T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ

Transkript

1 T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TEK HÜCREDE REAL TIME PCR İLE BETA TALASEMİ MUTASYONLARININ TANIMLANMASI Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı Genetik Doktora Programı Doktora Tezi Dr. Burak DURMAZ DANIŞMAN Prof. Dr. Ferda ÖZKINAY İZMİR 2009

2

3 T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TEK HÜCREDE REAL TIME PCR İLE BETA TALASEMİ MUTASYONLARININ TANIMLANMASI Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı Genetik Doktora Programı Doktora Tezi Dr. Burak DURMAZ DANIŞMAN Prof. Dr. Ferda ÖZKINAY İZMİR 2009

4

5 DEĞERLENDİRME KURULU ÜYELERİ (Adı Soyadı) (İmza) Başkan : Prof.Dr. Ferda ÖZKINAY... (Danışman) Üye : Prof.Dr. Erol TAVMERGEN... Üye : Doç. Dr. Özgür ÇOĞULU... Üye : Prof. Dr. Sevgi MİR... Üye : Yrd. Doç. Dr. Elçin BORA... Doktora Tezinin kabul edildiği tarih:...

6

7 ÖNSÖZ Doktora eğitimimin her aşamasında desteğini hissettiğim, çalışma azmini her zaman örnek aldığım, tezim boyunca hep yanımda olan, bana olan inancı ve güveni için tez danışmanım Prof. Dr. Ferda ÖZKINAY a, Eğitimimdeki katkıları için, başarı ve sonuca ulaşmada örnek aldığım ve desteğini hiçbir zaman esirgemeyen Sayın Prof. Dr. Cihangir ÖZKINAY a, Doktora eğitimim boyunca, desteğini ve yardımlarını her zaman hissettiğim Sayın Prof. Dr. Sevgi MİR e Çalışmalarım ve doktora eğitimim boyunca sürekli iletişimde olduğumuz, her konuda desteklerinden dolayı Sayın Prof. Dr. Erol TAVMERGEN ve Sayın Prof. Dr. Ege TAVMERGEN GÖKER e, Tez çalışmalarım süresince, yardım ve desteklerini gördüğüm Sayın Prof. Dr. Yeşim AYDINOK a, Araştırma şevki ve bilimsel azmi ile beni motive eden, her çalışmada aynı heyecanı duyabilmemi sağlayan Sayın Doç. Dr. Özgür ÇOĞULU ya, Doktora eğitimim süresince her soruma ve sorunuma soğukkanlılığıyla uygun çözümler bulan Sayın Doç. Dr. Cumhur GÜNDÜZ e, Doktora eğitimime katkıları olan Doç. Dr. Sacide PEHLİVAN a, Eğitimim boyunca bana doğru yolu gösteren, bilgisini sonuna kadar bizlerle paylaşan Sayın Yrd. Doç. Dr. Haluk AKIN a, Doktora eğitimim boyunca ve tezimin moleküler analizleri sırasında desteğini ve dostluğunu her zaman gördüğüm Sayın Yrd. Doç. Dr. Hüseyin ONAY a, I

8 Her konuda destek ve yardımlarını gördüğüm çok sevgili dostlarım, doktora ve doktor arkadaşlarım, Sayın Yrd. Doç. Dr. Elçin BORA, Sayın Uz. Dr. Tufan ÇANKAYA, Uz. Dr. Emin KARACA, Uz. Dr. Aslıhan EKMEKÇİ, Dr. Ali VAHABİ, Dr. Filiz HAZAN, Dr. Ayça AYKUT, Dr. Erhan PARILTAY, Dr. Özgür KIRBIYIK, Dr. Mehmet AKGÜL, Dr. Esra ATAMAN, Dr. Taha ÖZDEMİR, Dr. Esra ARSLAN ve Dr. Merve SAKA GÜVENÇ e, Tezimin moleküler çalışmalarına çok yardımları olan ve deneyimlerini benimle paylaşan Sayın Dr. Joanne Traeger SYNODINOS ve ekibine, Doktora eğitimim süresince uyumlu bir çalışma ortamının oluşmasını sağlayan Tıbbi Genetik Anabilim Dalı biyolog, teknisyen, sekreter ve diğer çalışanlarına, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Anabilim Dalı öğretim üyeleri ve diğer çalışanlarına, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Aile Planlaması ve Kısırlık Araştırma Merkezi çalışanlarına, Sağlık Bilimleri Ensititüsü nde her türlü destekleri ve yardımları için başta Sayın Melike ÖRK ve Handan ESEN GÖKTEPE olmak üzere tüm çalışanlarına, Maddi desteklerinden dolayı Ege Üniversitesi Araştırma Projeleri Komisyonu na, Doktora eğitimimde olduğu kadar tüm hayatım boyunca desteklerini ve sevgilerini hep hissettiğim, mutluluğumun en büyük kaynağı olan canım aileme ve beni her koşulda kabullenen, her sorunumda ve mutluluğumda yanımda olan en büyük desteğim biricik eşim Asude ye sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Siz olmasaydınız bu tez de olamazdı. İzmir, 2009 M. Burak DURMAZ II

9 İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER III ŞEKİLLER DİZİNİ VIII TABLOLAR DİZİNİ XI KISALTMALAR DİZİNİ XIV BÖLÜM I-GİRİŞ 1 1. Giriş ve Amaç Araştırmanın Konusu Araştırmanın Amacı Araştırmanın Önemi 3 2. Genel Bilgiler Anormal hemoglobinler ve Talasemi Sendromları Hemoglobin Yapısı ve Fonksiyonu Hemoglobinopatiler Varyant Hemoglobinler Orak hücreli anemi (Hemoglobin S) Hemoglobin C Hemoglobin E Talasemi Sendromları 10 III

