Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi İndol Türevi Yeni Bir Bileşik İle Sıçanlarda Radyasyon Nefropatisinin Engellenmesi The Prevention of Radiation Nephropaty in the Rat with a New Indol Based Compound Dilek ÖZTÜRK*, Bizden SABUNCUOĞLU**, Sibel SÜZEN***, Berna AKKUŞ YILDIRIM**** ÖZET Bu çalışmada yeni sentezlenmiş bir indol türevi bileşiğin radyasyona sekonder gelişen nefropatiyi engelleyici etkisi olup olmadığı araştırıldı. Bu amaçla yirmi sekiz erkek Wistar sıçan dört gruba ayrıldı: Yalnız radyoterapi, Etken madde + radyoterapi, Etken madde + fantom ışınlama ve Serum fizyolojik + fantom ışınlama. Etken madde tek dozda 10mg/kg olacak şekilde radyoterapiden 30 dakika önce intraperitoneal olarak verildi. Radyoterapi tek fraksiyonda ön arka alandan sağ böbreğe tek dozda toplam 10Gy şeklinde verildi. Işınlamadan 8 hafta sonra denekler dekapitasyon yöntemi ile sakrifiye edildiler. Alınan parçalar ışık mikroskopisi ile değerlendirildi. Renal hasar, Tubuluslarda dilatasyon + Atrofi, Glomerülde vakuolizasyon + Skleroz, Tubuluslarda protein depolanması, İnterstisyel alanda lenfosit infiltrasyonu olup olmadığına göre değerlendirildi. Kontrol grublarında böbrek yapısı tamamen normal idi. Yalnız radyoterapi alan grubta ileri derecede renal hasar saptandı. Etken madde + radyoterapi ile yalnız radyoterapi grubları arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlı idi (p<0.007). Bu bulgular yeni sentezlenmiş olan indol türevi bileşiğin radyoterapi sonrası gelişen nefropatiyi engellediği veya azalttığını göstermektedir. Anahtar kelimeler: Radyoterapi, Radyasyon nefropatisi, Radyasyondan korunma, İndol türevi bileşikler, Böbrek SUMMARY The aim of the work was to study the possible protective effect of new indole based compound on radiation nephropathy. Twenty-eight male wistar rats were divided into four groups: Radiotherapy alone, Compound + radiotherapy, Compound + fantom irradiation and Saline + fantom irradiation. The compound was given to the rats intraperitoneally in a single dose of 10mg/kg 30 min prior to irradiation with a dose of 10 Gy in a single fraction. Radiotherapy was given to the right kidney using cobalt 60 teletherapy machine. Animals were sacrified at 8th weeks postradiotherapy. Histopathological evaluation was performed by light microscopy, the following alterations were rated: glomerular vacuolization and sclerosis, marked atrophy and dilatation of the tubules, protein casts in the tubular lumina, interstitial lymphocytic infiltration. All control groups had normal renal ultrastructure. Radiotherapy induced a significant changes on kidney structure. New indole based compound yielded highly significant radioprotection on kidney. The difference between the group of compound+radiotherapy and the group of radiotherapy alone was istatistically significant (p<0.007). Our study suggest that treatment with a compound which has possible antioxidants properties decreases radiation side effects. Key Words: Radiotherapy, Radiation nephropaty, Radioprotection, indol- based