Hematolog KORDON KANININ İN VİTRO/EX VİVO EKSPANSİYONU: DENEYSEL VE KLİNİK UYGULAMALAR ÖZET Kordon kanının (KK) doku tipi tam uygun kemik iliği (Kİ) donörü olmayan erişkin hastalar için başarılı bir tedavi alternatifi olduğu bilinen bir gerçektir. Başarılı bir nakil için gereken CD34(+) hücre sayısı en az 1,5x105 hücre/kg olarak belirlenmiştir. KK nakillerinde bu düşük sayıdaki hücre sayısı nedeniyle engraftman erişkin kök hücre kaynaklarına göre yaklaşık 1-3 hafta geç ortaya çıkmaktadır. Daha çok hastanın kullanımı için yaygınlaştırılabilmesi ve nakil sonrası engrafman hızını arttırmak amacıyla günümüzde KK kök hücrelerinin in vitro/ex vivo koşullarda ekspansiyonu ve engrafmanın tetiklenmesi gündeme gelmiştir. Yeni hücresel teknikler sayesinde mevcut KK kaynaklı tedavi yöntemlerinde karşılaşılan güçlüklerin üstesinden gelinmesi ve KK kök hücrelerinin erişkin hastalar için de daha etkili kullanılabilirliği hedeflenmektedir. Dr. Meral Beksaç 1 Dr. Pınar Yurdakul 2 1 Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hematoloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye 2 Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Kordon Kanı Bankası, Ankara, Türkiye E-posta: beksac@medicine.ankara.edu.tr pyurdakul@gmail.com Anahtar Sözcükler Kordon kanı, Hematopoietik kök hücre, CD34, Ex vivo ekspansiyon, Notch, VPA GİRİŞ Kordon kanından (KK) elde edilen hematopoetik kök hücrelerin (HKH) alıcı-verici arasında tam insan lökosit antijen [human leukocyte antigen (HLA)] uyumu gerektirmemesi (4/6 uyum kabul edilebilir) ve erişkin HKH ye oranla bir log daha az sayıda kök hücre ile nakil gerçekleştirilebilmesi olumlu özellikleridir. Bugünkü veriler ışığında 15 yıla kadar sağlıklı olarak saklanabilen KK hücre içeriği tüm biyolojik (daha yüksek proliferatif) ve immünolojik (daha az immünojenik) üstünlüklerine rağmen, genellikle 50 kg altındaki hastalar için yeterli olmaktadır (1). Tek KK naklinde düşük HKH dozu ile ilişkili olarak gecikmiş engrafman ve greft kaybı özellikle erişkinlerde KK nakilleri sonrasında karşılaşılan en temel sorunlardır. Bu durum özellikle pansitopenik alıcılarda mikrobiyal ve viral enfeksiyon riskini artırmakta ve bu nedenle KK nakli sonrasında mortalite oranı yükselmektedir. İlaveten KK nakli sonrası immün yapılanma da diğer kök hücre kaynaklarına oranla gecikmekte ve transplanta ilişkin mortalitenin artmasına katkıda bulunmaktadır. Tüm hasta gruplarında bu dezavantajların üstesinden gelmek amacıyla KK HKH sayısını ve/veya engrafman kapasitesini artırmaya yönelik yöntemler ve klinik uygulamaya yönelik stratejiler geliştirilmiştir. Bu yaklaşımları temel olarak, 2016: 6. 1 45
