEN OLUR? CEVAP ARANAN SORULAR? NELER YAPILABİLİR? NASIL TESPİT EDERİZ?
ANTİ-HLA ANTİKORU NEDİR? İNSAN LÖKOSİT ANTİJENLERİNE (Human leucocyte Antigens HLA) KARŞI OLUŞMUŞ OLAN ANTİKORLARA ANTİ-HLA ANTİKORU veya PANEL REAKTİF ANTİKOR (PRA) DENİR.
Panel Reaktif Antikor (PRA) oluşması nedenleri Kan Transfüzyonu Gebelik (Özellikle Multiparlarda) Doku veya organ transplantasyonları (2. veya 3. transplantasyona hazırlanan hastalar) ** PRA duyarlılığının nedeni bilinmeyen bir hasta grubunun da varlığı, diğer olası faktörlerin araştırılmasına yol açmıştır.
Yüksek PRA oluşumu ve nedenleri(1) PRA %85 in üzerinde olan hastalara high immune hastalar denilmektedir. Bu hastalarda organ bulma şansları diğer hastalara göre düşüktür. Çünkü birçok antijene karşı antikor taşıdığı için cross-match testi pozitif çıkmaktadır.
Yüksek PRA oluşumu ve nedenleri(2) Bazı hastalar geniş spektrumda antikor üretmeye meyillidir. Bu hastalar özellikle nadir doku grupları (A29, A33, B37, B70, CW3) taşıyan hastalardır. BW4 ve BW6 homozigot hastalar
Kan transfüzyonuna bağlı anti-hla antikorları oluşma nedenleri(i) Transplantasyon öncesi renal yetmezlikli hastalarda sıklıkla hemoglobin %6-8 mg, hematokrit ise %20-25 dolayındadır. Eritropoetin sentez ve serbestleşmesinin bozulması ile hastalarda anemi gelişmektedir.
Kan transfüzyonuna bağlı anti-hla antikorları oluşum nedenleri (2) Yapılan Kan transfüzyonlarında HLA uyumu olmadığı için bu hastalarda HLA antijenlerine karşı antikorlar oluşmaktadır. Bu antikorlar da olası organ transplantasyonuna engel oluşturabilmektedir. Son yıllarda rekombinant insan eritropoetinin kullanımı ile hastaların anemileri tedavi edilmekte ancak çok mecbur kalındığı durumlarda kan transfüsyonlarına baş vurulmaktadır.
Multipar Kadınlarda Antikor Oluşma Nedenleri Antikoru oluşturan neden çocuğa babadan geçen HLA antijenleridir. Fetus normalde anne için immunojeniktir. Çünkü babadan gelen antijenler anne için yabancı sayılır. Birinci gebelikte bu antijenlere karşı IgM antikorları gelişirken, ikinci ve sonraki gebeliklerde IgG antikorları bol miktarda yapılır.
Böbrek bekleme listesindeki hastalarda oranı ülkeden ülkeye değişmekle birlikte ortalama %10-25 arasında presensitize (PRA pozitif) hasta vardır.
Yüksek panel reaktif antikor (PRA) düzeyi olan hastalar, transplantasyon bekleme listelerinde giderek artmaktadır. Bu nedenle PRA sensitizasyonunu etkileyen faktörler üzerinde durulmaktadır.
Renal transplantasyon hikayesine ek olarak HD süresinin PRA sensitizasyonunda etkili bir faktör olduğu gösterilmiştir. Bu bulgu, HD süresi uzadıkça, hastanın PRA sensitizasyonuna yol açacak kan, kan ürünleri, ilaçlar, bio uyumsuz membranlar gibi eksternal antijenlerle karşılaşmış olma riskinin artmasıyla açıklanabilir.
CEVAP ARANAN SORULAR? On üniteden fazla kan transfüzyonu almış olmasına rağmen PRA titresinin negatif veya 2 ünite kan transfüzyonu olan bireylerde PRA pozitifliği Hiç transfüzyon, hamilelik veya transplantasyon hikayesi olmadan PRA titresinin yüksek olduğu bir hasta grubunun saptanması,
İnsan lökosit antijen (HLA) gen dağılımı ve PRA duyarlılığı arasındaki ilişki halen araştırılan bir konudur. Rekombinan human eritropoetin (r-huepo) tedavisinin, kan transfüzyon ihtiyacını azaltarak PRA pozitiflik oranını düşürebilir. Hepatitis C virus (HCV) enfeksiyonuna sekonder olarak gelişen pek çok immünolojik bozukluk bildirilmiştir. Bu nedenle,hcv enfeksiyonu ve PRA pozitifliği arasında bir ilişki olabileceği öne sürülebilir.