compounds, kidney C. Ü. Tıp Fakültesi Dergisi 26 (3):107 112, 2004 GİRİŞ Radyoterapi, kanser tedavisinde vazgeçilmez tedavi yöntemlerinden birisidir. Radyoterapi ile etkin bir lokal kontrol sağlamak için gerekli toplam doza çıkarken * Doç. Dr. C. Ü. Tıp Fakültesi Radyasyon Onkolojisi Anabilim Dalı Sivas ** Doç. Dr. A. Ü. Tıp Fakültesi Histoloji Anabilim Dalı Ankara *** Doç. Dr. A. Ü. Eczacılık Fakültesi Farmasötik Kimya Anabilim Dalı Ankara **** Uzm. Dr. Numune Hastanesi Radyasyon Onkolojisi Bölümü Ankara 107
İndol Türevi Yeni Bir Bileşik İle Sıçanlarda Radyasyon Nefropatisinin Engellenmesi ışınlama alanı içinde kalan normal dokuda hasar oluşmaktadır. Normal dokuda meydana gelen hasar dokunun radyasyona olan duyarlılığına göre değişmektedir. Günümüz radyoterapi teknikleri ile normal dokuda oluşan komplikasyonları azaltmak için ya ışın dozu düşük tutulmalı yada ışınlanan alan miktarı küçültülmelidir. Her iki yaklaşımda lokal kontrolden ödün vermeyi gerekmektedir. Radyasyona sekonder morbiditeyi azaltabilmek için bir başka yaklaşım ise, normal dokuyu radyasyona karşı koruyan ancak tümör üzerinde etkisi olmayan koruyucu maddelerin sistemik yolla kullanılmasıdır. Radyasyonun doku tarafından absorbsiyonu sonrası oluşan serbest radikaller, oksijenli ortamda DNA kırıklarına neden olarak hücre ölümüne sebep olmaktadırlar. Melatonin ve vitamin E gibi antioksidan etkiye sahip olan bu ve benzeri maddelerin radyasyona karşı normal dokuları korudukları gösterilmiştir. Bu maddelerin mekanizması tam olarak bilinmemekle beraber serbest radikal yakalayıcı veya reseptör bağlayıcı olarak etki gösterdiği düşünülmektedir. Literatürde çok sayıda madde üzerinde çalışmalar devam etmektedir(1-5). Aynı amaçla, biz de yeni sentezlenmiş indol türevi bir maddenin radyasyona sekonder olarak gelişen nefropatiyi engelleyici etkisi olup olmadığını araştırdık. GEREÇ VE YÖNTEM İnvivo sağ böbrek ışınlaması: Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Etik Kurulundan onay alınarak çalışmaya başlandı. Çalışmada ağırlıkları 150-200 gr arasında değişen yirmi sekiz adet erkek Wistar sıçan kullanıldı. Hayvanlar ikişer gruplar halinde özel kafesler de Hacettepe Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma laboratuarında aynı şartlarda bakıldılar. Her grupta 7 denek olmak üzere çalışma; Yalnız radyoterapi, Etken madde ve Radyoterapi, Etken madde + fantom ışınlama ve Serum fizyolojik + fantom ışınlama (kontrol) olmak üzere dört gruba ayrıldı.çalışma boyunca tüm işlemler anestezi altında yapıldı. Bu amaçla ketamin (100mg/kg) ve xylazin HCl (3mg/kg) intraperitoneal olarak uygulandı. Deneklere yüzüstü, ön ve arka ayakları sabitlenerek pozisyon verildi. Radyoterapi alanı sağ böbrek palpe edilerek simülasyon cihazında belirlendi. Radyoterapi, Kobalt-60 teleterapi cihazı kullanılarak 3x3 cm boyutlarındaki, ön-arka alandan tek fraksiyonda 10Gy şeklinde verildi. Kontrol gruplarına da aynı koşullarda fantom ışınlama yapıldı. Yeni sentezlenmiş indol türevi etken madde, ışınlamadan 30 dakika önce, tek doz 10 mg/kg olacak şekilde intraperitoneal