KORDON KANININ IN VITRO/EX VIVO EKSPANSİYONU Hematolog CD34(+) hücre sayısını arttırmaya yönelik ekspansiyon teknikleri ve engrafmanı arttırmaya yönelik engrafman arttırıcı yöntemler olarak iki başlık altında toplamak mümkündür. Bu derleme, preklinik ve klinik çalışmalarda son yıllarda tanımlanan yeni moleküllerle ve farklı stratejilerle geliştirilen KK ekspansiyon çalışmaları bu bölümde engrafmanı artırıcı yöntemler ise farklı bir bölümde olmak üzere iki ayrı başlık altında incelenecektir. 1. İN VİTRO/EX VİVO EKSPANSİYON YÖNTEMLERİ 1.1. Sitokinler ve Büyüme Faktörleri KK kaynaklı HKH lerin ex vivo ekspansiyonuna yönelik gerçekleştirilen ilk çalışmalarda HKH lerin hayatta kalım ve ekspansiyonunu desteklemek amacıyla kullanılan IL-6, IL- 11, IL-3, Flt-3 ligandı, kök hücre faktörü [Stem Cell Factor (SCF)], trombopoietin (TPO) ve granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör, temel hematopoetik sitokinlerdir (2). Bu alanda gerçekleştirilen öncü çalışmalardan biri olan Shpall ve ark nın çalışmasında SCF, TPO ve granülosit koloni uyarıcı faktör ile kültürü yapılan KK CD34(+) HKH 2-5 kat arttırılabilmiştir (3). Shpall ve ark. tarafından 2002 de gerçekleştirilen alanında öncü bir klinik çalışmada ise ekspande edilen KK CD34(+) hücre ve toplam çekirdekli hücre (TNC) ortanca değerleri sırasıyla 4 ve 56 kat artırılmıştır. Bu HKH hematolojik kanserli 37 hastaya nakledildiğinde nötrofil ve platelet yeniden yapılanması ortanca süreleri sırasıyla 28 ve 106 gün olarak rapor edilmiştir (4). 1.2. Notch Sinyal İletim Yolağının Tetiklenmesi Sitokin ve büyüme faktörleriyle muamele sonrası sayıca artmış HKH kullanımının tek başına klinik etkinliğe yeterli katkı sağlayamaması nedeniyle yeterli hücre dozunu elde etmek için farklı hücresel yolakların modifikasyonları gündeme gelmiştir. Bu yolaklardan Notch sinyal iletim yolağının tetiklenmesi, HKH ekspansiyonu üzerine olan pozitif etkisi nedeniyle özellikle kullanım alanı bulmuştur. Bu yöntemin ilk uygulayıcısı olan Delaney ve ark ın yaptığı bir çalışmada, KK kaynaklı CD34(+) HKH, IL-3, IL- 6, FLt3 ligand, SCF ve TPO sitokinleri ve fibronektin içeren hücre kültür ortamında Delta-1 ligandı eklenerek inkübe edilmiştir. On yedi günlük inkübasyon sonrasında HKH sayısında 222 kat artış elde edilmiştir. Bu sitokin/hkh kokteyli obez olmayan diyabetik/ağır kombine immün yetersizlik farelere enjekte edildiğinde ise, farklılaşmaya başlayan hücre popülasyonunda 16 kat artış olduğu gözlenmiştir. Deneysel verilerden yola çıkarak gerçekleştirilen Delaney ve ark. ın yaptığı 10 hastanın dahil edildiği faz I klinik çalışmada, CD34(+) hücre sayısında ortalama 164 kat ekspansiyon elde edilmiş olup nötrofil engrafman süresinde de belirli bir kısalma gözlenmiştir (5). Çok merkezli yürütülen ve hala hasta katılımı devam etmekte olan bir klinik çalışmanın 23 hasta üzerinden değerlendirilen ön sonuçlarında, manipüle edilmemiş KK ünitesiyle beraber kısmi HLA uyumlu Notch ligand ile ekspande edilen KK ünitesinin nakli sonrası, nötrofil ve platelet yeniden yapılanmasının ortanca değerleri sırasıyla 13 ve 38 gün olarak bildirilmiştir (NTC01690520) (6). Aynı grubun yürüttüğü tek merkezli bir başka çalışmada ise, 15 hastada nakille ilişkili mortalite ya da akut graft versus host hastalığı III/IV gelişmeksizin, nötrofil ve platelet yeniden yapılanma ortanca süreleri sırasıyla 19 ve 35 gün olarak belirtilmiştir (7). Bu hastalar 100. gün bakteriyemi riski açısından değerlendirildiğinde bu riskin azalmış olduğu ortaya konmuş ve bu sonuç araştırmacılar tarafından Notch ile ekspande edilmiş greftin mukozaya artmış göçü ve koruyuculuğu ile açıklanmıştır (2). 46 2016: 6. 1
