ÇOCUKLUK ÇAĞI MATÜR B-HÜCRELİ HODGKİN DIŞI LENFOMALARIN KLİNİK İZLEM VE CD10 BCL6 BCL2 MUM1 TCL1 EKSPRESYON ÖZELLİKLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ

T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ ÇOCUK SAĞLIĞI VE HASTALIKLARI ANABİLİM DALI ÇOCUKLUK ÇAĞI MATÜR B-HÜCRELİ HODGKİN DIŞI LENFOMALARIN KLİNİK İZLEM VE CD10 BCL6 BCL2 MUM1 TCL1 EKSPRESYON ÖZELLİKLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ UZMANLIK TEZİ Dr. AHMET GÖKHAN USLAN TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. AYNUR OĞUZ ANKARA NİSAN 2014

i

TEŞEKKÜR Uzmanlık eğitimi boyunca ilminden faydalandığım, insani ve ahlaki değerleri ile de örnek edindiğim, yanında çalışmaktan onur duyduğum değerli hocam, anabilim dalı başkanımız Sayın Prof. Dr. Aynur Oğuz a, Tezimin hazırlanmasında desteklerini esirgemeyen Sayın Prof. Dr. Ceyda Karadeniz ve Sayın Prof. Dr. F. Güçlü Pınarlı ya, İyi bir eğitim almamda katkısı olan diğer tüm bölümlerdeki öğretim üyesi hocalarıma, Araştırma süresince büyük yardımlarını gördüğüm Patoloji Anabilim dalı öğretim üyesi Sayın Prof. Dr. Nalan Akyürek e, Tanımaktan ve beraber çalışmaktan mutluluk duyduğum tüm asistan arkadaşlarıma, Desteklerini her zaman bildiğim, en zor ve en güzel günleri beraber paylaştığım, emeklerinin karşılığını hiçbir zaman ödeyemeyeceğim sevgili aileme, Sonsuz teşekkür ederim. Dr. Ahmet Gökhan Uslan ii

İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR... ii İÇİNDEKİLER... iii TABLOLAR DİZİNİ vi ŞEKİLLER DİZİNİ viii KISALTMALAR... x 1. GİRİŞ. 1 2. GENEL BİLGİLER... 3 2.1. Hodking Dışı Lenfomalar (HDL) 3 2.2. Matür B Hücreli Hodgkin Dışı Lenfomalar 7 2.2.1. Matür B Hücreli Hodgkin HDL Alt Grupları... 8 2.2.1.1. Burkitt lenfoma (BL). 8 2.2.1.2. Yaygın büyük B hücreli lenfoma (YBBHL)... 12 2.2.1.3. Primer mediastinal büyük B hücreli lenfoma.. 14 2.2.1.4. Folliküler lenfoma (FL)... 14 2.2.1.5. Marjinal zon lenfoma (MZL)... 15 2.2.2. Klinik Belirti Ve Bulgular.. 15 2.2.2.1. Burkitt lenfoma (BL)... 15 2.2.2.2. Yaygın büyük B hücreli lenfoma (YBBHL)... 17 2.2.2.3. Folliküler lenfoma (FL)... 17 iii

2.2.2.4. Marjinal zon lenfoma (MZL)... 17 2.2.3. Tanı Ve Evreleme... 18 2.2.4. Tedavi. 19 2.2.5. Prognoz... 24 2.3. Çalışmada Kullanılan İmmünhistokimyasal Belirleyiciler.. 24 2.3.1. CD10... 24 2.3.2. BCL-6. 25 2.3.3. BCL-2. 26 2.3.4. MUM1/IRF4... 26 2.3.5. C-MYC... 27 2.3.6. TCL1... 28 3. GEREÇ VE YÖNTEM 29 3.1. Hasta Seçimi.. 29 3.2. İmmünhistokimyasal Yöntem... 29 3.3. Boyanma Derecelerinin Değerlendirilmesi... 30 3.4. İn Situ Hibridizasyon. 30 3.5. Floresan İn Situ Hibridizasyon (FISH) Yöntemi.. 31 3.6. FISH Değerlendirmesi... 32 3.7. İstatiksel Analiz. 33 4. BULGULAR 34 5. TARTIŞMA. 63 iv

6. SONUÇ 74 7. KAYNAKLAR 77 8. ÖZET 91 9. SUMMARY. 93 10. EK TABLOLAR 95 11. ÖZGEÇMİŞ..... 105 v

TABLOLAR DİZİNİ Tablo 1. Çocukluk Çağı HDL ların 2008 WHO Sınıflaması... 6 Tablo 2. Çocukluk Çağı HDL ların Histolojik Alt Grupları 7 Tablo 3. St.Jude Evrelemesi... 19 Tablo 4. B Hücreli NHL-BFM 95 Tedavi Protokolü.. 22 Tablo 5. B Hücreli HDL İçin Risk Sınıflaması (SFOP). 23 Tablo 6. B-Hücreli NHL-BFM 95 Protokolü Risk Grupları.. 23 Tablo 7. Olguların Demografik Özellikleri 35 Tablo 8. Hastaların Primer Tutulum Alanı Dışındaki Diğer Tutulum Bölgeleri.... 36 Tablo 9. Tüm Grubun Başvuru Şikayetleri. 38 Tablo 10. Tüm Grubun Klinik Ve Laboratuvar Özellikleri.. 40 Tablo 11. Hastaların Tedavi Yanıt Durumları Ve Bunların Sağkalım İle İlişkisi... 42 Tablo 12. Hastaların Genel Sağkalım (OS) Analizi. 44 Tablo 13. Hastaların Olaysız Sağkalım (EFS) Analizi. 45 Tablo 14. İmmünhistokimyasal Çalışmaya Alınan Olguların Verileri 49 Tablo 15. BL Olgularının Genel Sağkalım (OS) Analizi. 54 Tablo 16. BL Olgularının Olaysız Sağkalım (EFS) Analizi. 55 Tablo 17. YBBHL Olgularının Genel Sağkalım (OS) Analizi. 61 vi

Tablo 18. YBBHL Olgularının Olaysız Sağkalım (EFS) Analizi 62 vii

ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1. Burkitt Lenfomada Görülen C-MYC Gen Lokusunu İçeren Translokasyonlar.. 10 Şekil 2. Hastalarda Görülen Onkolojik Aciller.. 39 Şekil 3. Tüm Olguların LDH Düzeylerine Göre Olaysız Kümülatif Yaşam Hızını Gösteren Kaplan Meier Eğrileri... 43 Şekil 4. Tüm Olguların Genel Yaşam Hızını Gösteren Kaplan Meier Eğrisi. 47 Şekil 5. Tüm Olguların Olaysız Kümülatif Yaşam Hızını Gösteren Kaplan Meier Eğrisi. 47 Şekil 6. C-MYC rearranjmanı bulunan Burkitt lenfoma (orjinal büyütme, x1000).. 51 Şekil 7. BCL-2 rearranjmanı bulunan YBBHL (orjinal büyütme, x1000).. 51 Şekil 8. Burkitt lenfoma (HE, x400).. 52 Şekil 9. Burkitt lenfomada CD10 ekspresyonu (CD10, x400).. 53 Şekil 10. Burkitt lenfomada BCL-6 ekspresyonu (BCL-6, x400)... 53 Şekil 11. Burkitt lenfomada TCL1 ekspresyonu (TCL1, x400).. 54 Şekil 12. YBBHL larda İmmünfenotipik Sınıflama 56 viii

Şekil 13. YBBHL (HE, x400).. 57 Şekil 14. YBBHL da CD10 ekspresyonu (CD10, x200). 57 Şekil 15. YBBHL da BCL-6 ekspresyonu (BCL-6, x400).. 58 Şekil 16. YBBHL da BCL-2 ekspresyonu (BCL-2, x400).. 58 Şekil 17. YBBHL da MUM1 ekspresyonu (MUM1, x400)... 59 Şekil 18. YBBHL da TCL1 ekspresyonu (TCL1, x400). 59 ix

KISALTMALAR ABD ABHL AİDS ALK Ara-C BBL BL BOS BT C-MYC CPM EBV EFS FİSH FL GMB HDL HİV HL Amerika Birleşik Devletleri Anaplastik Büyük Hücreli Lenfoma Edinsel İmmün Yetmezlik Sendromu Anaplastik Lenfoma Kinaz Cytosine Arabinoside Burkitt Benzeri Lenfoma Burkitt Lenfoma Beyin Omurilik Sıvısı Bilgisayarlı Tomografi Cellular-MYC Cyclophosphamide Epstein-Barr Virüs Event-Free Survival Floresan İn Situ Hibridizasyon Folliküler Lenfoma Germinal Merkez B Hücre Benzeri Hodgkin Dışı Lenfoma İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü Hodgkin Lenfoma x

IFOS IT Kİ LBL LDH MALT MRG MTX MUM1 MZL NHL Non-GMB OS PCR PET REAL SFOP SSS TCL1 TdT TLS Ifosfamide İntratekal Kemik İliği Lenfoblastik Lenfoma Laktat Dehidrogenaz Mukoza İlişkili Lenfoid Doku Manyetik Rezonans Görüntüleme Methotrexate Multipl Myelom Onkogen-1 Marjinal Zon Lenfoma Non-Hodgkin Lenfoma Germinal Merkez B Hücre Benzeri Olmayan Overall Survival Polimeraz Zincir Reaksiyonu Pozitron Emisyon Tomografisi Revised European-American Lymphoma Fransız Pediatrik Onkoloji Grubu Santral Sinir Sistemi Proto-onkogen T Hücre Lösemi-1 Terminal Deoksinükleotidil Transferaz Tümör Lizis Sendromu xi

VCR VKSS VP-16 WHO YBBHL Vincristine Vena Kava Superior Sendromu Etoposide World Health Organization Yaygın Büyük B Hücreli Lenfoma xii

1. GİRİŞ Çocukluk çağı Hodgkin dışı lenfomaları (HDL) immün sistem hücrelerinden ve organlarından köken alan çeşitli hastalıklardan oluşmaktadır. Tümör hücreleri immün sistem hücre gelişiminin farklı aşamalarında malign dönüşüm sonucu ortaya çıktıklarından çocukluk çağı HDL ları farklı morfolojik, immünolojik ve klinik tablo gösterirler (1). Çocukluk çağı lenfomaları Amerika Birleşik Devletleri (ABD) ve gelişmiş ülkelerde lösemi ve santral sinir sistemi (SSS) tümörlerinden sonra 3. sıklıkta görülen tümörlerdir ve 20 yaş altı malignitelerin % 15 inden sorumludur (2). Türkiye de ise 15 yaş altı çocuklarda lenfomalar, lösemilerden sonra ikinci sıklıkta (% 19.72) görülmektedir (3). HDL lar tüm çocukluk çağı lenfomalarının % 60 ını kapsamakta olup, tüm çocukluk çağı kanserlerinin de % 6-8 ini oluşturmaktadırlar (1,4). Çocuklarda görülen HDL lar WHO sınıflamasına göre; prekürsör lenfoid neoplaziler, matür B hücreli neoplaziler ve matür T hücreli neoplaziler olarak sınıflandırılmaktadır. Bu sınıflamada histomorfolojik özelliklerin yanı sıra immünolojik ve moleküler genetik bilgiler de kullanılmaktadır (5,6). Çocuk ve ergenlerde görülen HDL ların 4 büyük histolojik alt grubu vardır: Burkitt lenfoma (Klasik ve Burkitt benzeri lenfoma) % 40, Lenfoblastik lenfoma (LBL) % 30, Yaygın büyük B hücreli lenfoma (YBBHL) % 20 ve Anaplastik büyük hücreli lenfoma (ABHL) % 10 oranında görülmektedir (6). HDL lardan, matür B hücreli HDL alt grubunda yer alan, Burkitt lenfoma (BL) ve YBBHL alt tipleri çocukluk çağı döneminde sık olarak karşımıza çıkmakta ve farklı klinik seyirler göstermektedirler (1). Bu farklı klinik seyirler özellikle YBBHL olgularında görülmekte ve bu olguların tedavi planında bu klinik seyirlerin belirlenmesi kritik önem taşımaktadır (7). B hücreli HDL ların klinik gidişleri üzerine yapılan son çalışmalarda; bazı immünhistokimyasal ekspresyon proteinlerinin prognoz üzerine anlamlı 1

etkilerinin olduğu gösterilmiştir (8). Bu çalışmalarda özellikle CD10, BCL-6, BCL-2 ve MUM1 ekspresyonları araştırılmış ve bu belirteçler kullanılarak YBBHL olguları germinal merkez B hücre benzeri olan ve olmayan (GMB ve non-gmb) olmak üzere iki gruba ayrılmıştır (8,9). Bu ayrımda germinal merkez belirteci olarak CD10 ve BCL-6 kullanılırken; post-germinal merkez belirteci olarak da MUM1 kullanılmıştır (9). Yapılan çalışmalarda pediatrik YBBHL ların % 60-85 inin GMB fenotipinde olduğu saptanırken; bu ayrımın prognostik öneme sahip olduğu ve GMB alt tipinde prognozun daha iyi olduğu gösterilmiştir (9,10). Son dönem çalışmalarda güçlü bir B hücre onkogeni olan TCL1 ekspresyonunun B hücreli HDL prognozunda etkisinin olduğu gösterilmiş olmasına karşın, çocukluk çağı döneminde TCL1 ekspresyonunun artması ile ilgili bilgi çok azdır (11). Bu çalışmalarda TCL1 ekspresyon oranlarının B hücreli HDL alt tiplerine göre farklılık gösterdiği saptanmıştır. Ayrıca agresif B hücreli HDL larda C-MYC translokasyonu ile TCL1 ekspresyonu arasında yakın bir ilişki olduğu gösterilmiştir (10,12). Yaptığımız çalışmadaki amaçlarımız; 1. Kliniğimizde izlediğimiz B hücreli HDL olgularının klinik bulgu, tanı ve tedavi özellikleri ile prognozu etkileyen faktörlerin irdelenmesi 2. Çocukluk çağı ve adölesan B hücreli HDL larda immünfenotip analizleriyle germinal merkez B hücre kaynaklı olan ve olmayan tiplerin belirlenmesi, C-MYC translokasyonu ile TCL1 ekspresyon varlığı ve bunların prognozla olan ilişkisinin araştırılmasıdır. 2