olarak deneklere verildi. Yalnız etken maddenin uygulandığı gruba enjeksiyon radyoterapi kolu ile eşzamanlı ve aynı dozda verildi. Kontrol grubuna ise serum fizyolojik intraperitoneal olarak verildi. Hayvan grupları 8. haftada dekapitasyon yöntemi kullanılarak sakrifiye edildiler. Histopatolojik değerlendirme: Alınan parçaları ışık mikroskobunda değerlendirmek için, % 10 luk ph sı 7.4 olan nötral formalinde 2 gün tespit edildikten sonra rutin ışık mikroskobu takip yöntemlerinden geçirilerek parafine gömüldü. Elde edilen parafin bloklardan Leitz-1512 tipi mikrotomla 4-6 mikrometre kalınlığında alınan kesitler Hematoksilin Eozin boyası ile boyanarak Zeiss Axioskop Fotomikroskobunda görüntülendi. Tüm incelemeler böbrek üzerinde uzman bir histolog tarafından yapıldı. Histopatolojik gradelendirme, Tubuluslarda dilatasyon + Atrofi, Glomerülde vakuolizasyon + Skleroz, Tubuluslarda protein depolanması, İnterstisyel alanda lenfosit infiltrasyonu olup olmadığına bakılarak yapıldı(6). Renal hasar Grade 0 dan 4 e kadar numaralandırıldı: 0 Hasar yok, 1 Çok az hasar, 2 Az hasar, 3 Orta derece hasar, 4 Ciddi hasar. Yukarıda tanımlanan her lezyon için ayrı ayrı puanlama yapıldı; değerler toplanıp dörde (değerlendirilen hasar tipi sayısı) bölündü. İstatistiksel analiz:gruplar arası patolojik gradeler Kruskal- Wallis testi ve bunu takiben Mann- Whitney U testi ile Bonferroni korelasyonu kullanılarak karşılaştırıldı. p<0.05 değerler anlamlı olarak kabul edildi. BULGULAR Işınlama sonrası dönemde hayvanlarda tüy dökülmesi, cilt reaksiyonu, diare, beslenme bozukluğu gibi yan etkiler görülmedi. Histolojik değerlendirme: Çalışma gruplarının ışık mikroskopi sonuçları aşağıda verilmiştir: 108
Öztürk ve ark. 1. Yalnız Radyoterapi Grubu Tubuluslarda dilatasyon ve yer yer dejenerasyon gözlendi. Bu bulgu subkapsüler alanda daha belirgindi. Dilatasyon özellikle distal tubuluslarda belirgindi. Dejenerasyon ise proksimal tubulus hücrelerinde daha göze çarpıcıydı. Yine bu tubulusların lümenlerinde proteinöz materyal izlendi (Şekil 1). Pek çok alanda glomerül yapısında bozulma gözlendi; glomerül yumağı- Bowmann kapsülü arasında bütünlüğün bozulduğu, bazı alanlarda glomerül yumağının büzüştüğü dikkati çekti. Şekil 3: Lenfosit infiltrasyonu (ok) izleniyor. H.E. X 50 2. Etken madde + Radyoterapi Grubu Bu grupta da tubuler dilatasyon ve yer yer dejenerasyon gözlendi. Ancak bulgular sadece radyoterapi uygulanan gruba göre daha az göze çarpıcıydı. Daha çok subkapsüler bölgede sınırlıydı. Glomerül yapıları da sadece radyoterapi uygulanan gruba göre daha iyi korundu (Şekil 4). Şekil 1: Tubuluslarda dilatasyon (*), yer yer dejenerasyon ve lümenlerinde proteinöz materyal izleniyor. H.E X100 İntersisyel alanda hafif ödem ve bağ dokusu artışı vardı. Bazı alanlarda lökosit infiltrasyonu gözlendi. Genel olarak organda kapiller dilatasyon ve konjesyon saptandı (Şekil 2 ve 3). Şekil 4: Tubuler dilatasyon ve yer yer dejenerasyon daha çok subkapsüler alanda gözleniyor. H.E. X 25 Şekil 2: İntersisyel alanda hafif ödem ve bağ dokusu (*) artışı izleniyor. H.E.X 50 3. Etken madde + Fantom ışınlama Grubu İntersisyel alanda yer yer lenfositler izlendi. Tubuler yapı ve glomerüller genel olarak normal izlendi. 4. Serum fizyolojik + Fantom ışınlama Grubu Normal yapıda gözlendi. Çalışma gruplarının histopatolojik grade sonuçları Tablo 1 de gösterilmiştir. 109
