BÖBREK TRANSPLANTASYON İMMUNOLOJİSİNDE GÜNCEL DURUM ve NGS HLA Prof.Dr. Mahmut Nezih ÇARİN Gayrettepe Florence Nightingale Hastanesi İmmünoloji Bölüm Başkanı 5. ULUSAL TRANSPLANTASYON İMMUNOLOJİSİ ve GENETİĞİ KONGRESİ 16 19 NİSAN 2015
Böbrek Naklinde İmmunolojik Parametreler Kan Grubu Doku Grubu PRA Tarama Tanımlama Single Antigen Beads DSA C1q CDC Crossmatch T hücre B hücre Flow Cytometry Crossmatch T hücre B hücre Auto
İstenmeyen Durum
HLA Uyumunun Avantajları Yüksek greft survisi Yüksek greft fonksiyonu İmmunosupresyonun azaltılması
Bir alıcı ve verici arasında, doku uygunluğu ne kadar fazla ise, greftin ömrü o kadar uzun olacaktır.
Transplantasyonun başarılı sonuçları tam HLA uyumlu donörler ile sağlanır, ancak ; Her hasta için tam uyumlu donör bulmak, HLA sisteminin çok polimorfik olması nedeniyle zordur. Birçok hasta bu nedenle mismatch li (uyumsuz) greft ile transplante edilmektedir. Ancak... Her HLA uyumsuzluğu, aynı yıkıcı immun yanıta neden olmamaktadır. FHJ Claas
MHC Polimorfizmin Özellikleri 1. Her lokusta birçok alel olması 2. Dominant alel olmaması ( Kodominant aktarım ) 3. Alellerin aminoasit değişiklikleri göstermesi
HLA molekülleri yüksek oranda polimorfiktir. 1800 1600 1400 1200 1000 1193 1800 829 902 HLA ALELLERİ Class I 3822 Class II 1159 2006-2007 800 600 400 200 0 112 141 HLA-A HLA-B HLA-C HLA-DR HLA-DQ HLA-DP
G. Opelz, CTS
Figure 1: Graft survival rates in relation to the number of HLA-A,-B,-DR mismatches for transplants of deceased donor (p<0.001)
Anti-HLA antikorları yabancı HLA moleküllerine maruz kalınması sonucu gelişir. Hamilelikler Kan transfüzyonları Daha önceki nakiller
HLA specific antikor tespiti ve karakterizasyon belirleme Lymphocytotoxicity (CDC) Flow Cytometry
HLA specific antikor tespiti ve karakterizasyon belirleme Lymphocytotoxicity (CDC) Flow Cytometry Single Antigen Beads (Luminex-SAB)
HLA spesifik antikorlar ile klinik bulguların ilgisi Hyper acute rejection Acute humoral/cellular rejection Low risk
Allograftlar hücrelerin değil antikorların etkisiyle rejekte olur. Antikorları üreten hücrelerdir ama grefti yıkan antikorlardır. IgG tipi
Humoral Theory of Transplantation Paul I. Terasaki HİPERAKUT REJEKSİYON AKUT REJEKSİYON KRONİK REJEKSİYON ANTİKOR HUMORAL TEORİNİN SONUÇLARI VE ÖNERİLER ANTİKOR VARLIĞI ANTİKORLARIN ETKİSİ ANTİKOR ÖZELLİĞİ ANTİKOR SAPTANMASI DESTEKLEYİCİ YAYINLAR Terasaki ve ark; 2003;Am J Transplant
Antikor endotele bağlanır ve bir hasar-onarım döngüsü oluşturur. Bu onarım aylar, yıllar boyunca sürebilir. Damar intimasındaki kalınlaşma yavaş seyirlidir ve ilerleyicidir. Kısaca hasar onarımdan daha hızlıdır.