Hayatlarında hiç kan transfüzyonu yapılmamış veya organ nakli olmamış sağlıklı erkeklerin serumlarında anti-hla antikorlarının varlığı bulunmuştur. Bu HLA antikorları mikroorganizmalarda ve allerjenlerde Bulunan cross-reaktif epitoplara karşı oluştuğu düşünülmektedir. Örnek olarak HLA-B27 nin Klebsiella pneumoniae, Shigella ve Yersinia ile cross-reaktivitesi rapor edilmiştir.
Presensitize hastanın dezavantajları Daha az organ bulma şansı, çünkü: - pozitif Cross-Match Daha kötü greft sağkalımı, çünkü: Genel olarak daha yüksek alloreaktivite - Donor-spesifik antikorların çok görülmesi
PRA düzeyinin akut rejeksiyon atağı riskinin ve transplantasyon sonrası HD ihtiyacının belirlenmesinde, graft sürvisi uzunluğu ile ilgili prediktif değeri vardır
Anti-HLA antikorlarına sahip diyaliz hastalarında bu antikorların seviyesini azaltmak veya ortadan kaldırmak önemlidir. Bunun için bugün başvurulan metodlar; 1. Plazmaferez, 2. Protein A immunoadsorpsiyon, 3. İntrovenöz immunoglobulin, 4. B-Hücre spesifik ajanlar ile İmmünosüpressiyon 5. Kombinasyonlar.
Plazmaferez ve düşük doz introvenöz immunuglobulin (100mg/vucut ağırlığı, her bir doz için) en yaygın ve etkili metoddur. Plazmaferez ile birlikte düşük doz intravenöz immunoglobulin dönörü olan hastalar için (living dönor) en sık başvurulan yöntemdir.yüksek doz intravenöz immunoglobulin kadavradan yapılacak Tx da önemlidir
Bu tanımlanan anti-hla antikorlarının seviyesini azaltıcı veya ortadan kaldıran metodlar, morbitide ve mortaliteye de sebebiyet verdiği bilinmektedir. Bunlara ilave olarak Tx dan sonra humoral rejeksiyon oranının da yüksek olduğu rapor edilmiştir [9,10].
Vericiye özgü antikor (donor specifik antibody- DSA) saptanırsa; bunların IgG mi yoksa IgM mi olduğu, hangi hedef hücreye (T, B) mi özgü olduğunun bilinmesi önemlidir. Nakilden önce bu antikorların saptanması, rejeksiyon riski olan nakillerin belirlenmesine yardım eder. Çünkü lenfositler HLA antijenlerini yüksek oranda eksprese eder ve DSA ların belirlenmesi için hedef hücre olarak seçilirler
Organ Transplantasyonlarında; Cross-Match in negatif olması akut rejeksiyon için yeterli değildir. Hastada daha önceden donöre karşı PRA gelişip gelişmediği bilinmelidir.
PRA pozitifliğinin bilinmesinde hastanın avantajları PRA pozitifliği olan hastada anti-hla antikoru tanımlanırsa, bu HLA antijenini taşıyan donörlerden organ transplantasyonu yapılmaz. PRA pozitifliği olan hastaya Cross-Match negatif olan donör bulunduğunda bu verici ile yapılacak transplantasyon öncelik kazanır. Hastada, donörün HLA antijenlerine karşı önceden gelişmiş PRA pozitifliği var ise, transplantasyondan vazgeçilir.
HLA antijenleri ile karışabilen oto antikorların ayırt edilmesi Teste DTT ilave edildiğinde, IgM antikorlarının yapısı bozulur ve Cross-Match negatif olur. Bu antikorlar transplante edilen organ için zarar oluşturamazlar. Özellikle viral enfeksiyonlarda ve Lupus Eritematosus da görülürler.
Grafttaki uyumsuz HLA antijenlerine karşı hümoral immün cevap farklı alloantikorların üretilmesine sebep olabilir. Bu antikorların bazıları sınıf I, bazıları ise sınıf II antijenlerinin ortak veya özel yapılarına özgü olabilir. Bazı literatürlerde de, HLA sınıf I DSA lar erken graft yetmezliği ile ilişkili iken HLA sınıf II DSA ların ise uzun dönem graft yetmezliği ile ilişkili olduğu açıklanmıştır.
Antikorlar doğrudan grafta bağlanarak aktive olan verici endotel hücrelerinde rejeksiyonu başlatabilir. Antikorların üretiminin akut rejeksiyon ataklarından çok organ fonksiyonu ve sağkalımı üzerindeki etkisinin daha kötü olduğu belirtilmektedir.
Kronik graft yetmezliğinin gelişiminde en önemli risk faktörlerinden biri erken akut rejeksiyon ataklarının ve DSA ların oluşumudur Böbrek nakli sonrasında DSA ların saptanması rejeksiyon tedavisine başlanması için bir gösterge olabilmektedir.