Hematolog KORDON KANININ IN VITRO/EX VIVO EKSPANSİYONU 1.3. Mezenkimal Hücre Ko-Kültürü MKH ler sitokin ve hücre proliferasyonunu tetikleyen ve diğer proteinlerle etkileşen hücre grubu olmaları sayesinde KK hücreleriyle ko-kültürü yapılarak ex vivo ekspansiyonu desteklerler (8-10). MKH ile KK ekspansiyonuna yönelik klinik çalışmaların sonuçları yakın zamanda De Lima ve ark. (2012) tarafından derlenmiştir (11). MD Anderson Kanser Araştırma Merkezi nde yürütülen bu çalışmada MKH kaynaklı KK hücreleriyle miyeloablatif hazırlık rejimi sonrası çift KK nakli olmuş toplamda 31 hastada uygulanmıştır. 14 günlük ekspansiyon sonrasında TNC, CD34(+) hücre ve in vitro fonksiyon belirleme testlerinde koloni sayılarında sırasıyla 12,2-, 30,1- ve 17,5- kat artış saptanmıştır. Kontrol gruba kıyasla deney grubunda nötrofil engrafmanı ortanca süresi 15 gün (9-42) olarak saptanmış ve klinik olarak anlamlı bulunmuştur. Yine kontrollere (%78) kıyasla nötrofil engrafmanının kümülatif insidansı MKH lerle ko-kültür sonrasında %96 olarak bildirilmiştir (NCT 00498316) (11). 1.4. Küçük Moleküller 1.4.1. Bakır Şelasyonu Bakır, hücre fonksiyonlarının devamlılığı, proliferasyonu ve farklılaşması için temel bir moleküldür (12). Peled ve ark. KK kaynaklı erken progenitör hücrelerin tetraetilenpentamin (TEPA) ve sitokin kokteyli ile 3 ve 7 hafta inkübasyon sonrasında sırasıyla 17 kat ve 159 katlık artış tespit etmiştir (13). Bir başka çalışmada, bakır şelasyonunu tetikleyen ajanlar ve büyüme faktörleriyle birlikte kültürü yapılan kök hücreleri faz I-II çalışmalarında hastalara verilmiş, TNC sayısında 219 (Aralık 2-620) kat kadar artış sağlanabilmiş ancak CD34(+) kök hücre sayısı artışı 6 katla sınırlı kalmıştır (14). GAMIDA Cell firmasının sponsorluğunda gerçekleştirilen iki farklı klinik çalışmada bakır şelasyonu yapılan KK greftinin (StemEx) etkinliği araştırılmaktadır. Bu çalışmalardan NCT00469729 kodlu çok merkezli faz II/III çalışması sonuçlanmıştır. Verilerinin yakın gelecekte yayınlanması beklenmektedir. Diğer klinik çalışmada ise (NCT01484470), TEPA ile ekspande HKH nin etkinliği ve güvenilirliği araştırılmaktadır. Bu çalışmanın ön sonuçları 101 hastada değerlendirilmiş ve konvansiyonel çift KK nakline kıyasla nötrofil ve platelet yeniden yapılanma zamanları daha kısa (sırasıyla 21 gün ve 54 gün) olarak rapor edilmiştir (15). 