2. GENEL BİLGİLER 2.1. Hodgkin Dışı Lenfomalar (HDL) Hodgkin dışı lenfomalar; B hücre öncülleri, T hücre öncülleri, matür B veya T hücrelerinden oluşan lenfoid dokuların oluşturduğu solid tümörleri içeren bir grup hastalıktır (7). Lenfoid maligniteler hematopoetik öncü hücrelerin farklı gelişim basamaklarında kalması sonucu oluşan neoplaziler olması nedeniyle çocukluk çağı HDL ları farklı morfolojik, immünolojik ve klinik tablolar göstermektedirler (1). Erişkin dönemde gelişen HDL ların % 90 ı B hücre kökenli iken çocukluk çağı HDL larında B ve T hücre kökenli olanlar eşit oranda görülmektedir. Ayrıca öncül B ve T hücrelerinden gelişen HDL ları çocukluk döneminde erişkinlere oranla çok daha fazla görülmektedir. Çocukluk çağı HDL ların büyük çoğunluğu yüksek dereceli olup; hızlı büyüme, kemik iliği (Kİ) ve santral sinir sitemi (SSS) tutulumu ile ortaya çıkmaktadırlar (13). Türkiye de lenfomalar lösemilerden sonra ikinci sıklıkta görülen kanserlerdir (3). HDL lar tüm çocukluk çağı lenfomalarının % 60 ını kapsamakta olup, tüm çocukluk çağı kanserlerinin de % 6-8 ini oluşturmaktadırlar (1,4). HDL 10 yaş altında Hodgkin lenfoma (HL) ya oranla daha sık görülmekte iken 10 yaşında sonra HL insidansı hızla artarak 15-19 yaşları arasında HDL insidansının iki katına yükselmektedir (2). Avrupa da HDL olgularının zirve insidansı 7-10 yaş arasında olup 2 yaşın altında HDL oldukça nadir görülmektedir (14). HDL insidansı yaş gruplarına göre değişmekle birlikte yaş gruplarına özgü HDL alt gruplarının insidansı da farklılık göstermektedir. Burkitt lenfoma karakteristik olarak 5-15 yaş arasında daha sık görülürken Lenfoblastik lenfoma tüm yaş gruplarında eşit sıklıkta görülmektedir. Büyük hücreli lenfomalardan, YBBHL ve Anaplastik büyük hücreli lenfoma (ABHL), daha sık oranda büyük çocuklar ve adölesanlarda görülür. Büyük hücreli lenfoma insidansı tüm çocukluk yaş gruplarında artış göstererek 15-19 yaş grubu arasında pik yapar. Tüm yaş gruplarında HDL erkeklerde daha sık görülmekle birlikte 15 yaş altında görülen 3

olguların ¾ ü erkektir (2). HDL ve HDL alt gruplarının insidansı coğrafi bölgelere göre de farklılık göstermektedir. Afrika da ekvator bölgesinde lenfomalar tüm çocukluk çağı kanserlerinin yarısını oluşturmakla birlikte bunların büyük çoğunluğunu Burkitt lenfoma oluştururken LBL nadir olarak görülmektedir. Japonya da ise HDL ların daha az sıklıkta görüldüğü bilinmektedir (1,15,16). Coğrafi bölge ile ilişkili olarak enfeksiyöz etkenlere maruz kalma da HDL insidansını etkilemektedir. Burkitt lenfoma endemik formunun sıtmanın holoendemik olduğu ve Epstein-Barr virüs (EBV) enfeksiyonu ile erken yaşlarda karşılaşılan ekvatoryal Afrika da yaygın görülmesi bununla ilişkilidir (7,17,18). HDL beyaz ırkta siyah ırktan iki kat fazla görülmektedir. Az sayıda ailevi HDL olguları da bildirilmiştir (1,19,20,21). Yakın akrabalarında HDL ve diğer lenfoproliferatif hastalıkların varlığı HDL gelişme riskinde 1.7-3.5 kat risk artışı ile ilişkili bulunmuştur. Bu durumun, genetik yatkınlıkla veya benzer çevresel etkenlere maruziyet ile ilişkili olup olmadığı arasındaki ayrım net değildir (22). HDL etiyolojisi tam olarak bilinmemekle birlikte doğumsal ve edinsel immün yetmezlikler ile HDL gelişme riskinde artış olduğu görülmektedir (23,24). Özellikle X e bağlı geçen lenfoproliferatif sendromlu çocuklarda EBV enfeksiyonu ile B hücreli lenfoma gelişimi görülebilir (25). Bunun dışında edinsel immün yetmezlik sendromu (AİDS) hastalarının % 4 ü ilk olarak HDL ile tanı alırlar (26). HDL gelişiminde etkili olduğu bilinen bir diğer risk faktörü immünsupresyondur. Bunun en açık göstergesi solid organ transplantasyonu yapılan hastalarda kullanılan immünsupresif ilaçlar, immünsupresyonun süresi ve kullanılan ilaçların dozu ile ilişkili olarak HDL riskinin artmasıdır (27,28). HDL gelişimi ile ilişkilendirilen bir başka durum EBV enfeksiyonudur. Gelişmiş ülkelerde nüfusun % 90 ı, gelişmemiş ülkelerde ise % 99 u EBV ile enfektedir. Birincil enfeksiyon sıklıkla sessiz seyreder ve virüs B hücrelerin sitoplazmasında plazmid olarak kalır. Burkitt lenfomanın endemik olduğu Afrika ve Yeni Gine de EBV genomu, tümör dokusunda gösterilmiştir. Ancak endemik olmadığı bölgelerde Burkitt lenfoma hastalarının yalnızca % 20 sinde EBV genomu gösterilmiştir. Bağışıklık sistemi sağlam bireylerde EBV ilişkili lenfosit hücre 4

çoğalması; sitotoksik T hücreleri, antikor aracılı hücresel bağışıklık, NK aktivitesi ve endojen interferon ile engellenir. Bağışıklık sistemi baskılanmış bireylerde ise bu fonksiyon bozulmuştur ve EBV ile enfekte B hücreleri çoğalırlar. EBV ile enfekte B hücrelerinin yüksek mitotik hızları, mutasyon olasılığını arttırmaktadır. Bağışıklık sistemi sağlam bireylerde EBV enfeksiyonu engellenememekte, ancak B hücrelerden malign klonlar gelişmesi engellenmektedir. Bağışıklık sisteminin baskılandığı durumlarda ise EBV ile enfekte lenfositler lenfoma gelişiminde rol oynamaktadır (29). İmmünkomponent olgularda EBV nin HDL patogenezindeki rolü tam olarak açıklanamamıştır. Kuzey Amerika ve Avrupa da görülen sporadik BL olgularında EBV enfeksiyonu kanıtının yalnızca % 10-20 olguda gösterilmesi, lenfoma gelişiminde EBV dışındaki faktörlerin de sorumlu olduğunu düşündürmektedir (30). HDL patogenezinde farklılaşma basamaklarının birinde kalmış olan immatür lenfoid hücre gruplarının kontrolsüz klonal proliferasyonu sorumlu tutulmaktadır. Güncel bilgiler ışığında lenfomalar proliferasyonu, farklılaşmayı ve apoptozisi (programlı hücre ölümü) etkileyen genetik hatalar neticesinde ortaya çıkmaktadır. HDL ların tüm histolojik alt gruplarında tekrarlayan kromozomal translokasyonlar görülür. Translokasyonlar hücre proliferasyonunda esas olan genlerde, hücre siklusunda ya da apopitotik yollarda yer alan kritik genlerde olabilmektedir (1). Lenfoma oluşumunu başlatmada çeşitli anahtar mutasyonlar kritik gibi görünse de transgenik hayvanlarda yapılan çalışmalarda mutasyonların lenfoma gelişimi için yeterli olmadığı, hastalığın mutasyonların çoğalması sonrasında çok basamaklı süreçler ile ortaya çıktığı gösterilmiştir. Apoptozisi baskılayan genetik lezyonlar ileri mutasyonların birikimine izin vererek bu sürece katkıda bulunur (31). Lenfomalar klinik ve patolojik olarak çok heterojen hastalıklardır. Dolayısıyla histopatolojik sınıflama; lenfomaların biyolojik davranışlarının, prognozlarının ve tedavi protokollerinin standardizasyonu için önemlidir. Çocukluk çağı HDL ların REAL ve WHO sınıflamalarına göre ana grupları Tablo 1 de verilmektedir (5). 5

Tablo 1: Çocukluk Çağı HDL ların 2008 WHO Sınıflaması (5) Sıklık HDL Alt Grupları (%) Prekürsör Lenfoid Neoplaziler o T Lenfoblastik lenfoma 15-20 o B Lenfoblastik lenfoma 3 Matür B Hücreli Neoplaziler o Burkitt lenfoma o Yaygın büyük B hücreli lenfoma o Primer mediastinal B hücreli lenfoma o Pediatrik folliküler lenfoma o Pediatrik marjinal zon lenfoma 35-40 15-20 1-2 Nadir Nadir Matür T Hücreli Neoplaziler o Anaplastik büyük hücreli lenfoma, Anaplastik lenfoma kinaz (ALK) (+) o Periferal T hücreli lenfoma (başka türlü sınıflandırılamayan) 15-20 Nadir WHO sınıflamasında yer alan HDL alt gruplarının tamamı çocukluk çağında görülmekte olup olguların çoğunun 4 büyük histolojik alt grupta toplandığı görülmektedir (2,32). Çocuk ve ergenlerde görülen HDL ların 4 büyük histolojik alt grubu ve görülme sıklıkları Tablo 2 de verilmektedir (6). 6

Tablo 2: Çocukluk Çağı HDL ların Histolojik Alt Grupları (6) HDL Histolojik Alt Grupları Sıklık (%) Burkitt Lenfoma (Klasik ve Burkitt Benzeri Lenfoma) 40 Lenfoblastik Lenfoma (LBL) 30 Yaygın Büyük B Hücreli Lenfoma (YBBHL) 20 Anaplastik Büyük Hücreli Lenfoma (ABHL) 10 2.2. Matür B Hücreli Hodgkin Dışı Lenfomalar Çocukluk çağında görülen matür B hücreli HDL ların çoğu Burkitt lenfoma (klasik ve atipik Burkitt lenfoma) ve YBBHL alt gruplarına aittir. Erişkinlerde nadir olarak görülmesine karşın çocuklarda Burkitt lenfoma sık olarak görülmektedir (Tüm pediatrik HDL olgularının % 40 ı). Çocukluk çağında nadir olarak görülen diğer düşük dereceli matür B hücreli HDL alt grupları ise Folliküler lenfoma (FL) ve Marjinal Zon lenfoma (MZL) dır (5). Pediatrik matür B hücreli HDL lar, pro-proliferatif proteinlerin aşırı ekspresyonuna bağlı olarak, yüksek proliferasyon indeksine sahip neoplazilerdir. Bu özelliklerinden dolayı çocukluk çağı matür B hücreli HDL ların patogenezinde, erişkinlerde daha sık görülen apoptozis defektlerine göre daha fazla oranda görülen anormal proliferasyon sorumlu tutulmaktadır (33). 7

2.2.1. Matür B Hücreli HDL Alt Grupları 2.2.1.1. Burkitt lenfoma (BL) Burkitt lenfoma, monomorfik görünümde orta boyda B hücrelerinden oluşan, sıklıkla ekstranodal tutulum ya da akut lösemi tablosu ile ortaya çıkan, yüksek dereceli agresif bir lenfomadır (7). İlk kez 1958 yılında Dennis Burkitt tarafından Uganda da tanımlanan Burkitt lenfoma çocukluk çağı HDL ların % 40 ını oluşturmaktadır (34). Viral bir patojenle ilişkilendirilen ilk tümör olan BL, onkojen aktivasyonu ile ilişkili translokasyonların tanımlandığı ilk tümörlerden ve insan immün yetmezlik virüsü (HİV) ile ilişkili olduğu bildirilen ilk lenfomadır. Bilinen en hızlı büyüyen (iki katına çıkma süresi 12-24 saat) tümör olmasının yanı sıra, sadece kemoterapi ile iyileşme bildirilen ilk çocukluk çağı kanseridir (13,35). 2008 WHO sınıflamasında matür B hücreli lenfoma başlığı altında yer alan Burkitt lenfomanın birbirinden farklı üç klinik şekli tanımlanmıştır (7): Endemik BL Sporadik BL İmmün yetmezlik bağlantılı BL Bu tümörlerin hepsi morfolojik ve immünfenotipik olarak benzer olsa da epidemiyolojik, klinik bulgular ve bazı genetik özellikler açısından farklılıklar göstermektedir (35). Endemik tip orta-ekvatoryal Afrika da görülüp, hemen tüm olgular EBV ile ilişkilidir. Sporadik tip Batı Avrupa ve Amerika da daha sık görülmekle birlikte özel bir coğrafik dağılım ve bağlantı göstermez. Nadiren EBV ile ilişkilidir (13). Burkitt lenfoma, WHO sınıflamasına göre klasik Burkitt lenfoma ve BL varyantları (plazmasitoid diferansiasyon gösteren BL, atipik Burkitt/Burkitt like lenfoma) olarak da sınıflandırılmaktadır (7). BL, makroskopik olarak büyük solid kitleler şeklindedir. Çoğunlukla tutulan organ kitle tarafından tümüyle infiltre edilmiştir. Sıklıkla hemoraji ve nekroz eşlik etmektedir. Eğer tümör çok büyükse, hangi organ ya da dokudan 8