NASIL TESPİT EDERİZ? Böbrek Transplantasyonuna Aday olan Hastalara PRA Testi bir kere yapılmaz. Dializ Hastalarına: Her kan transfüzyonunu takiben 3 hf. sonra Yılda 4 kez büyük panel ile yapılmalı
Panel Reaktif Antikor (PRA) aranması Screening Testi Cross-Match i pozitif olan veya olmayan hastalarda, herhangi bir HLA antijeni veya antijenlerine karşı antikor olup olmadığını belirlemek için yapılır.
PRA Tayin Yöntemleri CDC ELİSA Flow-cytometri Luminex-Lifematch Fluroanalyser
CDC TESTİ Tamamen canlı hücreye dayanır..
ELİSA ile PRA antikorlarının saptanması 40 donor plateletlerinden elde edilen I. Sınıf HLA glikoproteinler kuyular üzerine immobilize edilmiş olarak kullanılır. - Kuyular yıkama solusyonu ile rehidrate edilir - Dilue edilmiş hasta serumu ve kontroller eklenir. - Enzim işaretli anti-igg antikoru eklenir - Enzim aktivitesi kromojenik sustrat eklenerek ölçülür.
FLOW-PRA HLA Sınıf I ve Sınıf II antijenleri ile kaplı mikroboncuk ( bead ) havuzu kullanılarak HLA antikorlarının Flow Sitometri aracılığıyla taranmasıdır.
FLOW-PRA nın ÖZELLİKLERİ Düşük yoğunluktaki HLA Sınıf I antikorlarının ve Sınıf II antikorlarının saptanmasını sağlar. Aktivasyonu komplemana bağlı olan antikorların (IgG1, IgG3) yanısıra, aktivasyonu komplemana bağlı olmayan antikorların (IgG2,IgG4) tesbit edilmesinde rol oynar.
FLOW-PRA TESTLERİ Flow-PRA screening Test serumunda bulunan HLA antikorlarının yüzde miktarını verir. Flow-PRA spesifik Bu antikorların hangi HLA antijenine spesifik olduğunu belirler.
FLOW-PRA SCREENİNG TESTİ Flow -PRA Sınıf I Screening Testi Flow -PRA Sınıf II Screening Testi Flow -PRA Sınıf I ve Sınıf II Screening Testi KONTROLLER Negatif Kontrol Sınıf I Pozitif Kontrol Sınıf II Pozitif Kontrol
FLOW-SİTOMETRİ YÖNTEMİ İLE ANTİ-HLA ANTİKORLARIN TESPİTİ FlowPRA I boncuklarının FSC-SSC nokta alanı FlowPRA II boncuklarının FSC-SSC nokta alanı
FLOW-SİTOMETRİ YÖNTEMİ İLE ANTİ-HLA ANTİKORLARIN TESPİTİ Sınıf I ve Sınıf II boncuklarının ayırt edildiği FL2 histogramı
FLOW-SİTOMETRİ YÖNTEMİ İLE ANTİ-HLA ANTİKORLARIN TANIMLANMASI
FLOW-SİTOMETRİ YÖNTEMİ İLE ANTİ-HLA ANTİKORLARIN TANIMLANMASI
FLUOROANALİZÖR YÖNTEMİ İLE ANTİ-HLA ANTİKORLARIN TESPİTİ VE TANIMLANMASI
LUMINEXTECHNOLOGY Amplicon labeled with Biotin during PCR is mixed with the bead mix and it will bind to a complementary probe during hybridization. Allele DRB 1 *0101 Allele DRB 1 *07 * * Allele DRB 1 *07 * Allele DRB 1 *0101 * Allele DRB 1 *0101 * Allele DRB 1 *07 * Allele DRB 1 *07 Allele DRB 1 *0101 * *
LUMINEXTECHNOLOGY Sample will be taken up by the instrument and will pass the lasers. * * * * Detection of Signal * * * * * * Red Laser determines bead set * Green laser quantify Captured amplicon Two different lasers are directed on the flow cell Flow
DSA?
Özet olarak Yüksek Oranlı PRA olan hastalar için öneriler Iyi bir HLA uyumu Hassas cross-match Spesifik peri-operatif uygulamalar Plazmaferez/Immun-adsorbsiyon ± IvIg ± Rituximab
Soğuk iskemi zamanı HLA Uyumu İmmunsupresyon PRA Graft Sağkalım Gecikmiş graft fonksiyonu Alıcı Yaşı Verici yaşı Akut rejeksiyon
Sonuç olarak solid organ nakillerinde, özellikle en sık yapıldığı için renal Tx da greft sağ kalımı ve greft ömrü göz önüne alındığında cross matchlerin kesin negatif ve anti-hla antikorlarınında olmaması Tx un başarısında en önemli faktörlerden birisidir.