1.4.2. Aril Hidrokarbon Reseptör Antagonistleri Aril hidrokarbon reseptör antagonistlerinin HKH ekspansiyonunu in vitro koşullarda desteklediği gösterilmiştir. Literatürde en yüksek ekspansiyonu sağlayan çalışmalardan birisi olan Boitano ve ark ın çalışmasında, CD34(+) kök hücre farklılaşmasını tetikleyen aril hidrokarbon reseptör antagonisti, StemRegenin 1 (SR-1) kullanılarak, CD34(+) kök hücre sayısında 3 hafta inkübasyonu takiben 669 ve 5 hafta sonunda da 17,100 kat artış sağlanmıştır. Wagner ve ark. nın gerçekleştirdiği faz 1/2 çalışmasında SR-1 ile ekspande edilmiş ve manipüle edilmemiş olmak üzere çift KK nakli uygulanan, hematolojik kanserli 17 hastada 328 kat CD34(+) hücre ekspansiyonu sağlanmış ve toplam 123x105/kg CD34(+) dozuna erişilmiştir. SR-1 ile expande KK nın dominant olduğu 11 hastada engrafman süresi 11 gün iken, manipüle edilmemiş KK nın domine olduğu hastalarda engrafman süresi 23 gün olarak bulunmuştur. Araştırmacılar tek KK naklinde SR-1 in kullanılabilirliğini araştırmaktadırlar (2,16). 2016: 6. 1 47
KORDON KANININ IN VITRO/EX VIVO EKSPANSİYONU Hematolog 1.4.3. Nikotinamid Vitamin B3 türevi olan Nikotinamid (NAM), sitokinlerle muamele edilmiş KK kaynaklı CD34(+) hücrelerin farklılaşmasını geciktirerek engrafmanı olumlu yönde etkilemektedir (17). NAM ile ekspande KK nın (Nicord) etkinliği hem in vitro hem de in vivo birçok çalışmada ve klinik araştırmada gösterilmiştir (18,19). Preklinik çalışmaların verileri ışığında Duke Üniversitesi Araştırma Merkezi nde Horwitz önderliğinde hematolojik kanserli 11 hastanın dahil edildiği küçük çaplı bir çalışma gerçekleştirilmiştir. NAM la in vitro ekspansiyon, TNC sayısında 486 kat, CD34(+) hücrelerde ise 72 kat artış sağlamıştır. Nötrofil ve platelet engtrafman süreleri sırasıyla 13 ve 33 gün olup kontrollere kıyasla anlamlı şekilde kısadır (20). Nicord un etkinliği ve güvenilirliği iki farklı faz I/II çalışmasında da başarılı olarak değerlendirilmiştir (NCT02039557 ve NCT01816230). 1.4.4. Valproik Asit ve Diğer Histondeasetilaz İnhibitörleri Epigenetik değişiklikler HKH biyolojisinde önemli rol oynamaktadırlar. Bu bilgiden yola çıkarak farklı histondeasetilaz inhibitörleri (HDAC), örneğin valproik asit (VPA), suberoylanilide hidroksamik asit ve Trikostatin A nın normal HKH ekspansiyonu üzerine pozitif etkisi olduğu gösterilmiştir (21). KK CD34(+) hücrelerinin HDAC inhibitörleri ile muamele sonrası epigenetik ve moleküler belirteçleri Gajzer ve ark. tarafından araştırılmıştır. Bu moleküler çalışmada klinik nakilde kullanılmak üzere hazırlanan HKH lerin ekspansiyon ve hematopoetik farklılaşmalarında rol oynayan temel regülatörler özellikle HDAC ışığında detaylı olarak özetlenmiştir. Bu veriler ışığında VPA ile epigenetik olarak programlanan KK CD34(+) hücrelerin nakilde daha fonksiyonel ve başarılı greft tutulumunu sağlayacağına işaret edilmektedir (22). SONUÇ Klinik olarak hastaya uygulanacak KK nın kök hücre ve progenitör hücrelerin in vitro/ex vivo koşullarda sayılarının arttırılması ya da fonksiyonlarının geliştirilmesi ile hematopoetik engraftman hızlandırılabilir, enfeksiyon riski azaltılabilir ve saklanan KK üniteleri erişkin hastalar için daha güvenle kullanılabilir. Bu bulgulardan hareketle KK nın in vitro/ex vivo koşullarda geliştirilmesiyle CD34(+) hücre sayısı düşük olduğu için kullanılamayan üniteler değerlendirilerek, bu sebeple imha edilmesi gereken birçok KK ünitesi kullanılabilir hale getirilebilir ve hem pediatrik hem erişkin hastalarda nakil başarısı arttırılabilir. Kaynaklar 1. Allan D, Petraszko T, Elmoazzen H, Smith S. A review of factors influencing the banking of collected umbilical cord blood units. Stem Cells Int 2013;2013:463031. 