Klinik mikrobiyoloji uzmanının sorumluluğunda kan hizmet birimleri İMMÜNOHEMATOLOJİK TESTLER Dr.A.Esra KARAKOÇ S.B.Ankara EAH TKMTD, TKV KLİMUD-EGE Sürekli Tıp Eğitimi, Sürekli Mesleki Gelişim Etkinliği, 27.3.2012
İmmünohematolojik Testler Kan gruplama Çapraz Karşılaştırma Antikor tarama Antikor tanımlama
ISBT Kan Gruplama Sistemleri Adı ABO MNS P Rh Lutheran Kell Lewis Duffy KiddJ Diego Cartwright XG Scianna Dombrock Colton Landsteiner-Wiener Chido/Rodgers Hh Kx Gerbich Cromer Knops Indian Ok Raph JMH Kısaltma ABO MNS P RH LU KEL LE FY K DI YT XG SC DO CO LW CH/RG H XK GE CROM KN IN OK RAPH JMH
ABO Kan Grup Sistemi ABO sistemi iki özellik nedeniyle farklı Serumda aglutinin varlığı ABH ag leri bir çok dokuda ve sekresyonlarda bulunur Serumda antikor gösterilme prensibine dayanan karşıt gruplamanın yapıldığı tek kan grup sistemi
Eritrosit Transfüzyonu
Plazma Transfüzyonu
KAN GRUPLARININ BELİRLENMESİ 7
REVERSE FORWARD KAN GRUPLARI 8
Kan Gruplarının Saptanması 1. Hemaglütinasyon Lam (Slide) yöntemi Tüp yöntemi Jel Santrifügasyon yöntemi Mikroplak yöntemi 2. RİA 3. EİA 4. PCR 9
Hemaglütinasyon Sonuçlarını Etkileyen Faktörler 1. Fiziksel Koşullar İnkübasyon ısısı IgM tipi antikorlar 4-27ºC (oda ısısı) IgG tipi antikorlar 30-37ºC (inkübatör) İnkübasyon süresi Santrifüj hız ve süresi Ortam: ph, LISS solüsyonu, enzimler, makromoleküller 2. Eritrositler 3. Yüzey antijenlerinin tipi, sayısı, lokalizasyonu ve immünojenitesi Homozigot veya heterozigot olmaları Serum: Protein içeriği ve antikorların yapı ve türleri 10
Hasta Örneği 11
TÜP YÖNTEMİ 12
13
14
Aglütinasyonun Değerlendirilmesi Aglütinasyon Değerlendirme ++++ Bir tek büyük küme, serbest hücre yok +++ Birkaç büyük küme, serbest hücre yok ++ Çok sayıda büyük ve küçük küme, serbest hücre yok + Çok sayıda küçük küme, zeminde serbest hücre var Mikroaglütinasyon Makroskobik negatif, mikroskobik bazı alanlar 6-8 hücreli kümeli Şüpheli Makroskobik negatif, çok nadir mikroskobik 6-8 hücreli küme Rulo Oluşumu Mikroskobik olarak kümeler para dizisi şeklinde Negatif Makroskobik ve mikroskobik küme yok Mixed Field Çok sayıda büyük ve küçük küme, zeminde serbest eritrosit var 15
Forward Gruplama 16
Temiz ve etiketli test tüplerine birer damla anti-a, anti-b, anti-ab, anti-d ve hasta serumu damlatılır 17
Her bir tüpe bir damla test edilecek eritrositlerin en az 3 kez yıkanmış % 2-5 lik süspansiyonundan (SF, serum veya plazma ile hazırlanmış) damlatılır 18
Tüp içerikleri yavaşça karıştırılır ve yaklaşık 900-1000 x g de 15-30 sn santrifüj edilir (Alternatif olarak tüpler santrifüj edilmeden 1 saat oda ısısında bırakılır) 19
Tüplerin dibindeki eritrosit birikintileri tekrar yavaşça süspanse edilir ve makroskobik olarak aglütinasyon açısından incelenir. Test sonuçları okunur, yorumlanır ve kaydedilir 20
hemoliz agglütinasyon 21
Reverse Gruplama 22
Reverse gruplama Hasta serumu Test eritrositleri 23
hemoliz agglütinasyon 24
SONUÇLANDIRMA Forward Reverse A Ag pozitif D Ag negatif Anti-B Ab pozitif A grubu Rh negatif A grubu 25
JEL YÖNTEMİ 26
27
28
29
Aglütinasyonun Değerlendirilmesi +4 +3 +2 +1 0 30
31
MİKROPLAK YÖNTEMİ 32
Mikroplak ABD Gruplama 33
ÇAPRAZ KARŞILAŞTIRMA (Cross-Match) 36
Transfüzyon sırasında veya sonrasında oluşabilecek Ag-Ab reaksiyonunun laboratuvar ortamında yapılan ön denemesidir. Alıcı serumuyla verici eritrositleri karşılaştırılır Alıcı ve verici ABO uyumunun son kez doğrulanması Panel dışı Ab varlığı durumunda bu Ab ların belirlenmesi Majör CRM; alıcı serumu verici eritrositleri Minör CRM; verici serumu alıcı eritrositleri 37