köken aldığını makroskopik olarak saptamak mümkün olmayabilir. Komşu organ ya da dokular da çoğunlukla tutulmuştur. Endemik ve sporadik BL olgularında nodal tutulum nadir olarak görülmektedir. Genellikle tümör tarafından çevrelenmiş ancak tutulum olmayan lenf nodları izlenmektedir (7,36). Tipik morfoloji, endemik vakaların hemen tümünde, sporadik vakaların ise büyük bir bölümünde izlenir (37,38). BL; hemen daima diffüz bir büyüme şekli gösteren, değişime uğramış lenfoid hürelerin homojenöz proliferasyonudur. Nadiren erken dönem BL olgularında lenf nodunun yalnızca germinal merkezi tutulur. Neoplastik hücreler orta büyüklükte olup histiyositler ile hemen hemen aynı büyüklükte ya da onlardan biraz daha küçük olabilirler. Nükleus yuvarlak, kromatin ise kaba ve granülerdir. Nükleusta merkez çevresinde yerleşim gösteren, orta boyutlu, bazofilik ve birden fazla nükleol bulunur. Sitoplazma koyu bazofilik veya amfofilik olup genellikle lipid vakuolleri içerir. Tümör son derece yüksek bir proliferasyon indeksine sahip olduğundan mitotik figürlere çok sık rastlanır. Apoptozisin çokluğu dikkat çeker. Apoptotik hücreleri fagosite eden normal makrofajların tümör hücreleri içinde dağılmasıyla ortaya çıkan görüntüye yıldızlı gökyüzü manzarası adı verilir. Bu görüntünün BL ya özgü olmadığı, apoptotik indeksi yüksek diğer tümörlerde de görülebileceği unutulmamalıdır (7,36,39,40,41). Burkitt varyantlarının immünolojik ve klinik özelliklerinin yanı sıra morfolojisi de BL ya benzerlik göstermektedir. Burkitt benzeri lenfoma (BBL) da hücresel plemorfizm vardır. Çekirdek büyüklük ve şekillerinin klasik Burkitt lenfomadan farklılık gösterdiği bilinmektedir. Bunun dışında BBL da çok sayıda çekirdekçik bulunmaktadır (42). Burkitt lenfoma, B lenfoid hücre neoplazisidir ve immünhistokimyasal olarak da germinal merkez hücrelerinin fenotipik özelliklerini gösterir: Tüm B hücre belirteçleri (CD19, CD20, CD22, CD79a) ve germinal merkez B hücrelerinde bulunan proteinleri (CD10, BCL-6, CD38, CD40) eksprese ederler. CD10 ve BCL-6 pozitifliği, tümörün germinal merkez orjinli olduğunu gösterir. Yüzey Ig M ve hafif zincir (kappa ve lambda) ekspresyonu görülür. T 9

hücre belirteçleri (CD5, CD23) negatiftir. Terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) negatiftir ve bunun negatif olması LBL lardan ayırt edilmesine yardımcı olur. EBV ile bağlantılı olan BL olgularında (çoğunlukla endemik form) CD21 proteini pozitiftir (7,36,43,44). İmmünhistokimyasal boyamalarda BL hücrelerinde proliferasyon belirleyicisi olan Ki 67 pozitiflik oranı % 99 dan fazla bulunmakta iken BBL nın proliferasyon oranı BL ya göre biraz daha düşük olmakla birlikte (% 90-99) diğer tümörlere göre daha yüksektir (1,13). Sitogenetik incelemelerde Burkitt lenfoma, C-MYC onkogeninin bulunduğu 8. kromozomun uzun kolu (8q24) ile Ig ağır zincir (14. kromozom), kappa hafif zincir (2. kromozom) ya da lambda hafif zincir (22. kromozom) gen bölgelerinden bir tanesi arasında bulunan translokasyon ile karakterizedir (Şekil 1) (45). Şekil 1. Burkitt Lenfomada Görülen C-MYC Gen Lokusunu İçeren Translokasyonlar: A) t(8;14) (q24;q32) B) t(2;8) p12;q24) C) t(8;22) (q24;q11) 10

Translokasyon (8;14) (q24;q32) olguların % 70-80 inde bulunurken, diğer translokasyonlar t(2;8) (p12;q24) ve t(8;22) (q24;q11) % 10-15 olguda saptanır. Bu translokasyonlara bağlı olarak hücre döngüsünde önemli bir role sahip olan MYC onkogeninin Ig gen lokuslarına komşu olmasıyla C-MYC proteini yüksek miktarda, kontrolsüz eksprese edilir. Translokasyonlar MYC geninin farklı tümörlerde, farklı noktalarda etkilenmesine neden olur. Genel olarak endemik formda kırılma noktaları Ig gen bölgeleri içinde yer alırken, sporadik tipte kırılma noktaları MYC genine daha yakındır ve Ig switch bölgelerini içerir. MYC kırılma noktalarındaki farklılıklar muhtemelen EBV enfeksiyonu ile ilişkilidir (13,35,46). Farklı Ig ve C-MYC genlerindeki kırılma noktaları çok değişken olduğundan füzyon genlerin polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile saptanması zordur. Bu nedenle C-MYC translokasyonları karyotipleme ya da floresan in situ hibridizasyon (FİSH) ile daha güvenilir olarak gösterilirler (1,13). Son WHO sınıflamasına göre BL kesin tanısı için C-MYC onkogen lokusunu içeren translokasyonların gösterilmesi gerekmektedir (5). Bununla birlikte C-MYC translokasyonları BL için tam olarak özgül değildir. Diğer B hücreli lenfomalarda gösterildiği gibi, BL olguların % 10 unda MYC genini içeren translokasyonlar saptanmayabilir (13,47). BL ların yarısından fazlasında C-MYC translokasyonlarına ek olarak 13q delesyonu, 1q duplikasyonu ve 6q delesyonu gibi kromozom değişiklikleri de tanımlanmıştır (14,48,49). Burkitt varyantlarının % 85 inde C-MYC translokasyonları görülürken diğer olgularda ise kompleks sitogenetik bozukluklar vardır. Aslında bu durum Burkitt varyantlarının BL ile yakın ilişkili, ancak farklı tümörler olduğu gerçeğini göstermektedir (13). 11

2.2.1.2. Yaygın büyük B hücreli lenfoma (YBBHL) YBBHL, WHO sınıflamasına göre normal lenfositlerin iki katından daha büyük ve doku makrofajları ile aynı boyut ya da daha büyük neoplastik lenfoid hücreler içeren B lenfoid hücrelerin diffüz proliferasyonu olarak tanımlanmaktadır. Bu grup içinde yer alan tümörler heterojen klinik, morfolojik, immünolojik ve sitogenetik özellikler içerdiğinden çok değişken klinik seyir ve belirgin biyolojik heterojenite göstermektedirler (7). Pediatrik HDL olgularının % 20 sini oluşturan YBBHL, ergenlik çağındaki çocuklarda daha sık olarak görülmektedir. YBBHL insidansı tüm çocukluk yaş gruplarında artış göstererek 15-19 yaşları arasında pik yapmaktadır (2). Makroskopik olarak YBBHL, lenf nodlarında balık eti görünümü oluşturur. Genellikle lenf nodunun tümünde tutulum vardır. Nadir olarak parsiyel tutulum da görülebilir. Doku örneklerinde hemoraji ya da nekroz görülebilmektedir. Ekstranodal tutulumda ise, YBBHL bazen fibrozis gösteren geniş invaziv tümör kitleleri şeklinde izlenir (7). YBBHL da büyük lenfoid hücrelerin infiltrasyonu sonucunda normal lenf nodu yapısı tümüyle ortadan kalkar. Bu olaya perinodal infiltrasyon sıklıkla eşlik etmektedir (7,41). Morfolojik olarak YBBHL, büyük transforme lenfoid hücrelerden oluşur, fakat sitolojik olarak birbirinden son derece farklı görünümler oluşturur. Bu morfolojik farklılıklar nedeniyle YBBHL 4 alt gruba ayrılabilir (7,36,39,40,41,50): Sentroblastik varyant İmmünoblastik varyant Anaplastik varyant T hücre/histiyositten zengin varyant YBBHL nın alt tiplendirmesi için yapılan sınıflamaların çoğu halen tam olarak yeterli değildir. REAL sınıflamasında Lenfoblastik ve Burkitt lenfoma 12

dışındaki tüm agresif lenfomalar YBBHL başlığı altında toplanmaktadır, fakat bunun tek bir hastalığı değil birden çok hastalığı içerdiği belirtilmektedir (37). WHO sınıflamasında ise YBBHL ya iki farklı hastalık eklenmiştir (7). İntravasküler büyük hücreli lenfoma Primer effüzyon lenfoması YBBHL da, tümör hücreleri CD19, CD20, CD22 ve CD79a gibi B-hücre belirteçlerini bulundururlar, ancak bunlardan biri veya daha fazlası eksik olabilir. Yüzey ve/veya sitoplazmik immünoglobulin (IgM > IgG > IgA) % 50-75 vakada gösterilebilir (51). Ki 67 ya da MIB-I proliferasyon indeksi genellikle % 40 tan yüksek ve % 90 dan azdır (52). YBBHL, immünfenotipik olarak germinal merkez B hücre benzeri grup (GMB) ve germinal merkez B hücre benzeri olmayan grup (non-gmb) olarak ikiye ayrılmaktadır. Bu ayrım CD10, BCL-6 ve MUM1 belirteçleri kullanılarak yapılır. Hücrelerin % 30 undan fazlası CD10 (+) olan vakalar ve CD10 (-), BCL-6 (+), MUM1 (-) vakalar GMB grup olarak kabul edilirken diğer tüm vakalar non-gmb grubu içinde değerlendirilir (9). Bu sınıflama dışında Alizadeh ve arkadaşları tarafından yapılmış olan ve gen ekspresyon profiline dayanan bir sınıflama daha vardır: Germinal merkez B hücre benzeri ve Aktive B hücre benzeri (53). Bu ayrım özellikle prognostik önem taşımaktadır. Germinal merkez B hücre benzeri olan grubun prognozunun daha iyi olduğu birçok çalışma ile gösterilmiştir (54-56). Gen profil analizine göre bu iki gruba dahil olmayan üçüncü bir grup daha tanımlanmış ve bu grubun prognozlarının aktive B hücre benzeri gruba yakın olduğu gösterilmiştir (54). Pediatrik olgular genellikle germinal merkez B hücre benzeri fenotipe sahiptirler ve prognozları daha iyidir (57). Ayrıca immünfenotip ve gen ekspresyon profiline dayanan bu sınıflamalar arasında uyum olmadığı da belirtilmiştir (58). Çocuk ve ergenlerde görülen YBBHL larda sitogenetik anormallikler özgün olmamasına karşın oldukça tekrarlayıcı özelliktedir. BCL-2 translokasyonları t(14;18) (q32;q21) nadiren görülmekte iken C-MYC onkogeni ile olan translokasyonlar t(8;14) daha sık (pediatrik YBBHL olgularının % 30-13

40 ında) görülmektedir. Olguların hemen tamamında yapısal, yarısından fazlasında da sayısal anormallikler vardır. Olguların çoğunda üç ya da daha fazla sitogenetik bozukluklar görülür (59,60). 3q27 kromozomunda haritalanan BCL-6 geni ile ilgili anormallikler yetişkin YBBHL olgularının % 10-12 sinde saptanırken, çocuklarda bu sıklık bilinmemekte olup olguların < % 10 unda 3q27 de karyotipik anormallikler rapor edilmiştir (59). 2.2.1.3. Primer mediastinal büyük B hücreli lenfoma YBBHL alt gruplarından olan Primer mediastinal (timik) büyük hücreli lenfoma, mediastende timik B hücrelerinden gelişir ve çoğunlukla ergenlerde ve genç erişkin bayanlarda görülür. İmmünfenotipik ve genotipik olarak farklılıklar içermektedir. Morfolojisinde yaygın büyük hücre proliferasyonu, Reed-Stenberg benzeri hücreler ve çeşitli derecede kompartmanlara ayrılmış sklerozis görülür. Bu tipin HL dan ayırt edilmesi immünfenotipik inceleme ile mümkün olacaktır (1,13). Mediastinal büyük B hücreli lenfoma da matür B hücre fenotipine uyacak şekilde CD19, CD20, CD22, CD79a pozitifliği gösterir. Yüzey immünoglobulini bulunmazken sitoplazmik Ig mevcuttur (1). Mediastinal büyük B hücreli lenfomada; MYC, BCL-2 ve BCL-6 genlerinde yeniden yapılanma yoktur (61). 2.2.1.4. Folliküler lenfoma (FL) Erişkin HDL olgularının % 25-30 kadarını oluşturmakta olan FL, çocuk ve ergenlik yaş gruplarında nadir olarak görülmektedir (32,62). Tüm pediatrik HDL olgularının % 3 ünden azını oluşturmaktadır. Üç yaş ve adolesan dönem arasında görülmekte olup erkeklerde daha sıktır (62,63). Germinal merkez fenotipik özelliklerine sahip olup, tüm FL olgularında CD20, BCL-6 ve % 80 CD10 pozitifliği vardır. Erişkinlerde görülmekte olan BCL-2 14

translokasyonları ve BCL-2 protein ifadelenmesi çocuklarda yoktur. Ancak nadiren BCL-2 gösteren ileri evre hastalık ve tedaviye dirençli pediatrik olgular da bildirilmiştir (63). 2.2.1.5. Marjinal zon lenfoma (MZL) Nodal ya da ekstranodal Marjinal zon lenfoma çocuklarda çok nadir olarak görülür. Pediatrik yaş grubunda sadece sporadik MZL olguları rapor edilmiş olup, bunlardan bazıları HİV ile birliktelik göstermektedir (64-66). Marjinal zon lenfoma, mukoza ile birlikte olan lenfoid dokudan (MALT) ve çoğunlukla gastrointestinal sistemden gelişmektedir (66). Etiyopatogenezde Helicobakter pylori nin kronik inflamatuar duruma neden olarak, ekstralenfoid dokuyu arttırarak, lenfoma gelişiminde rol oynadığı gösterilmiştir (67). 2.2.2 Klinik Belirti Ve Bulgular Matür B hücreli HDL olgularında görülen klinik belirti ve bulgular; tümörün histolojik alt grubuna, primer tutulum yerine ve yaygınlığına bağlı olarak farklılıklar göstermektedir (32). Olguların büyük çoğunluğu ileri evrede (evre III- IV) tanı almakta ve tanı anında yaygın gastrointestinal, kemik iliği ya da SSS tutulumu görülmektedir (68). 2.2.2.1. Burkitt lenfoma (BL) Çocukluk çağında BL genellikle ekstranodal yerleşimlidir ve bulgular tümörün yerleşim bölgesine göre değişiklik göstermektedir. Hastalar genellikle hızlı büyüyen tümör kitleleri nedeni ile doktora başvurmaktadır. Başvuru sırasında yüksek LDH düzeyleri ve tümör lizis sendromu (TLS) bulguları saptanmaktadır. Kemik iliği ve santral sinir sistemi tutulumu sırasıyla olguların % 20-40 ve % 10-20 sinde görülür (13). 15