İndol Türevi Yeni Bir Bileşik İle Sıçanlarda Radyasyon Nefropatisinin Engellenmesi Tablo 1: Tüm deneklerin histopatolojik gradeleri. Gruplar Grade 0 Grade 1 Grade 2 Grade 3 Grade 4 Toplam RT 0 0 3 3 1 7 E + RT 1 3 3 0 0 7 E + FT 6 1 0 0 0 7 SF + FT 7 0 0 0 0 7 RT: Yalnız radyoterapi E + FT: Etken madde + fantom ışınlama E + RT: Etken madde + Radyoterapi SF + FT: Serum fizyolojik + fantom ışınlama İstatistiksel olarak gruplar arası gradeler incelendiğinde, Etken madde ve Radyoterapi grubu ile yalnız Radyoterapi grubu arasındaki fark anlamlı idi (p< 0.007). TARTIŞMA Radyasyon nefropatisi progresif glomerüler ve tübüler değişikler ile seyreden glomeruloskleroz ve tübülointerstisyel fibrozis ile sonuçlanan irreversible bir hasardır. Radyasyon nefropatisinin oluşum mekanizması tam olarak açıklanmamıştır. Angiotensin II nin önemli bir rol oynadığı bilinmekle beraber bunun serbest radikaller aracılığı ile gerçekleştiği düşünülmektedir. Robbins ve ark. invivo serbest radikal ölçümü zor olduğundan immünhistokimyasal yöntemlerle DNA oksidasyonunu ölçmüşlerdir. Işınlamadan 4 hafta sonra ve 24 hafta boyunca DNA oksidasyonu yüksek oranda tesbit edilmiştir. 16 ve 24. haftalarda radyoterapiye bağlı değişiklikler glomeruloskleroz ve tubüler atrofi ile sonuçlanmıştır(7). Bizim çalışmamızda 8. haftada yalnız radyoterapi kolunda yoğun tübüler dilatasyon ve dejenerasyon ile ileri derecede glomerüler hasar saptanmıştır. Hem kemoterapötik ilaçlara hem de radyoterapiye sekonder nefropatinin endojen renal antioksidan sistemin inhibe edilmesi sonucu oluştuğu gösterilmiştir. Bu nedenle antioksidan etki gösteren pek çok madde üzerinde çalışmalar devam etmektedir. Literatürde antioksidan özellikleri nedeniyle Melatonin ve Vitamin E en çok incelenen maddelerdir. Çok sayıda çalışmada Melatonin ve diğer indolaminlerin serbest radikalleri inaktive ettiği gösterilmiştir (8-13). Bu nedenle bizim çalışmamızda bu maddelere benzer yeni bir madde sentezlenmiş ve renal hasar düzeyi incelenmiştir. Durak ve arkadaşlarının sisplatine sekonder nefrotoksisiteyi araştırdıkları çalışmalarında, Vitamin E ve C kombinasyonu ve doğal antioksidan ekstre (SARMEX) kullanmışlardır. Sisplatin alan deneklerde 24 saat sonra antioksidan bir enzim olan superoksit dismutaz ve katalaz düzeylerinde azalma ve malondialdehit düzeyinde artış saptanmıştır. Buna karşın antioksidan tedavi alanlarda tam tersi gerçekleşmiştir. Bu çalışmada antioksidanların adjuvan olarak kullanılması önerilmektedir(14). Bizim çalışmamızda da antioksidan özelliklere sahip indol türevi madde morfolojik olarak daha az renal hasara neden olmuştur. Radyoterapi kolunda glomerüler yapılarda büzüşme, Bowmann kapsülü ile glomerül yumağı arasında bütünlük bozulması görülürken etken maddenin