Anerji Hücre yüzey molekülleri ve ikincil sinyaller Sitokinler Lokal / Merkezi Etkili T Hücre Tanıması İmmunsupresif Tedavi Humoral Teori
Eğer HLA antikorları rejeksiyona neden oluyorsa rejeksiyondan önce saptanmalıdır. Grefti fonksiyone olan hastaların yaklaşık %30 unda antikor vardır ancak bu durum Hümoral Teori yi çürütmez. Çünkü teori hasarın ilerleyici olduğunu ve antikor varsa bir gün mutlaka organ yetmezliği olacağını savunmaktadır. Terasaki ve ark; 2004;Am J Transplant
Anti-HLA Antikor Spesifitesi Greft rejeksiyonunda serumda saptanan antikorlar çoğunlukla donöre karşı değildir. Çünkü rejeksiyon sırasında donöre yönlenmiş antikorların greft tarafından emildiği düşünülmektedir. Lee ve ark; 2002; Transplantation
Transplantasyonun Hümoral Teori si 40-50 yıldan bu yana Üç Ana Basamakta uygulanmaktadır Transplantation 2012;93:751-756
1) Boya Testi (Dye exclusion test) Canlı hücreler trypan blue ile boyanmaz. Antikor ve kompleman tarafından öldürülmüş olan hücreler mavi boyanır Papenheimer AM, J Exp Med, 1917 Aglutinasyon testi antijen ayrımında kullanılır. Van Rood JJ et al, Nature, 1958
2) Microlymphocyte Cytotoxicity Test Böbrek naklinde pozitif cross-match testinin önemi Komplemana bağlı sitotoksisite (CDC) testi, nakil öncesi donör spesifik antikor (DSA) tespitinde altın standart olmuştur. Antikor aracılı hiperakut rejeksiyon Patel & Terasaki, N Engl J Med, 1969
3) Single Antigen Bead test HLA moleküler yapısının tanımlanması sadece tek bir HLA spesifikliği ile sağlanmıştır Bjorkman PJ et al, Nature, 1987 Bir tek HLA antijen ile kaplı Bead ler tüm anti-hla antikor spesifikliğinin tanımlanmasını sağlar Pei R et al, Transplantation, 2003 Bu yeni teknoloji aynı zamanda anti-hla antikor test stratejisini de belirler Bray & Gebel, Curr Opin in Organ Transpl, 2009
FLOW SİTOMETRİ-TEK ANTİJEN BONCUKLAR Spesifik PRA dan en önemli farkı boncukların tek bir HLA antijeni ile kaplı olmasıdır. FL2 FL2 FL1 FL1 Yazılıma ihtiyaç yoktur, yazılıma bağlı hatalar ortadan kalkar.
Solid faz test sistemleri Flow sitometri ELISA Lumineks HLA antikoru Ortalama kanal kayması OD değerleri Ortalama floresan yoğunluğu (MFI)
Tek antijen paneli maskelenmiş antikor spesifitelerini ortaya çıkarır. Antikorlar Maskelenmiş antikorlar Pei et al.transplantation,2003
SAB tekniği ile S1, S2, S3, S4 örneklerinde spesifik test sonuçlarına ek olarak saptanan yeni HLA antikorları SAB tekniği ile S3 örneklerinde elemine olan antikorlar parantez içinde gösterilmiştir. Single human leukocyte antigen flow cytometry beads for accurate identification of human leukocyte antigen antibody specificities. Pei R, Lee JH, Shih NJ, Chen M, Terasaki PI. Transplantation. 2003 Jan 15;75(1):43-9
Deneyimimiz... Bir olgu... HASTA HLA TYPE A*01, A*26 B*52, B*55 DRB1*14, DRB1*15 DONOR (BABA) HLA TYPE A*03, A*26 B*35, B*55 DRB1*14, DRB1*04 DQB1*3(8)-DQB1*05 CDC-XM- 22/01/2014 NEGATIF Flow Cytometry XM- 22/01/2014 T FCXM- B FCXM- Auto FCXM : NEGATIF CDC-XM- 02/07/2014 NEGATIF Flow Cytometry XM- 02/07/2014 T FCXM- B FCXM- Auto FCXM : NEGATIF
Deneyimimiz... Bir olgu... CDC-XM- 04/11/2014 NEGATIF Flow Cytometry XM- 04/11/2014 T FCXM- B FCXM- Auto FCXM : NEGATIF Antibody Identification; LUMINEX- 04/11/2014 Class I: 62% POSITIF A2(MFI:5125)-A24(MFI:2215)-A36(MFI:2889)-A66(MFI:2174)- A68(MFI:1999)-B13(MFI:3010)-B45(MFI:5125)-B47(MFI:1401)-B48(MFI:1580)-B49(MFI:1999)- B55(MFI:1469)-B57(MFI:4345)-B58(MFI:2174)-B59(MFI:979)-B60(40)(MFI:2215)- B61(40)(MFI:1810)-B63(15)(MFI:3055)-B71(70)(MFI:1843)-B72(70)(MFI:4682)- B77(15)(MFI:2215)-B81(MFI:1061)-B82(MFI:1999)-Cw7(MFI:2963) Class II: 60% POSITIF DQ2(MFI:1303)-DQ3(7)(MFI:13282)-DQ3(8)(MFI:11440)- DQ3(9)(MFI:12211)-DR4(MFI:731)-DR7(MFI:976)
Single Antigen Bead DQ3(8)(MFI:6101) DR4(MFI:481) DSA (17.07.2014) Class I: NEGATİF Class II: POZİTİF (MFI:2089) DSA (24.12.2014-Nakil Öncesi) Class I: NEGATİF Class II: POZİTİF (MFI:808)