Endemik BL olguları genel olarak (% 60) yüz ya da çenede hızlı büyüyen kitle, dişlerde dökülme/oynama yakınması ile başvururlar. Eşlik eden ya da ayrı bir lezyon olarak orbital ve maksiller tutulum görülebilir. Ek olarak retroperitoneal doku, over, testis, böbrek, meme gibi ekstranodal yayılım görülebilir. Çene tutulumu özellikle 3-7 yaş arasındaki küçük çocuklarda daha sıktır. Paraspinal ya da paravertebral kitlelere bağlı olarak parapleji ve inkontinans % 15 olguda görülebilir. Bu klinik tablo sporadik vakalarda çok nadirdir. Kemik iliği tutulumu gecikmiş olgularda görülmekte olup sıklığı azdır (6,13,68). Sporadik BL olgularında en sık tutulum görülen yer abdomendir (% 60-80) ve % 25 olguda distal ileum tutulumu vardır. Genellikle karın ağrısı, karında kitle ve karın şişliği ile başvururlar. Tanı anında masif asit, intestinal obstrüksiyon bulguları, gastrointestinal kanama görülebilir. Altı yaşından büyük çocuklarda invajinasyonun en sık nedeni lenfomadır. Histopatolojik tutulum her zaman gösterilemese bile mezenterik lenfadenopati ve kızlarda over tutulumu sıktır. Tümör ikinci olarak baş-boyun bölgesinde yerleşir ve nazofarenks, orofarenks, tonsil, sinüs, tükrük bezleri, lenf nodu ve tiroid tutulumu görülebilir. Sporadik olgularda endemik olgulardan farklı olarak çene tutulumu nadir olarak görülür ve sporadik olguların yaklaşık % 20 sinde Kİ tutulumu vardır (1,13,35). Nadir olgularda baş-boyun kitlesi olmaksızın parasellar ya da intrakraniyal ekstradural farklı kitleler saptanabilir. Ek olarak meninks, testis, deri, uterus, meme, safra kesesi, kemik tutulumu görülebilir. Primer beyin tutulumu HIV enfekte olgularda daha sık olmakla birlikte immünkompetan olgularda da bildirilmiştir (6,68). BL olgularında torakal tutulum genellikle plevral effüzyon şeklindedir ve parankimal tutulum görülmez. Bununla birlikte yaygın lenfadenopati ve mediastinal kitle BL olgularında nadir olarak görülür (13). Türkiye de BL nın epidemiyolojik özellikleri Avrupa ve Afrika dan farklılık gösterir. Abdomen tutulumu yüksek oranda (% 69-77) görülmekle birlikte, çene tutulumu da değişik oranlarda (% 5-50) görülmektedir (69-73). Ülkemizde görülen BL olguları, endemik ve sporadik BL arasında klinik bulgular oluşturmaktadır. Bu nedenle Orta Doğu tipi BL olarak da adlandırılır (69,70,73). 16

2.2.2.2. Yaygın büyük B hücreli lenfoma (YBBHL) YBBHL olguları genellikle evre III hastalık olarak tanı alırken; SSS veya kemik iliği tutulumu olan evre IV hastalık nadir (< % 5) olarak görülür (57). Abdomen, baş ve boyun bölgesi (özellikle Waldeyer halkası) en sık görülen başlangıç yerleridir ve sıklıkla tek bölgede ortaya çıkar. Diğer sık görülen yerler periferal lenf bezleri, abdomen (gastrointestinal sistem, mezenter, retroperiton lenf bezleri) ve tek ya da çok sayıda olabilen kemik tutulumlarıdır. Çocukluk çağındaki kalıtsal ya da edinsel immün yetmezlik durumlarında en sık görülen lenfoma alt grubu olan YBBHL, immün yetmezliği olan hastalarda pimer SSS tutulumuna neden olabilir (1,68). YBBHL alt grubu olan mediastinal büyük B hücreli lenfoma lokal olarak invaziftir. Perikarda, plevraya, akciğere ve böbreğe yayılır. Mediastinal kitle sıklıkla vena kava superior sendromu (VKSS) na neden olur (1,74). 2.2.2.3. Folliküler lenfoma (FL) Erişkin dönemde dissemine hastalık tablosu oluşturan FL, çocukluk çağında lokalize hastalık tablosunda karşımıza çıkmaktadır. Servikal lenf nodları ve tonsiller sık tutulum görülen yerler olup ekstranodal bölgelerde (testis, böbrek, gastrointestinal sistem ve parotid bezi) de tutulum görülebilir (62,63). 2.2.2.4. Marjinal zon lenfoma (MZL) Marjinal zon lenfoma olgularının % 90 dan fazlası lokalize lenfadenopati tablosunda tanı almaktadır. Genellikle evre I maligniteler olup H. pylori enfeksiyonu ile ilişkilidirler (75,76). 17

2.2.3. Tanı Ve Evreleme Çocukluk çağı HDL larında hızlı progresyona bağlı olarak hayatı tehdit edebilen VKSS, TLS ve spinal korda bası gibi komplikasyonlar gelişebileceği için HDL tanısında en hızlı ve en az invasif yöntemler tercih edilmelidir (1). HDL tanısı temel olarak histopatolojik ve immünhistokimyasal incelemeler ile konur. Bu incelemeler ile tanı koyulamayan hastalarda sitogenetik ve moleküler incelemeler de yapılabilir. HDL şüphesi taşıyan olgularda tam kan sayımı, periferik yayma, karaciğer ve böbrek fonksiyon testleri, LDH, eritrosit çökme hızı, ürk asit düzeyleri değerlendirilmelidir. Eşlik eden mediastinal lenfadenopati ya da effüzyon açısından akciğer grafisi ve hastalığın yayılımının net değerlendirilebilmesi için toraks ve batın bilgisayarlı tomografilerinin çekilmesi gereklidir. Doku tanısı için çıkarılabilir kitle ya da lenf nodunun eksizyonel biyopsisi yapılır. Çıkarılamayan çok büyük kitlelerden ultrason eşliğinde tru-cut iğne biyopsisi ve malign effüzyon (asit ya da plevra sıvısı) varlığında parasentez ya da torasentez yapılarak sitolojik ve immünfenotip inceleme ile tanı konulur. Özel genetik translokasyonlar, T ve B hücre gen yapılanması için FISH veya kantitatif RT-PCR teknikleri ile moleküler gen ekspresyon profili için oligonükleotid microarray analizleri kullanılabilir (1,13). Baş ve boyun bölgesi, beyin ve medulla spinalise bası durumunda manyetik rezonans görüntüleme (MRG), bilgisayarlı tomografi (BT) ye tercih edilirken; kemik tutulumu olan (YBBHL) olgularda kemik sintigrafisi ve gastrointestinal kanama durumunda endoskopik inceleme yapılmalıdır. Hastalığın yaygınlığının değerlendirilmesinde; Kİ aspirasyonu ve biyopsisi, BOS incelemesi ve günümüzde sıklıkla FDG-PET BT görüntülemeleri kullanılmaktadır (77-79). Evrelemedeki amaç hastalığın yaygınlığının saptanması ve uygun tedavinin planlanmasıdır. Çocukluk çağı HDL larında Murphy tarafından yapılan St.Jude evrelemesi (Tablo 3) kullanılmaktadır (1). 18

Tablo 3: St.Jude Evrelemesi (13) Evre I Mediasten ve abdomen dışı olmak koşuluyla tek bir bölgede ekstranodal tümör ya da nodal tutulum Evre II Tek bir ekstranodal tümör ile birlikte bölgesel lenf nodu tutulumu Diyaframın aynı tarafında iki ya da daha fazla nodal tutulum Diyaframın aynı tarafında iki ekstranodal tümör +/- bölgesel lenf nodu tutulumu Çoğunlukla ileoçekal bölgede çıkarılabilen primer gastrointestinal tümör +/- mezenterik lenf nodu Evre III Diyaframın her iki tarafında yer alan iki ekstranodal tümör Diyaframın her iki tarafında yer alan iki ya da daha fazla lenf nodu tutulumu Tüm primer intratorasik tümörler (mediastinal, plevral ve timik) Tüm yaygın primer intraabdominal hastalık Tümör lokalizasyonundan bağımsız tüm paraspinal veya epidural tümörler Evre IV Tanı sırasında SSS ve/veya kemik iliği tutulumu gösteren yukarıdaki tümörlerden herhangi biri Santral sinir sistemi tutulumu: En az bir kriter yeterli (80) 1) Kraniyal BT ya da MRG de intraserebral kitle 2) Kraniyal sinir felci (Ekstradural kitlenin neden olmadığı) 3) Beyin omurilik sıvısında blast görülmesi Kemik iliği tutulumu: Kemik iliğinde % 5-25 oranında blastik hücre olması 2.2.4. Tedavi Çocukluk çağı HDL ların tedavileri tümörün histopatolojik alt gruplarına, hastalığın yaygınlığına (lokalize: evre I-II ya da yaygın: evre III-IV) ve risk gruplarına göre düzenlenir. Çocukluk çağı HDL tedavisinde başlıca tedavi yöntemi kemoterapi olup cerrahi ve radyoterapinin rolü minimaldir. Son yıllarda SSS profilaksisi için intratekal (IT) ve yüksek doz sistemik kemoterapi (MTX, 19

Ara-C) tedavilerinin kullanılması ön plana çıkmıştır. Özellikle multiajan kemoterapi protokollerinin kullanımı ile HDL prognozunda belirgin bir iyileşme olduğu görülmektedir (1,81). HDL lı hastalarda primer tedaviye başlamadan önce hayatı tehdit edebilecek ya da tedavi başlamayı tehlikeye sokabilecek VKSS, TLS gibi komplikasyonların değerlendirilmesi ve tedavi edilmesi gerekmektedir (82). Matür B hücreli neoplaziler, tanıda blast yükünün fazla, hücre çoğalma hızının yüksek ve tedavi ile tümör yıkımının hızlı olduğu malignitelerdir. Bu özellikler, tümör lizis sendromunun ve buna bağlı gelişen akut böbrek yetersizliğinin sık görülmesine neden olur. Gelişen metabolik komplikasyonlar bir taraftan kemoterapiyi geciktirir ve sınırlarken, bir taraftan da dializ gibi girişim gereksinimlerini ve erken ölümleri arttırır. Tümör lizis sendromu (K, P, ürik asit yüksekliği ve Ca düşüklüğü) nun en önemli komponenti hiperürisemidir. Tedavisinde alkali hidrasyon ile birlikte klasik olarak yıllardır allopurinol kullanılır. Allopurinol ksantin oksidazı inhibe ederek; hipoksantinin ksantine, ksantinin de ürik aside dönüşmesini önler ve bu sayede ürik asit düzeyini düşürür. Hipoksantin, ürik asitten daha kolay çözünürken, ksantinin çözünürlüğü düşük olup, kristalizasyon ve taş oluşumuna neden olabilir. Ayrıca allopurinol daha önceden oluşmuş olan ürik asit üzerine etkili değildir (83). Son klinik çalışmalarda allopurinol yerine rekombinan ürik asit oksidaz (Rasburicase) kullanımı ile ürik asit düzeylerinin daha hızlı düşürüldüğü ve alkali hidrasyona gerek olmadığı gösterilmiştir. Bununla birlikte ürat oksidaz kullanımı ile tümör lizis sendromu ve buna bağlı olarak gelişen akut böbrek yetmezliği sıklığında azalma olduğu gösterilmiştir. Diğer önlemler ile yeterli yanıt alınamayan, böbreklerin tutulduğu ya da üreter tıkanıklığı olan olgularda hemodiyaliz yapılmalıdır (13,78,84). Bir diğer önemli komplikasyon olan VKSS da hastanın başı yüksekte ya da oturur pozisyonda tutulmalı ve genel anestezi verilmesinden kaçınılmalıdır. Anestezi gereksinimi durumunda tümörün küçültülmesi için kortikosteroid ve/veya radyoterapi ya da kemoterapi tedavisi kullanılabilir (1,78). 20