Çapraz Karşılaştırma ABO ve Rh sistemleri dışında bulunan kan grupları nedeniyle önemli Kan transfüzyonu öncesi yapılması gerekir Lewis; Lea - Le - Leb MN; M - N - S - s U P; P1 - P2 - p Luteren; Lua - Lub Kell; K - k Duffy; Fya - Fyb İi; İ - i
Çapraz Karşılaştırma ABO Rh uygun kan % 98 uyum Antikor tarama -tanımlama Çapraz karşılaştırma % 2 ek uygunluk
Çapraz Karşılaştırma Aglutinasyon yok ~ uyumlu Aglutinasyon ~ uyumsuz Verici Eritrositi Hasta Serumu
42
Çapraz Karşılaştırma
Acil Cross-Match (Immediate Spin) Klinisyene göre, normal CRM prosedürünün uygulanması için geçecek süre hayati bir zaman kaybına neden olacaksa IS CRM Acil durumlar dışında kullanılmamalıdır Acil bir durumda IS CRM yapılarak kan kliniğe gönderildiğinde, mutlaka standart CRM işlemi de yapılıp sonuç klinisyene bildirilmelidir!.. 44
Aglütinasyonun Kolaylaştırılması 1. Eritrositler arası uzaklığı kısaltma 2. Proteolitik enzimler (papain, bromelin, ficin, neuroaminidase, trypsin vs) Albümin: Muhtemelen eritrosit yüzeyindeki negatif yükü nötralize etmekte Polikatyonlar (polybrene, protamine): Ortamın katyon yoğunluğunu artırarak eritrosit yüzeyindeki negatif yükü nötralize ederler LISS (Low Ionic Strength Solution): Ortamdaki iyon sayısını azaltır Santrifüj: Santrifüj gücü ile eritrositler birbirine yaklaşır İki eritrosit arasında köprü oluşturma: Coombs serumu 45
ANTİGLOBULİN TESTLER 46
Doğal ve İmmün Eritrosit Antikorlarının Özellikleri Doğal Antikorlar İmmün Antikorlar Eritrositlerin karbonhidrat antijenlerine yönelik Eritrositlerin protein antijenlerine yönelik Komplet İnkomplet Soğuk Sıcak Genellikle IgM Genellikle IgG Plasentadan geçmez Plasentadan geçer Komplet ve İnkomplet Antikorlar İzotonik tuzlu su ortamında eritrositleri kümeleştirebilen antikorlara komplet, kümeleştiremeyenlere inkomplet adı verilir. 47
48
Antiglobulin Testler Direkt Antiglobulin Test (DAT, Direkt Coombs Testi): Otoimmun hemolitik anemi, ilaca bağlı hemoliz, yenidoğanın hemolitik hastalığı ve yakın zamanda yapılmış kan transfüzyonuna bağlı alloimmünizasyon araştırılır İndirekt Antiglobulin Test (İAT, İndirekt Coombs Testi): Antikor tarama ve tanımlama, kan gruplama ve uygunluk testlerinde kullanılır 49
DAT POZİTİFLİK Eritrosit antijenlerine karşı oluşmuş otoantikorların komplemanla birlikte veya tek başına eritrosit yüzeyini kaplaması Transfüzyon sonrası alıcı antikorların donör eritrosit yüzeyini kaplaması Verici plazmasındaki antikorların alıcı eritrositlerin yüzeyini kaplaması
DAT 51
DAT 52
DAT Hasta eritrositlerinden SF içerisinde %2-5 lik eritrosit süspansiyonu hazırlanır. Bu süspansiyondan bir damla test tüpüne konur. SF ile eritrositler 4 kez yıkanır. Üstteki süpernatan tamamen döküldükten sonra 1-2 damla polispesifik AHG reageni ilave edilir 53
DAT 1000 x g de 1 dak. santrifüj edilir. Santrifüj sonrası aglütinasyon değerlendirilir ve sonuçlar kaydedilir 54
DAT 55
İAT 56
İAT 57
Bir tüpe 2-3 damla hasta serumu konur. Üzerine bir damla %2-5 lik test eritrosit süspansiyonu ilave edilir. Ortalama 30-60 dk. Benmaride inkübe edilir İnkübasyon sonrası 1000 x g de 1 dak. santrifüj edilir Santrifüj sonrası tüpler hemoliz yönünden kontrol edilir. Daha sonra dibe çöken eritrositler resüspanse edilir, aglütinasyon olup olmadığı değerlendirilir 58