Bu Olgu İçin Test Parametreleri Kan Grubu Doku Grubu PRA Tarama Tanımlama Single Antigen Beads DSA C1q CDC Crossmatch T hücre B hücre Flow Cytometry Crossmatch T hücre B hücre Auto
Protocol for desensitisation Rituximab, MMF, Septrin FK, prednisolone, ranitidine and viral prophylaxis Plasmapheresis Transplant Plasmapheresis Protocol biopsies Day -28 Day -14 Day -7, -5, -3,-1 Day 1,3,5 Day 7 and 14 Requirement to render the CDC crossmatch negative prior to transplantation. If this is not achieved after 4 plasmapheresis sessions then further treatment will be required and the transplant delayed. At each session 1 to 1.5 plasma volumes processed. June 2014 Craig Taylor
Hassasiyet Boncuk tabanlı florometrik testler > kolorimetrik ELISA (Flow sitometri tek antijen boncuklar, Lumineks) Tek antijen boncuklarla tespit edilen antikor sıklığı ELISA ile tespit edilenin iki katıdır. Zachary et al. Human Immunol, 2009
«Ayrıca belirtmek gerekir ki kalitatif sonuç vermek üzere geliştirilen Luminex tabanlı kitler yarı kantitatif sayısal sonuçlar da verebilir» Transplantation Volume 95, Number 1, January 15, 2013
Tek antijen boncuklarla tespit edilen antikorların gücünün klinik anlamlılık ile ilişki olduğu belirtilmiştir. Tanımlanan bir HLA antikorunun gücü XM in önemli bir göstergesidir.
Antikorların gücünün belirlenmesi Ortalama floresan yoğunluğu=mean Floresence Intensity (MFI) Bir antikorun gücünü belirlemede iki analiz tipi vardır: Anti-HLA antikorunu tanımlayan tek bir antijen boncuğunun MFI sı DSA MFI sının pozitif kontrol MFI sı ile bölünmesi sonucu oluşan oran Morris GP et al. Hum Immunol, 2010
MFI<2000 ya da MFI oranı <0.2 olan zayıf reaksiyon veren DSA lar pozitif XM ile sonuçlanmaz ve transplantasyon için kontraendikasyon olmayabilir. Ancak, bu testlerdeki cut-off değerler için standart bir uygulama yoktur. Her laboratuar kendi internal kalite kontrol testleri ve test içi kontrollerle en uygun cut-off değeri belirlemelidir. Morris GP ve ark. Hum Immunol, 2010
Ortalama Floresan Yoğunluğuna (MFI) göre kabul edilemeyen antijenlerin belirlenmesi
DSA varlığı/kabul edilemeyen antijenlerin belirlenmesi basit bir EVET/HAYIR cevabı değildir. Spesifite Ig sınıfı Güç Zamanlama Komplemanı fikse etme durumu Tambur et al.am J Transpl, 2009
Donöre özgü HLA antikorlarının klinik etkilerini değiştirebilecek potansiyel patojenik faktörler Humoral hafıza yanıtının büyüklüğü ve devamlılığı Kompleman Hafıza T-hücresi Plazma hücresi Anti-HLA antikorları Hafıza B-hücresi HLA ekspresyon yoğunluğu Donör-HLA HLA-DSA nın hedef epitopa bağlanma gücü HLA-DSA nın komplemanı aktive etme kapasitesi Endotelyal hücrelerin koruyucu özellikleri
Günümüzde, transplantasyon merkezlerinin karşı karşıya kaldığı en önemli konu yüksek oranda sensitize hastaların transplantasyonudur. Bu hastalar gebelikler, kan transfüzyonları ve daha önceki nakiller nedeniyle çok sayıda HLA antijenine karşı antikor geliştirmiş olup, bekleme listelerinde uzun süreler beklerler.
Yüksek oranda sensitize hastaya yaklaşım 1) cross-match negatif bir Yüksek oranda donör bulma şansını artırmak sensitize hastaların 2) antikorları temizleyip, nakil olabilirliği DSA varlığına rağmen, hastaya nakil yapmak artırılmalıdır!!!!
Virtual cross-match (vxm) terimi kullanıma yeni girmiş olmasına rağmen, uzun süredir uygulamada olan bir yaklaşımdır. Preliminer cross-match ve hiperimmün plaklar Eurotransplant + UNOS Kabul edilebilir uyumsuzluklar (Acceptable mismatches) Kabul edilemeyen uyumsuzluklar (Unacceptable mismatches)
The acceptable mismatch program of Eurotransplant Frans Claas Eurotransplant Reference Laboratory Leiden University Medical Center. Leiden, the Netherlands
Sensitize hastalardaki temel problem: Donör Spesifik Antikorların hiperakut retler için belirleyici olmasıdır. antikorlar süre Patel & Terasaki (1969): 30 hastadan 24 hiperakut red vakada donör spesifik antikor gözlemlemiştir. Hastada verici dışlanmasına yolaçan donör spesifik antikor tesbit edilmesi için yapılan serolojik uyum testleri, hiperakut redleri önleyecektir.