B hücreli HDL larda uygulanan kemoterapi rejimleri BL nın biyolojik ve klinik özelliklerine göre düzenlenir ve YBBHL dahil diğer B-HDL larda da etkilidir. Farklı etki mekanizmalı, örtüşen toksisiteleri olmayan ve SSS ne etkili ajanların, yüksek doz yoğunluğunda, kısa aralar ile verilmesi önerilir (81). Tedavi protokollerinde hızla tekrarlanan 4-7 günlük kürler şeklinde kortikosteroid, vinkristin (VCR), siklofosfamid (CPM) ya da ifosfamid (IFOS), yüksek doz metotreksat (HD-MTX), sitozin arabinozid (Ara-C), etoposid (VP-16) ve üçlü intratekal (MTX, Ara-C, kortikosteroid) tedavi ile geniş, çok merkezli çalışmalarda EFS oranlarının % 90 lara ulaştığı görülmektedir (85). Son yıllarda en çok kullanılan kemoterapi rejimleri; St.Jude Total B LMB BFM-NHL çalışmalarıdır (1,81). Bu tedavi protokollerinden B hücreli NHL-BFM 95 tedavi protokolü Tablo 4 te verilmektedir. 21

Tablo 4: B Hücreli NHL-BFM 95 Tedavi Protokolü (85) Burkitt ve Büyük B Hücreli Lenfomalar EFS (3 yıl) R1 İki kür: A-B % 94 R2 Prefaz ardından 4 kür: A-B-A-B % 94 R3 Prefaz ardından 5 kür: AA-BB-CC-AA-BB % 85 R4 Prefaz ardından 6 kür: AA-BB-CC-AA-BB-CC % 81 A: Dexamethasone, VCR, IFOS, Ara-C, VP-16, MTX (1gr/m2) ve üçlü intratekal tedavi B: Dexamethasone, VCR, CPM, Doksorubisin, MTX (1gr/m2) ve üçlü intratekal tedavi AA ve BB kürlerinde MTX dozu 5gr/m2 ye yükseltilir CC: Dexamethasone, Vindesine, yüksek doz Ara-C, VP-16 ve üçlü intratekal tedavi R3 ve R4 te 5 kür sonunda canlı tümör varsa otolog yüksek doz kemoterapi ve kök hücre nakli planlanmıştır Fransız Pediatrik Onkoloji Grubu (SFOP) B hücreli HDL ları risk gruplarına göre tedavi edebilmek için bir risk sınıflaması oluşturmuş ve St.Jude evrelemesinin uyarlanması ile oluşturulan bu sınıflama uluslararası olarak kabul edilmiştir. Bu sınıflamaya benzer olarak NHL-BFM 95 protokolünde de hastalar risk gruplarına ayrılmakta ve bu risk gruplarına göre tedavi edilmektedir. Risk sınıflamaları Tablo 5 ve 6 da verilmektedir. 22

Tablo 5: B Hücreli HDL İçin Risk Sınıflaması (SFOP) (86) Grup A B Tümör Yaygınlığı Cerrahi olarak tam çıkarılan Evre I Abdominal Evre II tümörler Çok sayıda abdomen dışı tümör Cerrahi olarak çıkarılamayan Evre I, II, III, SSS (-), Kİ < % 25 blast C SSS (+), Kİ % 25 blast (olgun B ALL) Tablo 6: B-Hücreli NHL-BFM 95 Protokolü Risk Grupları (85) R1 Evre I ve II, cerrahi olarak tam çıkarılan R2 R3 R4 Evre I ve II, cerrahi olarak tam çıkarılamayan Evre III ve LDH < 500 U/L Evre III ve LDH 500-999 U/L Evre IV Kİ (+) veya B hücreli lösemi ve LDH < 1000 ve SSS (-) LDH 1000 U/L ve/veya SSS(+) Tedavide cerrahinin yeri, tanı amaçlı biyopsi ya da akut karın tablosunun geliştiği ileo-çekal lokalizasyonlu abdominal B hücreli Hodgkin dışı lenfomalarda laparotomi ve tümör rezeksiyonu ile sınırlıdır (1). Radyoterapinin lokal hastalıkta faydalı olduğunu gösteren çok az veri olup, lokalize hastalığı olan tüm HDL tiplerinde sadece kemoterapi ile çok iyi yanıt alındığı bilinmektedir. Bununla birlikte yaygın nüksleri bulunan hastalarda radyoterapinin uygulanması güç ve toksisitesi fazladır. Sadece lokal nüksleri olan seçilmiş hastalarda bölgesel radyoterapi kullanılabilir (1,13,20). Modern tedavi protokollerinin başarısı ile nüks ve yanıtsız hastalık oranları azalmış, ancak yoğun primer kemoterapi nedeni ile bu olguların tedavisi daha güç 23

hale gelmiştir. Nüksler genel olarak tanı sonrası ilk 2 yıl içinde ortaya çıkmakta ve ilaç direnci büyük bir sorun oluşturmaktadır. Bu olgular için kurtarma rejimleri uygulanmakta, ancak başarı oranları halen % 20-30 düzeyinde kalmaktadır (87,88). Yeterli veri olmamakla birlikte nüks sonrası remisyon sağlanan hastalarda otolog ya da allojenik kök hücre nakli uzun dönem için en iyi tedavi seçeneği olmaktadır (13,35). 2.2.5. Prognoz Sınırlı hastalığı olan HDL olgularında 5 yıllık EFS % 90-95 olup prognoz çok iyidir. İleri evre hastalıkta ise prognoz histolojik alt gruplara göre değişim göstermekle birlikte önceki yıllara göre iyileşme göstermiştir (5 yıllık EFS % 60-90) (86,89). BL da LDH 1000 U/L olması, SSS hastalığı, indüksiyon tedavisine yanıtsızlık, yaş > 15 olması ve YBBHL da ise kızlarda yaş > 14 olması, primer mediastinal tutulum, LDH 500 U/L olması kötü prognostik risk faktörleri olarak kabul edilmektedir (1,20,90). 2.3. Çalışmada Kullanılan İmmünhistokimyasal Belirleyiciler 2.3.1 CD10 CD10, tek zincirli bir hücre yüzey glikoproteinidir ve birçok biyoaktif peptidi parçalayan çinko bağımlı bir peptidaz (metalloproteaz) olarak görev yapar (91,92). CD10, lenfoid germinal merkezlerde, renal tübüllerde, glomerüllerde, sinsityotrofoblastlarda, hepatik parankimal kanaliküllerde ve en önemlisi bazı spesifik lenfoma tiplerinde eksprese olur (93). 24

Prekürsör B lenfoblastik lösemi/lenfoma, Folliküler lenfoma ve Burkitt lenfoma olgularının büyük bir kısmında CD10 ekspresyonu bulunmakta iken; YBBHL ve Mantle hücreli lenfoma olgularında CD10 pozitifliği daha az sıklıkta görülmektedir. Ayrıca hematolojik maligniteler dışında da birçok neoplazide CD10 pozitifliği bulunabilmektedir (94). Germinal merkez belirleyicisi olarak kabul edilen CD10; germinal merkez B hücrelerinin yüzeyinde eksprese olur ve B hücre gelişiminin düzenlenmesinde ve periferal B hücre farklılaşmasında görev alır (36,55,94,95). CD10 ekspresyonu özellikle germinal merkez kökenli olan B hücreli HDL olgularında daha yüksek oranlarda saptanırken; CD10 ekspresyonunun pediatrik YBBHL olgularının % 50 sinde pozitif olduğu ve YBBHL prognozunda olumlu etkisinin olduğu yapılan çalışmalar ile gösterilmiştir (8,9,96). 2.3.2. BCL-6 BCL-6 protein, POZ/zinc finger transkripsiyon reseptörüdür ve hücre siklüs kontrolü, inflamasyon, lenfosit aktivasyonu ve farklılaşmasında görev alır (9,97,98). BCL-6 ekspresyonu, B hücreleri germinal merkeze girdikten hemen sonra başlamakta ve germinal merkezden çıkışa kadar devam etmektedir (9,97). Germinal merkez belirleyicisi olarak kullanılan BCL-6 ekspresyonu; germinal merkezden köken alan Burkitt lenfoma, Folliküler lenfoma ve YBBHL olgularının önemli bir kısmında saptanmaktadır (94,99,100). Normalde B hücre gelişimi sırasında matür B hücrelerinde kromozom 3q27 de haritalanan BCL-6 geni düzenli bir şekilde ifade edilmekte olup, BCL-6 proteini; germinal merkez oluşumunda ve T hücre bağımlı antijen yanıtında önemli rol oynamaktadır (9,59,97). 25

Pediatrik Burkitt lenfoma olgularında BCL-6 ekspresyon oranı % 70-100 olarak bulunmuş olup; BCL-6 ekspresyonunun pediatrik YBBHL olgularının % 50-80 inde pozitif olduğu ve YBBHL prognozunda olumlu etkisinin olduğu yapılan çalışmalar ile gösterilmiştir (9,101,102). 2.3.3. BCL-2 BCL-2 protein, anti-apoptotik bir proteindir ve normal B hücre gelişiminde ve farklılaşmasında önemli rol oynar. BCL-2 ekspresyonu; normal lenfoid hücrelerde pregerminal merkez B hücre evresinde başlamakta ve B hücreleri germinal merkeze doğru göçtükçe giderek azalmaktadır (36). BCL-2 proteinini kodlayan BCL-2 geninde görülen t(14;18) translokasyonu sonucunda; BCL-2 proteininde aşırı ekspresyon meydana gelmekte ve hücreler apoptozdan korunmaktadır. Buna ek olarak, BCL-2 translokasyonu olmaksızın da, agresif HDL larda BCL-2 protein ekspresyonunda artış görülebilmekte ve hücreler apoptozdan korunabilmektedir (103-105). BCL-2 translokasyonu erişkin Folliküler lenfoma ve YBBHL olgularında daha sık oranlarda görülmekte iken; pediatrik olgularda BCL-2 translokasyonunun olmadığı belirtilmektedir. BCL-2 ekpresyonu ise pediatrik YBBHL olgularında % 28-40 oranında görülmekte olup, BCL-2 ekspresyonunun prognoz üzerinde olumsuz etkisinin olduğu gösterilmiştir (10). 2.3.4. MUM1/IRF4 IRF4 olarak da bilinen MUM1, B lenfositlerin aktivasyonu için gerekli olan bir transkripsiyon faktörüdür. İnterferon ve diğer sitokinlere cevaben oluşan gen ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli rol oynar (106). MUM1 protein ekspresyonu, CD10 ve BCL-6 ekspresyonlarından sonra, B hücre farklılaşmasının geç döneminde meydana gelir. Bu nedenle germinal 26

merkezlerin daha açık boyanan geç dönem B lenfositlerinde ve post-germinal merkez B lenfositlerinde pozitiftir (107). MUM1 başlıca YBBHL, primer efüzyon lenfoması, multipl myelom, plazmablastik lenfoma gibi B hücreli neoplazilerde pozitifken, Burkitt lenfoma olgularının çoğunda negatiftir (106). Post-germinal merkez belirteci olarak da kullanılan MUM1 ekspresyonunun, pediatrik YBBHL olgularının prognozu üzerine olumsuz etkisinin olduğu bilinmektedir (10,108). 2.3.5. C-MYC C-MYC geni, 8. kromozomda lokalize olan bir protoonkogendir ve hücre proliferasyon, farklılaşma, matürasyon ve sinyal iletiminde görev alan bir proteini (basic helix-loop-helix) kodlar. Ayrıca malign transformasyon ve devam eden ekspresyonuna bağlı olarak da tümör büyümesinde etkilidir (36,109-112). C-MYC proteini, sadece çoğalan ve farklılaşmamış hücrelerde sentezlenmekte olup; istirahatteki hücrelerde tespit edilmeyecek düzeyde az bulunmaktadır. Normal koşullarda çalışan C-MYC genindeki bazı in situ değişiklikler (translokasyon gibi) bu genin protein üretimi ve diğer fonksiyonları üzerinde etkili olarak değişikliğe uğramasına yani onkogene dönüşmesine yol açar. Sonuç olarak C-MYC proteini sürekli veya fazla salınır. C-MYC geninde ortaya çıkan bu değişiklikler farklı mekanizmalar ile farklı tümörlerin oluşumuna neden olur (113). Hücre çoğalması ve büyümesinde etkili olan bir transkripsiyon faktörü olan C-MYC geninin, B hücrelerinin normal plazma hücrelerine farklılaşmasında baskılanması gerekir. Burkitt lenfoma olgularında, bu C-MYC regülasyonunun bozulması, B hücre farklılaşmasını önlemekte ve onkojenik aktivite kazandırmaktadır (33,114,115). 27

Son WHO sınıflamasında BL kesin tanısı için C-MYC onkogen lokusunu içeren translokasyonların gösterilmesi gerektiği belirtilmiş olmasına karşın; C- MYC translokasyonları BL için tam olarak özgül değildir. % 10 BL olgusunda C- MYC translokasyonu gösterilememekle birlikte; diğer B hücreli lenfomalarda da C-MYC translokasyonu görülebilmektedir (5,13,47). Pediatrik YBBHL olgularının % 25-35 inde C-MYC translokasyonunun pozitif bulunmuş olması bu durumu açıklar niteliktedir (10). 2.3.6. TCL1 TCL1(Proto-onkogen T Hücre Lösemi-1), güçlü bir B hücre onkogenidir. Son dönem çalışmalarda TCL1 ekspresyonunun B hücreli HDL prognozunda etkisinin olduğu gösterilmiş olmasına karşın, çocukluk çağı döneminde ekspresyonunun artması ile ilgili bilgi çok azdır (11). Agresif B hücreli lenfomalarda C-MYC translokasyonu ile TCL1 ekspresyonu arasında yakın bir ilişki olduğu tanımlanmış ve C-MYC translokasyonu görülen olgularda % 86 oranında TCL1 ekspresyonu pozitif olarak bulunmuştur (12). Burkitt lenfoma olgularında TCL1 ekspresyonu yüksek oranda pozitif bulunurken; diğer B hücreli HDL larda (YBBHL, folliküler lenfoma, mantle hücreli lenfoma, splenik B hücreli lenfomalarda) TCL1 ekspresyon oranının farklılık gösterdiği saptanmıştır. Pediatrik YBBHL larda iyi prognoz etkeni olarak kabul edilen TCL1 ekspresyonu, nodal YBBHL olgularında % 31 oranında pozitif olarak bulunmuştur (8,10). 28

