PD-L1 Dr Büge Öz İÜ Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı
Konuşmanın akışı.. KHDAK da kişiye özel tedavi hikayesi EGFR, ALK,ROS 1 Yeni moleküler belirteçler ( BRAF, MET, ) EGFR ve ALK direnç mekanizmaları Likit biyopsi İmmunoterapi belirteçleri yeni gelişmeler
Onkolojide hedef tedavi için üzerinde çalışılan mutasyonlar
Adenokarsinom WT KRAS ALK EGFR İmmunoterapi seçeneği Skuamöz hücreli karsinom İmmunoterapi seçeneği
KHDAK da tanı ve testler %10 NOS- KHDAK Patolojik tanı ve alt tiplendirme Adenokarsinom Skuamöz H K vb %25-40 NOS- KHDAK Rehberler ve protokollere uygun biyolojik belirleyici testleri DNA ekstaksiyonu için seçim IHK ve FISH için kesit seçimi EGFR, BRAF, KRAS, VS ALK, ROS1, PD-L1 TTF1 /p40 Öz Adenokarsinom Seçilmiş Sku HK ve KHK
KHDAK da EGFR mutasyonları 2017 IASLC
n= 2402 CTF
EGFR mutasyonları Türkiye verisi n=5470 9,9 5,1 EGFR (-) 81.2%.EGFR (+) 12.2% 27,7 59,3.EGFR (invalid) 6.6% EX 19 EX 21 EX 18 EX 20 EGFR (-) EGFR (+) EGFR (invalid)
EGFR/KRAS EGFR ve KRAS mutasyonları adenokarsinomlarda biribirini dışlayan iki ayrı moleküler grup KRAS mutasyonu: yaşam ve TKİ alma yönünden negatif belirleyici EGFR mutasyonu: yaşam ve tedavi yönünden iyi prognoz göstergesi
ALK ve ROS-1 translokasyonu kribriform (müsinöz) Taşlı yüzük H Taşlı yüzük h. Lepidik müsinöz ALK %3-7 ROS-1 %1-2 Genç hasta sigara içmemiş, az içmiş EGFR / KRAS «-» hastalar Solid büyüme paterni, taşlı yüzük hücreli ve, mikropapiller ve hepatoid fenotip
ALK ve ROS -1 translokasyonu - Yöntem İHK FISH RT-PCR NGS ALK için ROS-1 için
Bazı dokular FISH de sorun oluşturabilir: Fibrotik doku Kemik doku Müsinöz tümörler Karaciğer dokusu (Bazen) Kemik biyopsisi moleküler testlerin yapılması için alınıyorsa patolog önceden haberdar edilmeli
ALK /ROS1 FISH testi değerlendirmesi En az 50 tümör hücresi değerlendirilmeli: 5 hücre ise NEGATİF 25 hücre ise POZİTİF 5-25 hücrede ise şüpheli ; Pozitif Negatif 2.okuyucu yada 100 hücreye tamamlanmalı < >%15 ise NEGATİF %15 ise POZİTİF
BRAF mutasyonu EGFR WT/KRAS WT KHDAK AdenoKa da %85, daha nadir SHK BRAF mutasyonu %2-4 Sigara içenlerde Sıklıkla papiller paternle ilişkili
FDA grants regular approval to dabrafenib and trametinib combination for metastatic NSCLC with BRAF V600E mutation (22 Haziran 2017) En sık Exon 15 V600E ( %80), Diğer ex 15 ve Exon 11 de EGFR-TKI direnci ile ilişki
MET (c-met) Epitelyal hücre yüzeyinde Proto-onkogen (7q21-31) Stroma ve mezenkimal hüc den salınan HGF ün bağlanması ile aktive olur EM transformasyon
MET (c-met) MET mut %3-4 ; Jm domainde Ex 14 skip mutasyon %7-20 MET amp. ( GKS) Olumsuz prognostik değer
RET translokasyon/ füzyonu Kr10q11.2 de; en sık partneri KIF5B (aynı kromozomda) KHDAK larında %1 FISH, RT-PCR ve NGS ile Tedavi Cabozantinib, Vandetanib, Sorafenib ve Alectinib
HER2= ERBB2 HER2 ve EGFR aynı aileden KHDAK larında da meme ve mide Ca olduğu gibi duyarlı TKI leri ile tedavi umudu AK larda %2-4 Mutasyon bakılmalı; EX 20 insersiyon Tedavi: Trastuzumab Prognostic and predictive implications of HER2/ERBB2/neu gene mutations in lung cancer. Tomizawa et al. Lung Cancer; 2011:74,139-44.