kullanıldığı kolda glomerüler yapılar korunmuştur. Aynı şekilde Doksorubisine sekonder nefrotoksisiteyi araştıran Dziegiel ve ark, subkutan 10mg/kg melatonini Doksorubisin önce ve sonrasında vermişler ve renal hasarın düzeyini incelemişlerdir. Morfolojik olarak istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde daha az hasar görülmüş ve lipid peroksidasyon metabolitleri olan malondialdehit, 4-Hidroksialkenal düzeylerinde de azalma saptanmıştır(6). Bizim çalışmamızda da morfolojik bulgular Dziegiel ve arkadaşlarının çalışmasını desteklemektedir. Çalışmamızda antioksidan maddenin kullanılması renal hasarı anlamlı bir şekilde azaltmıştır(p<0.007). Longoni ve arkadaşlarının Siklosporin A ya sekonder nefropati ile ilgili çalışmalarında melatoninin glomerular kollapsı ve tübüler hasarı önlediği morfometrik analizle gösterilmiştir(15). Bizim çalışmamızda da indol türevi bileşiğin kullanıldığı kolda 110
Öztürk ve ark. glomerüler ve tübüler hasarda azalma saptanırken, interstisyel alanda fibrozis ve ödem görülmemiştir. Tübüler hasar subkapsüler bölgede sınırlı kalmıştır. Koç ve arkadaşları tüm vücut ışınlamasına sekonder hematolojik toksisiteyi azaltmak için melatonin kullandıkları çalışmalarında, melatoninli grubun lökosit ve trombosit sayılarının yalnız radyoterapi uygulanan gruba göre anlamlı şekilde yüksek olduğu gösterilmiştir(16). Melatonin ve vitamin E farklı basamaklarda koruyucu etki göstermektedir. Bu nedenle bizim çalışmamızda, her iki maddenin de etkisinden yararlanarak koruyucu etkinin artırılması planlanmış ve formulasyon açısından melatonin ve vitamin E ye benzerlik gösteren bir indol ve benzimidazol türevi bileşik sentezlenmiştir. Bu yeni bileşik Melatonin ve vitamin E kadar morfolojik düzeyde tübüler ve glomerüler yapıları korumuş ve radyasyona sekonder renal hasarda azalma sağlamıştır. Ayrıca yalnız etken maddenin kullanıldığı kolda renal hasar görülmemiş, kontrol grubu ile benzer bulgular saptanmıştır. Bu bulgular yeni sentezlenmiş indol türevi bileşiğin toksik olmadığını göstermektedir. Devam etmekte olan araştırmalarda yeni sentezlenen bileşiklerin preklinik ve klinik çalışmalarda dikkatlice incelenmesi ve radyoterapi için en uygun nontoksik, etkin, güvenilir ve geniş spektrumlu bir maddenin bulunması gerekmektedir. Radyoterapi sırasında oluşan normal doku toksisitesinin azalması veya engellenmesi radyoterapi ile daha yüksek dozlara çıkılmasını sağlayacaktır. Aynı şekilde eşzamanlı kemoradyoterapi protokolleri gibi toksisitesi yüksek yeni tedavilerin uygulama alanını genişletecektir. Tüm bu gelişmeler kanser tedavisinde daha iyi bir lokal kontrol ve daha iyi bir sağkalım elde edilmesine imkan verecektir. KAYNAKLAR 1. Korovkina EP, Mikhailov PP. Radioprotective activity and toxicity of copolymer 2-methyl-5-vinyl pyridine with 2-methyl-5-vinylpyridinium-n-oxide. Radiats Biol Radioecol 2000; 40: 54-7. 2. Juchelkova L, Hofer M,Pospisil M, P,palova I. Radioprotective effects of flurbiprofen and its nitroderivativ. Physiol Res 1998; 47: 73-80. 