3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Hasta Seçimi: Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Onkoloji Bilim dalında 1991-2012 yılları arasında matür B hücreli HDL tanısı alan toplam 85 hastadan, patolojik değerlendirmesi Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim dalında yapılan, 62 hasta çalışmaya alındı. Hasta izleminde kullanılan dosyalar retrospektif olarak incelendi ve hastaların tanı yaşı, cinsiyeti, klinik semptomları, şikayet ile tanı arasındaki süre, predispozan faktörler, primer tümör yeri ve diğer tutulum alanları, hastalık evresi, risk grubu, histopatolojik tanısı, tanı anındaki LDH düzeyleri, tanı yöntemleri, onkolojik acil varlığı, aldıkları tedaviler, tedaviye yanıt durumları, nüks varlığı ve izlem süreleri tespit edildi. Bu hastalardan patolojik preparatları halen Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim dalında mevcut olan ve yapılacak incelemeler için yeterli doku örneği bulunan toplam 27 hasta immünhistokimyasal çalışmalara dahil edildi. 27 hastadan oluşan bu grup içindeki tüm olguların Hematoksilen-Eozin ve immünhistokimyasal boyalı preparatları retrospektif olarak WHO kriterlerine göre değerlendirildi. Hasta dosyalarının incelenmesiyle tespit edilen ve immünhistokimyasal çalışmalar sonucunda bulunan tüm veriler ile prognoz arasındaki ilişki hastaların yaşam analizleri yapılarak irdelendi. 3.2. İmmünhistokimyasal Yöntem: Formalin ile tespit edilen dokulara ait parafin bloklardan 4 adet 1 mm çaplı temsili korlar elde edilerek doku dizinleri hazırlandı. Dört mikrometre kalınlıkta kesitler polilizinli lamlara alındı. BCL-2, BCL-6, CD10, MUM-1 ve TCL-1 ekspresyonunu belirlemek için streptavidin-biyotin üçlü indirekt immünperoksidaz yöntemi kullanılarak immünhistokimyasal boyama yapıldı. Kullanılan antikorlara ait özellikler: BCL-2 (Mouse monoklonal, klon 124 29

DakoCytomation), BCL-6 (Mouse monoklonal, klon PG-B6p, 1:50 dilüsyon, DakoCytomation), CD10 (Mouse monoklonal, klon 56C6, kullanıma hazır, NovoCastra), MUM-1 (Mouse monoklonal,klon MUM1p, DakoCytomation) ve TCL-1 (Rabbit poliklonal, klon TCL-1, kullanıma hazır, NovoCastra). Tüm antikorlar için pozitif kontrol olarak tonsil dokusu kullanıldı. Tüm immünhistokimyasal boyamalar Ventana Benchmark XT otomatik cihazda yapıldı. Otomatik cihazda işlem bitince lamlar manuel olarak işleme tabi tutuldu: 1. Detarjanlı çeşme suyu ile 5 dakika yıkandı. 2. Dehidratasyon için toplam 5 dakika bekletilerek sırasıyla % 70, % 80 ve % 100 alkolden geçirilerek dehidratasyonları sağlandı. 3. Beşer dakika iki farklı ksilolde şeffaflaştırılmak üzere bekletildi. 4. Entellan ile kapatıldı. 3.3. Boyanma Derecelerinin Değerlendirilmesi: Boyanma derecesi yarı kantitatif bir yöntemle değerlendiridi. Pozitif boyanan tümör hücrelerinin tüm tümör dokusuna oranı belirlendi. Tümör hücrelerinin % 30 dan fazlası boyanmışsa pozitif olarak kabul edildi. Boyanan tümör hücrelerinin oranı % 30 dan az ise negatif olarak kabul edildi. CD10, BCL- 2 ve TCL-1 için membranöz boyanma, BCL-6 ve MUM-1 için nükleer boyanma pozitif kabul edildi. 3.4. İn Situ Hibridizasyon: Aynı doku dizinlerinden hazırlanan kesitler EBER in situ hibridizasyon çalışması için Ventana Benchmark XT otomatik boyama cihazında EBER (Ventana) ile boyama uygulandı. 30

3.5. Floresan İn Situ Hibridizasyon (FISH) Yöntemi: Pozitif şarjlı lam üzerine alınan 2 mikron kalınlığındaki kesitler 56 C lik etüvde 12 saat bekletilerek deparafinize edildi. 1. Üç kez 10 ar dakika süre ile % 100 ksilol içeren şalede oda sıcaklığında bekletildi. 2. İki kez 5 er dakika süre ile % 100 etanol içeren şalede oda sıcaklığında bekletildi. 3. Hotplate (45-50 derecelik) üzerinde 2-5 dakika kurutuldu. 4. Yirmi dakika süre ile 2 N HCL içeren şalede oda sıcaklığında bekletildi. 5. Üç dakika süre ile distile su içeren şalede oda sıcaklığında bekletildi. 6. Üç dakika süre ile wash buffer içeren şalede oda sıcaklığında bekletildi. 7. Otuz dakika süre ile 80 derecelik su banyosunda önceden bu ısıya getirilmiş pretreatment solüsyonu (Tissue Digestion Kit I, Kreatech) içeren şalede inkübe edildi. 8. Lamlar 1 dakika süre ile distile su içeren şalede oda sıcaklığında bekletildi. 9. İki kez 5 er dakika süre ile wash buffer içeren şalede oda sıcaklığında bekletildi. 10. On dakika süre ile 37 derecelik etüvde önceden bu ısıya getirilmiş protease solution içeren şalede bekletildi. 11. İki kez 5 er dakika süre ile wash buffer içeren şalede oda sıcaklığında bekletildi. 12. Hotplate (45-50 derecelik) üzerinde 2-5 dakika kurutuldu. 13. On dakika süre ile % 10 tamponlanmış formalin içeren şalede oda sıcaklığında bekletildi. 14. İki kez 5 er dakika süre ile wash buffer içeren şalede oda sıcaklığında bekletildi. 15. Hotplate (45-50 derecelik) üzerinde 2-5 dakika kurutuldu. 31

16. Her birinde 3 er dakika bekletilerek sırasıyla % 70, % 85 ve % 100 lük etanolden geçirildi. 17. Hotplate (45-50 derecelik) üzerinde 2-5 dakika kurutuldu. 18. Bundan sonraki aşamalar karanlıkta gerçekleştirildi. 19. Önceden oda ısısına getirilmiş prob tüpü vortekslendi, mikrosantrifüjde spin atıldı ve tekrar vortekslendi. 20. Her bir lamın hedef alanına 10 mikrolitre prob (MYC (8q24) Break apart ve BCL-2 (18q24) Break apart, Kreatech) damlatıldı ve hemen uygun boyutta bir lamelle hava kabarcığı kalmayacak şekilde kapatıldı. 21. Lamellerin etrafı rubber cement ile çevrelendi. 22. Lamlar Hybrite cihazına yerleştirilip kapağı kapatıldı ve önceden programlanan prosedür başlatıldı. (denatürasyon 73 C 5 dakika, Hibridizasyon 37 C 16 saat) 23. Bir gece hibridizasyondan sonra lamların üzerinden rubber cement ayrıldı ve oda ısısındaki yıkanma solüsyonu içeresinde çalkalanarak lamellerin ayrılması sağlandı. 24. İki dakika süre ile su banyosunda önceden 73 dereceye getirilmiş olan yıkanma solüsyonu içerisinde bekletildi. 25. Lamlar oda ısısında distile su içeren şaleye batırılıp çıkarıldıktan sonra karanlıkta kurumaya bırakıldı. 26. Her bir hibridizasyon alanına 10 mikrolitre 4 6-diamidino-2- phenylinodole (DAPI II Counterstain, Kreatech) damlatılarak uygun boyutta lamelle kapatıldı. Lamlar analiz öncesi en az 15 dakika buzdolabında bekletildi. 3.6. FISH Değerlendirilmesi: BCL-2 ve MYC break-apart probları için her bir preparatta 200 tümör hücresi sayıldı ve bu 200 hücre içinde pozitif hücrelerin yüzdeleri hesaplandı. 32

BCL-2 Prob ve MYC için % 10 un üzerinde hücrede bir füzyon, bir kırmızı ve bir yeşil sinyalin varlığı pozitif kabul edildi. 3.7. İstatistiksel Analiz: Verilerin analizi SPSS for Windows 11.5 paket programında yapıldı. Tanımlayıcı istatistikler sürekli ve kesikli sayısal değişkenler için ortalama ± standart sapma veya medyan (minimum maksimum) şeklinde, kategorik değişkenler ise olgu sayısı ve (%) biçiminde gösterildi. Olaysız ve genel sağkalım üzerinde kategorik değişkenlerin istatistiksel olarak anlamlı etkisinin olup olmadığı Log-Rank testi kullanılarak değerlendirildi. Ayrıca Kaplan Meier yöntemi ile sağkalım analizleri yapıldı. Her bir değişkene ilişkin 1, 3 ve 5 yıllık sağkalım hızları ve beklenen ortalama yaşam süreleri ve bu sürelere ilişkin % 95 güven aralıkları hesaplandı. Olaysız ve genel sağkalım üzerinde sürekli ve kesikli sayısal değişkenlerin istatistiksel olarak anlamlı etkisinin olup olmadığı ise Tek Değişkenli Cox un Oransal Hazard Regresyon analizi kullanılarak değerlendirildi. Ayrıca, her bir değişkene ilişkin rölatif risk ve % 95 güven aralığı hesaplandı. Tek değişkenli istatistiksel analizler sonucunda olaysız ve genel sağkalım üzerinde etkili bulunan değişkenler ile klinik olarak etkili olabileceği düşünülen risk faktörlerinin birlikte etkilerini incelemek üzere Çoklu Değişkenli Geriye Dönük Adımsal Elemeli Cox un Oransal Hazard Regresyon analizi kullanıldı. Tek değişkenli analizlerde P < 0.25 olarak saptanan değişkenler aday risk faktörleri olarak çoklu değişkenli modele dahil edildi. C-MYC translokasyonu ile TCL1 ekspresyonu arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için Pearson korelasyon analizi kullanıldı. P < 0.05 için sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. 33

4. BULGULAR Çalışmaya alınan toplam 62 hastanın 51 i (% 82.3) erkek ve 11 i (% 17.7) kız olup; median yaş 8 yaş (3-16 yaş) olarak bulunmuştur. Hastaların 41 i (% 66.1) Burkitt lenfoma, 19 u (% 30.6) YBBHL olgusu iken birer hasta (% 1.6) Folliküler lenfoma ve Marjinal zon lenfoma tanısı almıştır. Çalışmada yer alan hastaların primer tutulum alanlarına bakıldığı zaman; en sık primer tutulumun abdomende (33 olgu; % 53.2) olduğu, bunu baş-boyun bölgesinin (27 olgu; % 43.5) izlediği, bunların dışındaki diğer 2 hastada ise tümörün mediasten ve paravertebral bölgeden (birer olgu; % 1.6) kaynaklandığı saptanmıştır. Hastaların histopatolojik tanıları için 16 hastada total rezeksiyon, 5 hastada subtotal rezeksiyon ve 41 hastada ultrason eşliğinde kitleden tru-cut biyopsi yapıldığı görülmüştür. Tüm gruba ait olan genel demografik özellikler Tablo 7 de verilmektedir. 34

Tablo 7: Olguların Demografik Özellikleri Demografik Özellik Sayı (n=62) Yüzde (%) Yaş Grupları 5 yaş altı 8 (7 Erkek 1 Kız) 12,9 5 10 yaş 35 (26 Erkek 9 Kız) 56,5 11 15 yaş 17 (16 Erkek 1 Kız) 27,4 15 yaş üstü 2 (2 Erkek) 3,2 Cinsiyet Erkek 51 82,3 Kız 11 17,7 Primer Tümör Yerleşimi Baş Boyun Çene Mandibula Maksilla 5 8,1 Göz Tonsil Servikal Lenf Nodu 22 35,4 Nazofarenks Abdomen 33 53,2 Mediasten 1 1,6 Paravertebral bölge 1 1,6 Ayrıca hastaların primer tutulum alanı dışında tanı anında tutulum saptanan diğer bölgeleri Tablo 8 de verilmektedir. 35

Tablo 8: Hastaların Primer Tutulum Alanı Dışındaki Diğer Tutulum Bölgeleri Tutulum Bölgesi Sayı (n=62) Yüzde (%) Akciğer 15 24,2 Karaciğer 14 22,6 Dalak 13 21,0 Kemik İliği 13 21,0 Böbrek 12 19,4 Kemik 4 6,5 Adrenal 3 4,8 Deri 2 3,2 Pankreas 2 3,2 Santral Sinir Sistemi 1 1,6 Testis 1 1,6 Tiroid 1 1,6 Diğer (Lakrimal bez) 1 1,6 Yaptığımız çalışmada bu tutulum bölgelerinden özellikle SSS ve Kİ tutulumunun prognoz üzerine etkisine bakılmıştır. SSS tutulumunun hem genel (OS) hem de olaysız yaşam (EFS) oranları üzerinde istatistiksel olarak anlamlı etkilerinin (P = 0.003, P = 0.028) olduğu gösterilmiştir. Buna karşın Kİ tutulumu ile prognoz arasında istatistiksel olarak anlamlı bir bağıntı (P > 0.05) saptanamamıştır. Hastalarda varlığı araştırılan predispozan faktörlerden immün yetmezliğin sadece 2 hastada (% 3.2) mevcut olduğu ve bu hastaların YBBHL histolojik alt grubuna ait olduğu görülmüştür. Bir hastada selektif IgA eksikliği varken diğer hastada kombine immün yetmezlik mevcuttu. Bununla birlikte bakılan bir diğer 36

predispozan faktör olan geçirilmiş EBV enfeksiyonunun toplam 8 (% 12.9) hastada mevcut olduğu saptanmıştır. Yaptığımız çalışmada predispozan faktörlerden immün yetmezliğin hem genel (OS) hem de olaysız yaşam (EFS) oranları üzerine istatistiksel olarak anlamlı etkilerinin (P = 0.009, P < 0.001) olduğu gösterilmiştir. Buna karşın EBV enfeksiyonu ile yaşam oranları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir bağıntı (P > 0.05) saptanamamıştır. Hastaların şikayet başlangıcı ile başvuru arasındaki sürenin median 20 gün (5 180 gün) olduğu görülmüştür. En sık başvuru şikayetinin 53 hastada (% 85.5) görülen hızlı büyüyen kitle olduğu saptanmıştır. Hastalarda görülen tüm başvuru şikayetleri ve sıklıkları Tablo 9 da verilmektedir. 37