The evolving genomic classification of lung cancer
Circulating tumor cells
KHDAK larında Hedef tedaviler: TKI inhibitörleri 2010 lu yılların tıptaki en önemli gelişmelerinden Ancak büyük bir çoğunluğunda direnç gelişiyor başlangıçta (1-4 yıl içinde) Tümör genezindeki nüks ve direnç mekanizmalarını anlamaya yönelik çok araştırma var Potansiyel tedavi seçeneklerini önceden saptamak çok önemli
EGFR -ALK ikincil direnç
Crizotinib vetivantinib EGFR mutasyonu ikincil direnç nedenleri Osimertinib ve Rociletinib
ALK ikincil direnci
Likit biyopsi
Likit biyopsi Mononükleer hücre komponenti Plazma/serum Kanda Dolanan tümör hücresi cfdna Kanda serbest nüklotidler Klinik pratikte kullanılıyor Henüz araştırma safhasında
Dolanan kanda tümör hücresi (CTC) 1ml kanda 1-10 CTC/ 10 6 10 7 kan hücresi Epitelyal hücreler EpCAM +, CK+ Kolon, Meme Ca, EpCAM+, CK+, CD45 - KHDAK keratin +/- EMT Bazı KHDAK ise sadece vimentin eksprese eder. Dolanan kanda tm hücreleri; Bazen tek hücre olarak, Bazen de tümör mikro trombüsü olarak kanda dolaşır. Hofman ark. Cur Mol Med 2014
CT cell/ cf DNA cf DNA Avantaj Minimal invazif yöntem İlaç direnci belirlemede hızlı çözüm Doku alımı zor /imkansız olduğunda yararlı Tümör heterogenitesinde faydalı Spesifitesi yüksek CT cell Minimal invazif yöntem Tedavi düzenlemede yardımcı İlaç direnci mekanizma analizine yardımcı Tümör heterogenitesinde Erken tanıda İmmun işaretleme, proteomiks vb çalışmalar Pre-analitik işlemlerde standart düşük Sağlıklı hücrelerin cf DNA sının kanda olması Düşük cfdna olduğunda hatalı sonuç (yalancı - ve nadiren yalancı + ) Protein /fonksiyonel araştırma yapılamaması Limitasyon Küçük kapillerden büyük boyutlu hücre gruplarını filtrelemek zor Dolanan kanda benign epitel hücreleri de var Spesifitesi yüksek sensitivitesi düşük
Likit biyopsi
EGFR Testi İçin Kullanılan Metotlar Teknikler Sensitivite Optimal uygulama Sanger sekanslama >%10 Tümör dokusu Pyrosequencing %10 Tümör dokusu COLD-PCR and Pyro %2 Tümör dokusu YJS %2 Tümör dokusu Q-PCR %1 Tümör dokusu ARMS %0.10 Tümör dokusu COBAS, Therascreen ( cfdna için adapte edilmiş) %0.10 ctdna BEAMing %0.01 ctdna ddpcr %0.01 ctdna
EGFR Sekonder direncin nedenini bulmak Yeni biyopsi gerekli Doku biyopsisi Likit biyopsisi Ne zaman? Doku biyopsisi alınamadığında Doku biyopsi yeterli tümör içermediğinde DNA kalitesi düşük olduğunda Uygunsuz fiksasyon Test süresini kısalmak amacıyla
Karaciğer Kemik Lenf nodu
ctdna Pre-analitik İşlem Akışı Kan alımı: K2 ETDA lı tüp 2 adet 1-4 saat içinde ulaştırılmalı Süre uzarsa WBC yıkıma uğrar ve DNA sı açığa çıkar Mutant cfdna seyrelmiş olur.
cf DNA pre-analitik aşamada dikkat edilmesi gerekenler II 1200-1600 devir Süpernatantı Plazmadan ayır Yüksek hızda yeniden santrifüj et Saklama 10 dakika Santrifüj Süpernatantı -80 de sakla temiz tüpe aktar Test en az 2-3 ml plazma gerektirir
ctdna Pre-analitik İşlem Akışı KAN Uzaktan gelecek ise; İçeriği uzun süre bozulmadan saklayabilen Özel tüpler önerilir Roche, Qiagene, Sterck vb Transportasyonda ısı oda ısısı, soğuk çok önemli değil!!