2. Bari S, Seah KK, Poon Z, Cheung AM, Fan X, Ong SY, Li S, Koh LP, Hwang WY. Expansion and homing of umbilical cord blood hematopoietic stem and progenitor cells for clinical transplantation. Biol Blood Marrow Transplant 2015;21:1008-1019. 3. Shpall EJ. The utilization of cytokines in stem cell mobilization strategies. Bone Marrow Transplant 1999;23(Suppl 2):13-19. 4. Shpall EJ, Quinones R, Giller R, Zeng C, Baron AE, Jones RB, Bearman SI, Nieto Y, Freed B, Madinger N, Hogan CJ, Slat-Vasquez V, Russell P, Blunk B, Schissel D, Hild E, Malcolm J, Ward W, McNiece IK. Transplantation of ex vivo expanded cord blood. Biol Blood Marrow Transplant 2002;8:368-376. 5. Delaney C, Heimfeld S, Brashem-Stein C, Voorhies H, Manger RL, Bernstein ID. Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution. Nat Med 2010;16:232-236. 48 2016: 6. 1
Hematolog KORDON KANININ IN VITRO/EX VIVO EKSPANSİYONU 6. Delaney C, Milano F, Nicoud I, Heimfeld S, Karanes C, Gutman JA, Wagner JE, Appelbaum FR, Bernstein ID. Dose dependent enhancement of neutrophil recovery by infusion of notch ligand ex vivo expanded cord blood progenitors: results of a multi-center phase I trial. Blood 2013;21:297. 7. Milano F, Heimfeld S, Riffkin IV, Nicoud I, Appelbaum FR, Bernstein ID, Delaney C. Infusion of a non HLA-matched off-the-shelf ex vivo expanded cord blood progenitor cell product following myeloablative cord blood transplantation is safe, decreases the time to hematopoietic recovery, and results in excellent overall survival. Blood 2014;124:46. 8. Robinson SN, Simmons PJ, Yang H, Alousi AM, Marcos de Lima J, Shpall EJ. Mesenchymal stem cells in ex vivo cord blood expansion. Best Prac Res Clin Haematol 2011;24:83-92. 9. Deans RJ, Moseley AB. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Exp Hematol 2000;28:875-884. 10. Robinson SN, Ng J, Niu T, Yang H, McMannis JD, Karandish S, Kaur I, Fu P, Del Angel M, Messinger R, Flagge F, de Lima M, Decker W, Xing D, Champlin R, Shpall EJ. Superior ex vivo cord blood expansion following co-culture with bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Bone Marrow Transplant 2006;37:359-366. 11. de Lima M, McNiece I, Robinson SN, Munsell M, Eapen M, Horowitz M, Alousi A, Saliba R, McMannis JD, Kaur I, Kebriaei P, Parmar S, Popat U, Hosing C, Champlin R, Bollard C, Molldrem JJ, Jones RB, Nieto Y, Andersson BS, Shah N, Oran B, Cooper LJ, Worth L, Qazilbash MH, Korbling M, Rondon G, Ciurea S, Bosque D, Maewal I, Simmons PJ, Shpall EJ. Cord-blood engraftment with ex vivo mesenchymal-cell coculture. N Engl J Med 2012;367:2305-2315. 12. Beksac M, Yurdakul P. Modalities to improve cord blood engraftment. J Stem Cell Res Ther 2014;4:3. 