Tablo 9: Tüm Grubun Başvuru Şikayetleri Şikayet Sayı (n=62) Yüzde (%) Kitle 53 85,5 Karın ağrısı 29 46,8 Halsizlik 29 46,8 İştahsızlık 25 40,3 Bulantı kusma 20 32,3 Kilo kaybı 19 30,6 Ateş 15 24,2 Gece terlemesi 14 22,6 İshal kabızlık 9 14,6 Baş ağrısı 6 9,7 Burun tıkanıklığı horlama 6 9,7 Nefes darlığı 5 8,1 Öksürük 4 6,5 Ağrılı yutkunma 4 6,5 İdrar renk ve miktar değişiklikleri 4 6,5 Ağız ve burundan kan gelmesi 2 3,2 Ses kısıklığı 2 3,2 Solukluk 2 3,2 Proptozis 2 3.2 Hastalarda saptanan onkolojik acillerin dağılımı Şekil 2 de verilmekte olup; yaptığımız çalışmada hastalarda en sık karşılaşılan onkolojik acil durumunun tümör lizis sendromu (TLS) olduğu görülmüştür. 38

56,50% 21% 16,10% 3,20% 3,20% Tümör Lizis Sendromu İnvaginasyon Vena Kava Superior Sendromu Spinal Kord Basısı Şekil 2. Hastalarda Görülen Onkolojik Aciller (n=62) Hastaların histolojik alt grup, evre ve risk gruplarına göre dağılımı Tablo 10 da verilmekte olup; hastaların büyük çoğunluğunun (% 75.8) ileri evre hastalık (evre III-IV) tablosunda geldiği görülmüştür. Yaptığımız çalışmada hastaların evrelerine özgü EFS oranları arasında belirgin fark (evre I: % 100, evre II: % 92.3, evre III: % 89.7 ve evre IV: 68.4) olduğu görülmüş olmasına karşın; hastalık evresi ile prognoz arasında istatistiksel olarak anlamlı bir bağıntı (P > 0.05) saptanamamıştır. Bununla birlikte yaptığımız çalışmada hastaların risk gruplarına özgü EFS oranları arasında da belirgin bir fark (R1: % 100, R2: % 95.6, R3: % 91.7 ve R4: % 41.7) olduğu görülmüş ve risk grupları ile EFS arasında istatistiksel olarak anlamlı bir bağıntı (P = 0.002) olduğu bulunmuştur. Yaptığımız çalışmada hastaların histolojik alt grupları arasında prognoz açısından farklılık (P > 0.05) olmadığı saptanmıştır. Hastaların tanı anındaki LDH düzeylerinin dağılımı Tablo 10 da verilmekte olup; tüm hastaların median LDH düzeyi 398 IU/L (51 2348 IU/L) olarak bulunmuştur. Ayrıca yaptığımız çalışmada LDH düzeyleri ile EFS arasında istatistiksel olarak anlamlı bir bağıntı (P = 0.006) olduğu ve özellikle LDH 39

düzeyinin 1000 IU/L olması durumunda hastaların 5 yıllık EFS oranlarının düştüğü (5 yıllık EFS % 50) gösterilmiştir (Tablo 13). Ancak LDH düzeyleri ile OS arasında istatistiksel olarak anlamlı bir bağıntı (P = 0.299) bulunamamıştır. Tablo 10: Tüm Grubun Klinik Ve Laboratuvar Özellikleri Klinik Ve Laboratuvar Özellik Sayı (n=62) Yüzde (%) Histolojik Alt Grup Burkitt ve Burkitt benzeri 41 66,1 YBBHL 19 30,6 Folliküler lenfoma 1 1,6 Marjinal zon lenfoma 1 1,6 Evre Evre I 2 3,2 Evre II 13 21,0 Evre III 32 51,6 Evre IV 15 24,2 Risk Grupları Risk grubu I 1 1,6 Risk grubu II 23 37,1 Risk grubu III 26 41,9 Risk grubu IV 12 19,4 Tanı Anındaki LDH Düzeyi 500 IU/L 35 56,5 500 1000 IU/L 16 25,8 1000 IU/L 11 17,7 Çalışmada yer alan hastalardan sadece Marjinal zon lenfoma tanısı almış olan bir hastanın tedavisi subtotal rezeksiyon sonrası radyoterapi ile yapılmış 40

olup; diğer tüm hastaların tedavisinde kemoterapi (61 olgu; % 98.4) primer tedavi yöntemi olarak yer almıştır. Ayrıca BFM-90 ve BFM-95 kemoterapi protokollerine göre tedavi edilen hastalarda, uygulanan kemoterapi protokolleri ile elde edilen yaşam oranları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark (P > 0.05) olmadığı gösterilmiştir. Hastalardan 5 i erken dönemde takipten çıktığı için toplam 57 hastanın klinik izlem verilerine ulaşılabilmiştir. Klinik izlem verilerine ulaşılan bu 57 hastanın indüksiyon sonrası yanıt durumu Tablo 11 de verilmektedir. Bu hastalardan tam yanıt saptanan tüm hastaların takip süresi sonunda hayatta olduğu görülmüştür. Klinik izlem verilerine ulaşılan hastaların genel ve olaysız sağkalım analizleri Tablo 12 ve 13 te verilmektedir. Yaptığımız çalışmada iki kür sonunda tam yanıt elde edilen olguların indüksiyon sonrası yanıt durumu ile genel yaşam oranı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir bağıntı (P = 0.0189) olduğu gösterilmiştir. Ancak tam yanıt alınan olgularda indüksiyon sonrası yanıt durumu ile olaysız yaşam oranı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir bağıntı (P = 0.065) bulunamamıştır. İndüksiyon sonrası yanıt durumu değerlendirilen hastalardan rezistan ve progresif hastalık grubunda yer alan 3 hastanın median 1 yıllık (9 ay 2 yıl) takip süresi sonunda kaybedildiği görülmüştür. Bu durumun sonucu olarak da çalışmamızda hem rezistan hem de progresif hastalığın genel ve olaysız yaşam oranları üzerine olumsuz etkilerinin (Rezistan hastalık: P < 0.001, P < 0.001 Progresif hastalık: P < 0.001, P = 0.014) olduğu gösterilmiştir. 41

Tablo 11: Hastaların Tedavi Yanıt Durumları Ve Bunların Sağkalım İle İlişkisi İndüksiyon Sayı (n=57) Yüzde (%) 5 yıllık P 5 yıllık P değeri Sonrası Değerlendirme OS (%) değeri EFS (%) Tam yanıt 25 43,8 100 0.019 100 0.065 Kısmi yanıt 29 50,8 92 0.468 84 0.953 Rezistan hastalık 2 3,6 - < 0.001 - < 0.001 Progresif hastalık 1 1,8 - < 0.001-0.014 Klinik izlem verilerine ulaşılan 57 hastanın izlem süreleri median 5 yıl (3 ay 17 yıl) olarak belirlenmiş ve takip süresi sonunda sadece 4 hastada nüks olduğu görülmüştür. Hastaların tanı sonrası nüks görülme zamanı median 5.5 ay (5 9 ay) olarak bulunmuştur. Primer tutulum bölgeleri abdomen olan bu nüks hastalarından 2 sinde nüks bögesinin primer tutulum bölgesi olduğu saptanırken; diğer 2 sinde ise nüksün mediasten ve L3 vertebrada olduğu görülmüştür. Nüks görülen hastaların tedavisinde 3 hastaya ikincil kemoterapi ve ardından radyoterapi verilmiş olup; 1 hastada ikincil kemoterapi sonrası otolog kök hücre nakli yapılmıştır. Kök hücre nakli yapılan hastanın takip süresi sonunda hayatta olduğu görülürken; diğer tedavi yöntemi uygulanan 3 hastadan 2 si median 9.5 aylık (9 10 ay) takip süresi sonunda kaybedilmiştir. Sonuç olarak yaptığımız çalışmada nüks varlığı ile genel yaşam oranı arasında kuvvetli bir istatistiksel bağıntı (P < 0.001) olduğu gösterilmiştir. Çalışma kapsamında yapılan çok değişkenli analiz çalışmalarında hem OS hem de EFS üzerinde etkisi en çok olan durumun immün yetmezlik olduğu görülürken; EFS üzerinde etkisi en çok olan ikinci durumun ise LDH düzeylerindeki artış olduğu görülmüştür. LDH düzeyleri ile EFS arasındaki ilişkiyi gösteren Kaplan Meier eğrileri Şekil 3 de verilmektedir. 42

Şekil 3. Tüm Olguların LDH Düzeylerine Göre Olaysız Kümülatif Yaşam Hızını Gösteren Kaplan Meier Eğrileri (n=57) 43

Tablo 12: Hastaların Genel Sağkalım (OS) Analizi (n=57) Sağkalım Hızları % Yaşam Süresi * Log- p-değeri 1 3 Yıllık 5 Yıllık (%95 Güven Rank Yıllık Aralığı) Histoloji 0,25 0,969 Burkitt ve Burkitt Benzeri 91,9 88,8 88,8 182,4 (162,5-202,4) Lenfoma YBBHL 94,1 87,8 87,8 70,4 (142,3-198,5) Folliküler Lenfoma 100,0 HY HY HY MZL 100,0 100,0 HY HY Evre 0,64 0,887 I 100,0 100,0 100,0 HY II 91,7 91,7 91,7 188,0 (157,9-218,0) III 93,1 89,1 89,1 172,6 (151,8-193,4) IV 92,3 83,9 83,9 162,5 (125,0-200,0) Risk Grubu 6,69 0,083 I 100,0 100,0 100,0 HY II 95,4 95,4 95,4 195,3 (178,6-212,0) III 95,8 91,0 91,0 176,1 (155,1-197,2) IV 77,8 64,8 64,8 128,2 (69,6-186,9) SSS Tutulumu 8,82 0,003 Yok 92,7 90,7 90,7 186,2 (171,3-201,1) Var 0,0 - - 13,0 (13,0-13,0) Kİ Tutulumu 0,02 0,885 Yok 93,3 88,4 88,4 182,0 (163,8-200,2) Var 90,9 90,9 90,9 174,9 (143,0-206,8) LDH Düzeyi 2,42 0,299 500 97,1 91,0 91,0 187,1 (168,8-205,3) 500-1000 92,9 92,9 92,9 178,6 (153,2-203,9) 1000 75,0 75,0 75,0 146,4 (91,6-201,1) İmmün Yetmezlik 6,84 0,009 Yok 92,7 90,7 90,7 185,9 (170,9-201,0) Var 100,0 - - 24,0 (24,0-24,0) EBV Enfeksiyonu 0,05 0,825 Yok 91,8 89,5 89,5 172,9 (157,1-188,8) Var 100,0 85,7 85,7 178,3 (131,6-224,9) Şikayet Süresi 1,59 0,452 1 ay 90,9 84,2 84,2 173,9 (149,6-198,2) 1-3 ay 95,0 95,0 95,0 182,6 (164,4-200,6) >3 ay 100,0 100,0 100,0 HY Kemoterapi Protokolü 0,03 0,855 Diğer 93,3 89,6 89,6 173,5 (153,6-193,3) 44

BFM90 92,3 88,1 88,1 181,0 (156,6-205,5) Kemoterapi Protokolü 0,01 0,917 Diğer 93,1 89,4 89,4 183,5 (161,5-205,5) BFM95 92,6 88,4 88,4 118,3 (103,6-132,9) Nüks 20,06 <0,001 Yok 100,0 97,7 97,7 199,7 (191,2-208,1) Var 50,0 50,0 50,0 64,7 (10,6-118,9) Genel 92,9 88,9 88,9 182,7 (166,6-198,8) - - * Beklenen yaşam süresi (ay) HY: Hesaplama Yapılamadı Tablo 13: Hastaların Olaysız Sağkalım (EFS) Analizi (n=57) Değişkenler Sağkalım Hızları % Yaşam Süresi * Log- p- 1 Yıllık 3 Yıllık 5 Yıllık (%95 Güven Aralığı) Rank değeri Histoloji 0,52 0,914 Burkitt ve Burkitt Benzeri Lenfoma 89,2 86,2 86,2 176,7 (154,4-199,0) YBBHL 82,3 82,3 82,3 158,8 (124,7-192,9) Folliküler Lenfoma 100 HY HY HY MZL 100 100 HY HY Evre 3,68 0,299 I 100,0 100,0 100,0 HY II 92,3 92,3 92,3 188,5 (159,4-217,6) III 89,7 89,7 89,7 172,6 (151,8-193,4) IV 76,9 68,4 68,4 133,5 (85,8-181,1) Risk Grubu 15,20 0,002 I 100,0 100,0 100,0 HY II 95,6 95,6 95,6 195,3 (178,5-212,0) III 91,7 91,7 91,7 176,3 (155,4-197,1) IV 55,6 41,7 41,7 84,0 (21,5-146,6) SSS Tutulumu 4,83 0,028 Yok 87,3 87,3 87,3 178,7 (161,2-196,2) Var 0,0 - - 13,0 (13,0-13,0) Kİ Tutulumu 1,89 0,169 Yok 91,2 88,7 88,7 181,7 (163,2-200,1) Var 72,7 72,7 72,7 140,9 (91,6-190,2) LDH Düzeyi 10,30 0,006 500 94,3 91,2 91,2 186,7 (168,0-205,4) 500-1000 92,9 92,9 92,9 178,6 (153,2-203,9) 1000 50,0 50,0 50,0 98,5 (33,7-163,3) İmmün Yetmezlik 27,50 <0,001 Yok 89,1 87,1 87,1 178,4 (160,7-196,1) Var - - - 3,0 (3,0-3,0) EBV Enfeksiyonu 0,00 0,961 45