Dirençte EGFR likit biyopsi yorumlanması Aktive edici mutasyon T790M Yorum + + 3. Generasyon EGFR TKI ile tedavi + _ Doku biyopsisi önerilir _ + Diğer bir yöntemle test tekrarı Non-informatif ; doku biyopsisi kesinlikle önerilir
60-90 % 80-100 %
Hem cfdna testi hem doku Bx testi başarıyı arttırır!
Likit biyopsi/ doku RE-biyopsi 56 yaşında kadın hasta Hiç sigara içmemiş EVRE IV metastatik adenokarsinom submandibular lenf Nodu ile tanı kondu Şubat 2015 ) EGFR mutasyonu + (eg. 19 del.) 2016 ekimde hastada nüks PET ile Multipl kemik metastazları saptandı Kemik Tru-cut biyopsi Küçük hücreli KA transformasyon CD56
İmmunoterapi belirteçleri yeni gelişmeler
İmmunoterapi Mantığı
Akciğer Kanseri Küçük Hücreli Dışı (%65-85) Küçük Hücreli (%15-35) Sürücü Mutasyon Yok (%80) PD-L1 Onkojenik Sürücü Mutasyon (%20) Non-skuamöz (%60-80) Skuamöz (%20-40) ALK (%2-5) EGFR (%15-18) Adenokarsinom (%50-70) Büyük Hücreli (%10-30)
Tamamlayıcı //eşlikci test
PD-L1 primer antikor klonları
Pre-Analitik dönem çok önemli
Fiksasyonun önemi (Cuma biyopsi için uygun gün değil!) Biyopsi yada sitolojik materyal mümkünse çıkarıldıktan hemen sonra yada ilk 1 saat içinde fiksatife konmalı; (soğuk iskemiden korumak için ) Küçük biyopsiler en az 6 saat fiksatifte kalmalı (8-12 saat) ve fiksasyon süresi 18 saati geçmemeli Büyük doku örnekleri ise en az 12 saat fiksatifte kalmalı (12-24 saat) ve fiksasyon süresi 48 saati geçmemeli
Fiksasyon çok Önemli!!!! Hemen Fiksasyon Doku Boyutuna Göre Fiksasyon Tamponlu Formol Fiksasyonu Alkol Bazlı Fiksasyon İHK İçin İyi Değil
KHDAK tanıya yardımcı histokimyasal ve immunhistokimyasal belirleyiciler Belirleyici Tümör tipi Duyarlılık Özgüllük Müsin Adenokarsinom %23 %98 TTF-1 Adenokarsinom %54-88 % 97-100 Napsin A Adenokarsinom % 65-90 % 96 p63 Skuamöz H Karsinom %92-100 % 68-74 SK 5-6 Skuamöz H Karsinom %84-98 %72-82
Sadece TTF-1 ve p63/p40 kullanarak KHDAK yorumlamak: P63/p40 P63/p40+ P63/p40++ TTF1++ ADC ADC ADC TTF1+ ADC ADC SQCC TTF1 ND ND SQCC ( ), negative; (+), focal; (++), diffuse; ADC, adenocarcinoma; ND, not determined; SQCC, squamous cell carcinoma; TTF1, transcription termination factor, RNA polymerase I. Rekhtman et al. Mod Pathol. 2011;24:1 12.
Raporlama: Morfoloji yeterli ise Skuamöz hücreli karsinom Adenokarsinom Morfoloji Yeterli değilse +IHK : TTF-1 ve p63 KHDAK -epikriz ile; IHK sonuçları ile öncelikle Adenokarsinom, IHK sonuçları ile öncelikle Skuamöz hücreli karsinom, IHK uygulanamamış/ IHK sonuçları alt tiplemeye yetmemiş ise KHDAK NOS
Patolog materyali moleküler çalışmaların yapılabileceği düşünülerek değerlendirilmeli!
PD-L1