Aglütinasyon yoksa eritrositler %0.9 SF ile en az 4 kez yıkanır. Böylece eritrositlere bağlanmamış antikorlar ve serumda bulunan diğer proteinler uzaklaştırılmış olur. Yıkanmış eritrositlerin üzerine 2 damla AHG reageni eklenir 59
1000 x g de 1 dak. santrifüj edilir ve aglütinasyon değerlendirilir. Negatif AHG testini konfirme etmek için IgG kaplı kontrol eritrositlerinden 1 damla tüplere ilave edilir. 1000 x g de 1 dak. santrifüj edilir. Santrifüj sonrası aglütinasyon değerlendirilir, en az 2+ aglütinasyon görülmelidir 60
Jel Yöntemi ile İAT 61
Jel Yöntemi ile İAT 62
Enzim 63
Enzim 64
Antikor Tarama - Tanımlama Antikor Tarama Testi Eritrosit antijenlerine karşı antikor olup olmadığını saptamak için yapılır Antikor Tanımlama Testi Varolan antikorun hangi kan grup sistemi ile ilişkili olduğunu ve hangi eritrosit antijenine karşı geliştiğini saptamak için yapılır
Antikor Tarama Klinik önemi olan antikorlar mutlaka araştırılmalı Klinik önem Antikorun 37oC de reaktif olması Hemoliz yapması Eritrosit yaşam süresini azaltması
Hücreler Fenotipik yapısı (tercihan homozigot) 2 veya 3 farklı donörden alınmış test hücreleri tarama, daha fazla sayıda test hücreleri ise tanımlama testlerinde kullanılmalı
IAT 1 2 3 1 damla hücre + 2 damla hasta serumu
ANTİKOR TARAMA (IAT-ET) I ++++ II III +++ ++ I II + - III - Test Hücrelerinin Hazırlanması ( I, II, III ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir I II III I II Dağıtım III 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma Test Hücrelerinin Hazırlanması ( IP, IIP, IIIP ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir İnkübasyon 37 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.
ANTİKOR TARAMA - CA I ++++ * III I +++ ++ + II III - - * I Test Hücrelerinin Hazırlanması ( I, II, III ) II Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir II III I II Dağıtım III 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 4 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika * Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin Kartı Kullanılır Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.
Test Hücreleri
Tüpte Antikor Tanımlama 1 2 3 4 5 6 7 1 damla hücre + 2 damla hasta serumu 8 9 10 11
ANTİKOR TANIMLAMA - IAT 1 ++++ 2 +++ 3 4 ++ 5 - + 7 6 - ++++ 8 +++ 9 ++ 10 + 11 - Test Hücrelerinin Hazırlanması ( 11 li Normal Panel Hücresi ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir Dağıtım 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 37 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.
ANTİKOR TANIMLAMA ET 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Adı Soyadı Tarih ++++ +++ ++ - + - ++++ +++ ++ + - Test Hücrelerinin Hazırlanması ( 11 li Enzimli Panel Hücresi ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 6 Dağıtım 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 37 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.
ANTİKOR TANIMLAMA CA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Adı Soyadı Tarih ++++ +++ ++ - + - ++++ +++ ++ - + * * Test Hücrelerinin Hazırlanması ( 11 li Normal Panel Hücresi ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir 1 2 3 4 5 7 8 9 10 11 6 Dağıtım 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 4 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika * Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin Kartı Kullanılır Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.
Değerlendirme
Antikor Tanımlama Anti-E