Yok 87,8 85,5 85,5 165,0 (146,4-183,5) Var 85,7 85,7 85,7 175,3 (123,2-227,4) Şikayet Süresi 1,14 0,566 1 ay 85,0 81,6 81,6 167,6 (141,1-193,9) 1-3 ay 90,0 90,0 90,0 173,2 (148,6-197,9) >3 ay 100,0 100,0 100,0 HY Kemoterapi Protokolü 0,02 0,883 Diğer 86,9 86,9 86,9 167,3 (144,7-189,9) BFM90 88,5 84,2 84,2 173,0 (145,0-200,9) Kemoterapi Protokolü 0,03 0,856 Diğer 89,7 85,9 85,9 176,3 (151,1-201,5) BFM95 85,4 85,4 85,4 113,3 (96,4-130,2) Genel 87,6 85,6 85,6 175,3 (157,0-193,7) - - * Beklenen yaşam süresi (ay) HY: Hesaplama Yapılamadı Çalışma sonucunda 4 ü Burkitt lenfoma ve 2 si YBBHL olgusu olan toplam 6 hastanın kaybedildiği görülmüştür. Bu hastalardan 5 i hastalık progresyonu nedeni ile kaybedilirken; diğer bir hasta takipte gelişen pnömoni nedeni ile kaybedilmiştir. Hastaların eksitus süresi median 11 ay (4 ay 2 yıl) olarak bulunmuştur. Hastaların genel ve olaysız yaşam eğrileri Şekil 4 ve 5 de verilmekte olup, hastaların 5 yıllık genel (OS) ve olaysız (EFS) yaşam oranları sırasıyla % 89 ve % 86 olarak bulunmuştur. 46

Olaysız Sağkalım Hızı Genel Sağkalım Hızı 1,00,80,60,40,20 0,00 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 12 36 60 84 108 132 156 180 204 Takip Süresi (ay) Şekil 4. Tüm Olguların Genel Yaşam Hızını Gösteren Kaplan Meier Eğrisi (n=57) 1,00,80,60,40,20 0,00 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 12 36 60 84 108 132 156 180 204 Takip Süresi (ay) Şekil 5. Tüm Olguların Olaysız Kümülatif Yaşam Hızını Gösteren Kaplan Meier Eğrisi (n=57) 47

İmmünhistokimyasal çalışmaya alınan toplam 27 hastadan 23 ü (% 85.2) erkek ve 4 ü (% 14.8) kız olup; median yaş 9 yaş (3 16 yaş) olarak bulunmuştur. Bu hastaların 14 ü (% 51.9) Burkitt lenfoma, 11 i (% 40.7) YBBHL olgusu iken birer hasta Marjinal zon lenfoma (% 3.7) ve Folliküler lenfoma (% 3.7) tanısı almıştır. Hastaların tüm immünhistokimyasal çalışma sonuçları Tablo 14 te verilmektedir. Çalışmaya alınan hastaların patolojik preparatlarının Patoloji Anabilim dalında WHO kriterlerine göre retrospektif olarak tekrar incelenmesi sonucunda hastaların patolojik tanılarında farklılık olmadığı saptanmıştır. 48

Hast a Tablo 14: İmmünhistokimyasal Çalışmaya Alınan Olguların Verileri (n=27) Histoloji Evr Risk CD1 BCL BCL MUM GMB BCL-2 TCL C-MYC k Alt e Grub 0 6 2 1 NonGM Transloka 1 Grup u B s-yonu Transloka s-yonu 1 BL III III + + - - GMB SY + + 2 BL IV IV + + - - GMB - - + 3 BL II III + + - - GMB - + + 4 BL II II + + - - GMB - + + 5 BL III II + + - - GMB - + + 6 BL IV III + + - - GMB - - + 7 BL IV III + + - - GMB - + + 8 BL III IV + + - - GMB - - + 9 BL III II - + + - GMB - + + 10 BL III IV - + + - GMB SY - + 11 BL III III - + + - GMB - - + 12 BL III II + + - - GMB - + + 13 BL II III + + - + GMB - + + 14 BL IV IV + + - - GMB - + + 15 FL III II + + - - GMB - + - 16 MZL I II - - - - NonGM - - - B 17 YBBHL III III + + + - GMB + + - 18 YBBHL III III + + - - GMB - - - 19 YBBHL II II + + + - GMB - + - 20 YBBHL III III - - + + NonGM - - - B 21 YBBHL II II - + - + NonGM - - - B 22 YBBHL III II - - - + NonGM - + - B 23 YBBHL IV III - - + + NonGM B - + - 24 YBBHL III III - - - + NonGM B - + - 25 YBBHL III IV - + - + NonGM SY - SY B 26 YBBHL III II - - - + NonGM SY - SY B 27 YBBHL II III - - - + NonGM B + + - BL: Burkitt Lenfoma YBBHL: Yaygın Büyük B Hücreli Lenfoma FL: Folliküler Lenfoma GMB: Germinal Merkez B Hücre Benzeri non-gmb: Germinal Merkez B Hücre Benzeri Olmayan SY: Sinyal Yok MZL: Marjinal Zon Lenfoma 49

Yaptığımız çalışmada tüm olguların CD10, BCL-6, BCL-2 ve MUM1 ekspresyon oranları sırasıyla % 55.6 (15 olgu), % 74.1 (20 olgu), % 25.9 (7 olgu) ve % 33.3 (9 olgu) olarak bulunmuştur. Ayrıca 11 YBBHL olgusu bu ekspresyon durumlarına göre GMB (3 olgu; % 27.3) ve non-gmb (8 olgu; % 72.7) olmak üzere iki gruba ayrılmıştır. Bu belirteçler dışında bakılan C-MYC translokasyonu 14 hastada pozitif olarak saptanırken; bu hastaların tamamının BL histolojik alt grubuna ait olduğu görülmüştür. 11 YBBHL olgusundan 2 si sinyal alınamaması nedeni ile çalışma dışında kalırken; 9 YBBHL olgusunda C-MYC translokasyonu (-) olarak bulunmuştur. C-MYC translokasyonu ile ilişkisinin irdelenmesi planlanan TCL1 ekspresyonu ise toplam 16 hastada (% 59.3) pozitif olarak saptanmıştır. TCL1 ekspresyonu pozitif olan hastalardan 9 unun BL, 6 sının YBBHL ve birinin FL histolojik alt grubuna ait olduğu görülmüştür. Yaptığımız çalışmada BL ve YBBHL olgularının TCL1 ekspresyon oranları sırasıyla % 64.3 ve % 54.5 olarak bulunmuştur. Hem BL hem de YBBHL olgularında TCL1 ekspresyonu ile prognoz arasında istatistiksel olarak anlamlı bir bağıntı (BL: P = 0.45 YBBHL: P = 0.226) saptanamamıştır. Buna karşın YBBHL olgularından TCL1 ekspresyonu pozitif olanların genel ve olaysız sağkalım oranlarının azaldığı (TCL1 ekspresyonu negatif YBBHL olgularında 5 yıllık OS ve EFS: % 100 TCL1ekspresyonu pozitif YBBHL olgularında 5 yıllık OS ve EFS: % 66.7) görülmüştür. Ayrıca yaptığımız çalışma sonucunda C-MYC translokasyonu ile TCL1 ekspresyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki (Pearson s R = 0.106, P > 0.05) bulunamamıştır. BCL-2 translokasyonu ise sadece 2 YBBHL olgusunda pozitif olarak saptanmış ve sinyal alınamayan toplam 4 hasta (2 BL 2 YBBHL olgusu) çalışma dışı kabul edilmiştir. Break-apart DNA probları kullanılarak yapılan floresan in situ hibridizasyon analizinde elde edilen görüntüler Şekil 6 ve 7 de verilmektedir. 50

Şekil 6. C-MYC rearranjmanı bulunan Burkitt lenfoma (orjinal büyütme, x1000) Şekil 7. BCL-2 rearranjmanı bulunan YBBHL (orjinal büyütme, x1000) 51

İmmünhistokimyasal çalışmaya alınan BL olgularında BCL-6 ekspresyon oranı % 100 olarak bulunmuş ve tüm BL olgularının GMB fenotipine sahip olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte BL olgularında CD10 ve BCL-2 ekspresyon oranları sırasıyla % 78.6 ve % 21.4 olarak bulunmuş olup; sadece bir hastada MUM1 ekspresyonunun (+) olduğu (% 7.1) saptanmıştır. BL olgularının tamamının klinik izlem verilerine ulaşılmış olup; tüm BL olgularının takip süresi sonunda hayatta oldukları görülmüştür (5 yıllık OS % 100). İmmünhistokimyasal çalışmaya alınan Burkitt lenfoma olgularına ait olan boyanma görüntüleri Şekil 8,9,10 ve 11 de verilmektedir. Şekil 8. Burkitt lenfoma (HE, x400) 52

Şekil 9. Burkitt lenfomada CD10 ekspresyonu (CD10, x400) Şekil 10. Burkitt lenfomada BCL-6 ekspresyonu (BCL-6, x400) 53

Şekil 11. Burkitt lenfomada TCL1 ekspresyonu (TCL1, x400) BL olgularına ait olan genel ve olaysız sağkalım analizleri Tablo 15 ve 16 da verilmekte olup; yaptığımız çalışmada bakılan immünhistokimyasal ekspresyon proteinleri ile BL prognozu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir bağıntı (P > 0.05) saptanamamıştır. Tablo 15: BL Olgularının Genel Sağkalım (OS) Analizi (n=14) Değişkenler Sağkalım Hızları % Yaşam Süresi * Log-Rank p-değeri 1 Yıllık 3 Yıllık 5 Yıllık (%95 Güven Aralığı) TCL-1 - - Negatif 100,0 100,0 100,0 HY Pozitif 100,0 100,0 100,0 HY CD-10 - - Negatif 100,0 HY HY HY Pozitif 100,0 100,0 100,0 HY BCL-2 - - Negatif 100,0 100,0 100,0 HY Pozitif 100,0 HY HY HY MUM-1 - - Negatif 100,0 100,0 100,0 HY Pozitif 100,0 100,0 HY HY *Beklenen Yaşam Süresi HY: Hesaplama Yapılmadı 54

Tablo 16: BL Olgularının Olaysız Sağkalım (EFS) Analizi (n=14) Değişkenler Sağkalım Hızları % Yaşam Süresi * Log-Rank p-değeri 1 Yıllık 3 Yıllık 5 Yıllık (%95 Güven Aralığı) TCL-1 0,56 0,456 Negatif 100 100 100 HY Pozitif 88,9 88,9 88,9 160,6 (124,6-196,5) CD-10 0,27 0,601 Negatif 100,0 HY HY HY Pozitif 90,9 90,9 90,9 164,1 (134,4-193,8) BCL-2 0,27 0,601 Negatif 90,9 90,9 90,9 164,1 (134,4-193,8) Pozitif 100 HY HY HY MUM-1 0,08 0,781 Negatif 92,3 92,3 92,3 166,5 (141,2-191,9) Pozitif 100 100 HY HY *Beklenen Yaşam Süresi HY: Hesaplama Yapılmadı 55

YBBHL olgularında CD10, BCL-6, BCL-2 ve MUM1 ekspresyon oranları sırasıyla % 27.2, % 45.4, % 36.3 ve % 72.7 olarak bulunmuştur. Bu sonuçlar ışığında 11 YBBHL olgusu GMB (3 olgu; % 27.3) ve non-gmb (8 olgu; % 72.7) olmak üzere iki gruba ayrılmıştır (Şekil 12). 27,30% Germinal Merkez B Hücre Benzeri (GMB) 72,70% Germinal Merkez B Hücre Benzeri Olmayan (non-gmb) Şekil 12. YBBHL'larda İmmünfenotipik Sınıflama Çalışma kapsamındaki 11 YBBHL olgusundan 10 unun klinik izlem verilerine ulaşılabilmiştir. GMB fenotipinde olan 3 hasta takip süresi sonunda hayatta iken, non-gmb fenotipindeki 7 hastadan 2 sinin median 14 aylık (4 ay 2 yıl) takip süresi sonunda kaybedildikleri görülmüştür. İmmünhistokimyasal çalışmaya alınan YBBHL olgularına ait olan boyanma görüntüleri Şekil 13,14,15,16,17 ve 18 de verilmektedir. 56

Şekil 13. YBBHL (HE, x400) Şekil 14. YBBHL da CD10 ekspresyonu (CD10, x200) 57

Şekil 15. YBBHL da BCL-6 ekspresyonu (BCL-6, x400) Şekil 16. YBBHL da BCL-2 ekspresyonu (BCL-2, x400) 58

Şekil 17. YBBHL da MUM1 ekspresyonu (MUM1, x400) Şekil 18. YBBHL da TCL1 ekspresyonu (TCL1, x400) 59