13. Peled T, Mandel J, Goudsmid RN, Landor C, Hasson N, Harati D, Austin M, Hasson A, Fibach E, Shpall EJ, Nagler A. Pre-clinical development of cord blood-derived progenitor cell graft expanded ex vivo with cytokines and the polyamine copper chelator tetraethylenepentamine. Cytotherapy 2004;6:344-355. 14. de Lima M, McMannis J, Gee A, Komanduri K, Couriel D, Andersson BS, Hosing C, Khouri I, Jones R, Champlin R, Karandish S, Sadeghi T, Peled T, Grynspan F, Daniely Y, Nagler A, Shpall EJ. Transplantation of ex vivo expanded cord blood cells using the copper chelator tetraethylenepentamine: a phase I/II clinical trial. Bone Marrow Transplant 2008;41:771-778. 15. Stiff PJ, Montesinos P, Peled T, Landau E, Rosenheimer N, Mandel J, Hasson N, Olesinski E, Glukhman E, Snyder DA, Cohen EG, Kidron OS, Bracha D, Harati D, Ben-Abu K, Freind E, Freedman L, Cohen YC, Olmer L, Barishev R, Rocha V, Horowitz MM, Eapen M, Nagler A, Sanz G. StemEx (Copper Chelation Based) Ex Vivo Expanded Umbilical Cord Blood Stem Cell Transplantation (UCBT) Accelerates Engraftment and Improves 100 Day Survival In Myeloablated Patients Compared To a Registry Cohort Undergoing Double Unit UCBT: Results Of a Multicenter Study Of 101 Patients With Hematologic Malignancies. Blood 2013:122. 16. Wagner JE Jr, Brunstein CG, Boitano AE, DeFor TE, McKenna D, Sumstad D, Blazar BR, Tolar J, Le C, Jones J, Cooke MP, Bleul CC. Phase I/II trial of stemregenin-1 expanded umbilical cord blood hematopoietic stem cells supports testing as a stand-alone graft. Cell Stem Cell 2016;18:144-155. 17. Beksac M, Preffer F. Is it time to revisit our current hematopoietic progenitor cell quantification methods in the clinic? Bone Marrow Transplant 2012;47:1391-1396. 18. Cardoso AA, Li ML, Batard P, Hatzfeld A, Brown EL, Levesque JP, Sookdeo H, Panterne B, Sansilvestri P,Clark SC, et al. Release from quiescence of CD34+ CD38- human umbilical cord blood cells reveals their potentiality to engraft adults. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:8707-8711. 2016: 6. 1 49
KORDON KANININ IN VITRO/EX VIVO EKSPANSİYONU Hematolog 19. Peled T, Shoham H, Aschengrau D, Yackoubov D, Frei G, Rosenheimer G N, Lerrer B, Cohen HY, Nagler A, Fibach E, Peled A. Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment. Exp Hematol 2012;40:342-355. 20. Horwitz ME, Chao NJ, Rizzieri DA, Long GD, Sullivan KM, Gasparetto C, Chute JP, Morris A, McDonald C, Waters-Pick B, Stiff P, Wease S, Peled A, Snyder D, Cohen EG, Shoham H, Landau E, Friend E, Peleg I, Aschengrau D, Yackoubov D, Kurtzberg J, Peled T. Umbilical cord blood expansion with nicotinamide provides long-term multilineage engraftment. J Clin Invest 2014;124:3121-3128. 21. Mahmud N, Petro B, Baluchamy S, Li X, Taioli S, Lavelle D, Quigley JG, Suphangul M, Araki H. Differential effects of epigenetic modifiers on the expansion and maintenance of human cord blood stem/progenitor cells. Biol Blood Marrow Transplant 2014;20:480-489. 22. Chaurasia P, Gajzer DC, Schaniel C, D Souza S, Hoffman R. Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells. J Clin Invest 2014;124:2378-2395. 50 2016: 6. 1