3. Hosseinimehr SJ, Shafiee A, Mozdarani H, Akhlagpour S. Radioprotective effects of 2-iminothiazolidine derivatives against lethal doses of gamma radiation in mice. J Radiat Res 2001; 42: 401-8. 4. Biscay P, Lespinasse F, Oiry J, Huczkowski J ve ark. Radiobiological evaluation of a newly synthesized cysteamin derivative. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1986; 12: 1469-1473 5. Schumacher CP, Robbe Y, Subra G ve ark. The radioprotective power of 2-isopropyl 5-methyl 1,3- thiazolane. Farmaco 1997; 52: 187-9 6. Dziegiel P, Suder E, Surowiak P, Jethon Z, Rabczynski J et al. Role of exogenous melatonin in reducing the nephrotoxic effect of daunorubicin and doxorubicin in the rat. J. Pineal Res 2002; 33: 95-100. 7. Robbins ME, Zhao W,Davis CS ve ark. Radiationinduced kidney injury: a role for chronic oxidative stres? Micron 2002; 33: 133-41 8. Cardinali DP, Golombek DA, Rosenstein RE ve ark. Melatonin site and mechanism of action: single or multiple? J Pineal Res 1997; 23:32-9 9. Karbownik M. Potential anticarcinogenic action of melatonin and other antioxidants mediated by antioxidative mechanisms. Neuroendocrinol Lett 2002; 23 Suppl 1: 39-44. 10. Zang Ly, Comsa G, Gardner H ve ark. Scavenging of reactive oxygen species by melatonin. Biochim Biophys Acta 1998: 27; 1425:469-77. 11. Daniels WM, van Rensburg SJ, van Zyl JM ve ark. Free radical scavenging effects of melatonin and serotonin: possible mechanism. Neuroreport 1996: 8; 7: 1593-6. 12. Şener G, Şehirli AO, Altunbaş HZ ve ark. Melatonin protects against gentamicin-induced nephrotoxicity. İn rats. J Pineal Res 2002; 32: 231-6. 13. Şener G, Satıroğlu H, Kabasakal L ve ark. The protective effect of melatonin on cisplatin nephrotoxicity. Fundam Clin Pharmacol 2000; 14: 553-60. 14. Durak I, Özbek H, Karaayvaz M, Öztürk HS. Cisplatin induces acute renal failure by impairing antioxidant system in guinea pigs:effects of antioxidant supplementation on the cisplatin nephrotoxicity. Drug Chem Toxicol 2002; 25: 1-8. 15. Longoni B, Migliori M, Ferreti A. Melatonin prevents cyclosporine induced nephrotoxicity in isolated and perfused rat kidney. Free Radic Res 2002; 36: 357-363 16. Koç M, Büyükokuroğlu ME,Taysi S. The effect of melatonin on peripheral blood cells during total body irradiation in rats. Biol Pharm Bull 2002; 25: 656-7 17. Noaman E, Zahran AM, Kamal AM, Orman Mf. Vitamin E and selenium administration as a modulator of 111
İndol Türevi Yeni Bir Bileşik İle Sıçanlarda Radyasyon Nefropatisinin Engellenmesi antioxidant defense system: biochemical assessment and modification. Biol Trace Elem Res 2002; 86: 55-64. 18. Weiss JF, Landauer MR.Radioprotection by antioxidants. Ann N Y Acad Sci 2000; 899: 44-60. 19. Kassayova M, Ahlersova E, Ahlers I. Two-phase response of rat pineal melatonin to lethal whole body irradiation with gamma rays. Physiol Res 1999; 48: 227-30. Yazışma adresi: Doç. Dr. Dilek Öztürk Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Radyasyon Onkolojisi Anabilim Dalı 58140 Sivas İş Tel: 0 346 2191300/ 2886 Faks: 0 346 2191284 e-mail: dozturk@ cumhuriyet.edu.tr 112