Yüksek sensitize hastalarda sıklıkla pozitif uyumsuzluk gözlenmektedir Bu nedenle yüksek sensitize hastaların sayısı organ bekleme listesinde güngeçtikçe artmaktadır. Yüksek sensitize hastaların Eurotransplant içindeki durumu: verici nüfusunun %85den fazlasının HLA anijenleri hasta ile uyumludur. Organ verici nüfusundaki hedef antijenlerin frekansı HLA antikorları ile ilgili fakat antikor taramasındaki %PRA oranı ile ilgili değildir. Eurotransplant web sitesinde yer alan donör reaktif antikor hesaplama programı farklı merkezlerdeki yüksek sensitize hastaların da katıldığı 30.000 organ vericisinin HLA tipleme verilerine dayanmaktadır. 48
49
Eurotransplant Böbrek Tahsis Merkezi sensitize hastalara öncelik vermektedir Puanlama sistemi farklı parametrelere bağlıdır: HLA uyumu Prognostik uyum indeksi yüksek sensitize hastalara ve nadir HLA fenotiplerine ektra puanlama Bekleme süresi Bölgesel verici (soğuk iskemi dönemi) Ülkesel dengesi 50
Bu önceliklere rağmen sensitize hastaların nakil şansı çok düşüktür % nakil yapılan 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 Bekleme süresi (ay) ET-KAS
Alternatif bir yaklaşım gerekliliği Eurotransplant standart politikası kabul edilmeyen HLA uyumsuzluklarını kaydederek böbrek vericilerinin donör spesifik antikor hastalar için tahsis edilmesini önlemektir. Amaç: pozitif CDC uyumsuzluğunu önlemektir Problem: Çok fazla HLA antijeni olduğu için tüm HLA antikor özelliklerinin yüksek sensitize hasta ihtimaline karşı kaydedilmesi imkansızdır. 52
"Acceptable Mismatch" Programı Dayanak: hastada hiç oluşmamış antikorların HLA antijenlerini tesbit etmek ve verici seçimini buna göre yapmak. Amaç: Negatif CDC uyumsuzluğu öngörmek Yöntem: Alıcı merkezinde geniş çaplı antikor tarama yaparak hastanın antikorları ile etkileşime girmeyecek HLA antijenlerini tesbit etmek. Sonuçların validasyonu Eurotransplant referans laboratuvarında yapılacaktır. 53
Hastanın HLA sı ile uyumlu olabilecek uygun bir HLA ve "Acceptable Mismatch" ile uygun böbrek verici tahsisi HLA Hasta: A24, A31, B27, B51, DR4 AM: A25, A26, B44 Tahsis edilecek HLA fenotipi Uyumlu böbrek vericisi: A25, A31; B27, B51; DR4 A26, A31; B27, B51; DR4 A24, A25; B27, B51; DR4 A24, A26; B27, B51; DR4 A24, A31; B44, B51; DR4 A24, A31; B27, B44; DR4 A25, A31; B44, B51; DR4 A26, A31; B44, B51; DR4 A25, A31; B27, B44; DR4 A26, A31; B27, B44; DR4 A24, A25; B44, B51; DR4 A24, A26; B44, B51; DR4 A25, A31; B27, B44; DR4 54
Negatif uyumsuzluğa sahip organ nakli için daha yüksek şans % nakil yapılan 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 Bekleme süresi (ay) AM ET-KAS
"Acceptable Mismatch" hastalarının yaşama şansı sensitize hastalarınki kadar yüksek olmaktadır. % graft survival Nakil sonrası (ay)
Mevcut Durum "Acceptable Mismatch" (AM) programı yüksek sensitize hastalara nakil imkanı sunan bir uygulamadır. Buna rağmen bekleme listesindeki özellikle nadir HLA fenotipli hastaların bir grubu bundan fayda bulamamışladır. Bu hastalar için çözümler: Hassasiyeti yoketme: donör spesifik antikorları yoketmek. Daha geniş bir verici havuzu: Avrupa çapında büyük bir "Acceptable Mismatch" Programı havuzu oluşturmak. 57
YENİ NESİL DİZİLEME NGS-HLA
Yapmamıza imkan hasıl olan işleri yapmazsak, tarih bizi tenkit eder. 1928 (Hakkı Tarık Us, Ayın Tarihi, Atatürk ün Vefatları, N : 60, 1938, S. 150)