10 2.2. Beta Talasemi ve Klinik Önemi Beta Talasemi Patofizyolojisi β Talasemi Klinik Fenotipleri Beta Talasemide Genotip-Fenotip İlişkisi Beta Globin Geni Beta Talasemide Klinik Farklılıkların Altındaki Mekanizmalar Primer Modifiye Edici Faktörler (Beta talasemi alleleri) Sekonder Modifiye Edici Faktörler Tersiyer Modifiye Edici Faktörler Beta Talasemi Mutasyonlarının Epidemiyolojisi Beta talasemide Moleküler Tanı Moleküler Tanıda Kullanılan Yöntemler Beta Globin Strip Assay DNA Dizi Analizi Real-time PCR Beta Talasemide Prenatal Tanı Preimplantasyon Genetik Tanı Preimplantasyon Genetik Tanı Uygulamaları Preimplantasyon Genetik Tanıda (Tek Hücre PCR ında) IV

11 Karşılaşılan Sorunlar DNA nın stabilitesi ve PCR amplifikasyonu Kontaminasyon Allel dropout (ADO) Preimplantasyon Genetik Tanıda (Tek Hücre PCR ında) Kullanılan Multipleks PCR ve Mikrosatellit Tekrar Dizileri Preimplantasyon Genetik Tanıda (Tek Hücre PCR ında) Kullanılan Bağlantı (Linkaj Analizi) 37 BÖLÜM II-GEREÇ VE YÖNTEM Olguların seçimi Çalışmada Kullanılan Kimyasal Malzeme, Tamponlar ve Aletler Periferik Kandan DNA İzolasyonu Periferik Kandan Tek Hücre (lenfosit) Ayrıştırması ve DNA İzolasyonu Nested, Real-time PCR Mikrosatellit Markır Analizi Heterozigotluk Araştırması İçin Mikrosatellit Markır Analizi Tek Hücre Çalışmasında Kullanılan Mikrosatellit Markır Analizi Heterozigotluk Araştırması Amaçlı Mikrosatellit Markır Analizi Çalışma Protokolü Periferik Kandan DNA İzolasyonu Mikrosatellit Markır Analizi İçin PCR İşlemi 44 V

12 Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçlarının Görüntülenmesi Allel Frekansı ve Heterozigotluk Oranının Hesaplanması Periferik Kandan Tek Hücre (Lenfosit) Ayrıştırması ve DNA İzolasyonu Çalışma Protokolü Periferik Kandan Tek Hücre (Lenfosit) Ayrıştırması Tek Hücrede (Lenfosit) PCR işlemi Nested, Real-time PCR Tek Hücre Çalışmasında Kullanılan Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçlarının Görüntülenmesi Tek Hücre Analizinde Uygulanan Tüm İşlem Basamaklarının Özeti 62 BÖLÜM III-BULGULAR Heterozigotluk Araştırması Amacıyla Yapılan Mikrosatellit Markır Analizi Bulguları Çalışma Grubunun Genel Özelliklerinin Karşılaştırılması Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçları Mikrosatellit Markır Analizi İstatistik Sonuçları Periferik Kandan Tek Hücre (Lenfosit) Ayrıştırması, DNA İzolasyonu ve Tek Hücre PCR Sonuçları Çalışma Grubunun Genel Özelliklerinin Karşılaştırılması Tek hücre PCR ve Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçları Tek hücre PCR ve Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçlarının Değerlendirilmesi 89 VI

13 BÖLÜM IV- TARTIŞMA 90 BÖLÜM V-SONUÇLAR VE ÖNERİLER 105 BÖLÜM VI- ÖZET-ABSTRACT 106 BÖLÜM VII- YARARLANILAN KAYNAKLAR 108 EKLER 126 ÖZGEÇMİŞ 130 VII

14 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1. Hemoglobin zincirlerinin yapısında bulunan globin zincirleri ve bunları kodlayan gen bölgeleri 6 Şekil 2. Hemoglobin zincirlerinin prenatal ve postnatal dönemdeki sentez yerleri, bu bölgelerde rol alan hücre tipleri ve sentez yüzdeleri 7 Şekil 3. Beta globin gen bölgesi, beta globin yapısı ve mutasyon yerlerine ve sınıflamasına göre genotip-fenotip ilişkisi 15 Şekil 4. Dünyada 1000 canlı doğumda gözlenen major hemoglobinopati sıklıklarının dağılımı 21 Şekil 5. Türkiye de beta talasemi hasta dağılımı 22 Şekil 6. Taşıyıcı taraması ve mutasyon analizi için MCV, MCH, HbA2 ve HbF düzeylerine göre değerlendirme akış şeması 24 Şekil 7. Light cycler çalışma prensibi 28 Şekil 8. Mononükleer hücre elde etmek için kullanılan yöntemin şematik görünümü 50 Şekil 9. Beta globin (HBB) geni şematik görünümü 52 Şekil 10. Light Cycler da kullanılan hibridizasyon probları, kapsadıkları örnek mutasyonlar 58 Şekil 11. Tek hücre analizinde uygulanan tüm işlem basamaklarının özeti 62 VIII

15 Şekil 12. Mikrosatellit markırların heterozigotluk çalışması amacıyla seçilen 100 olgunun doğum yerleri 64 Şekil 13. Bir olguya ait mikrosatellit markır analizi sonucu 65 Şekil 14. Olgu 1 için D prob seti kullanılarak elde edilen anne, baba ve tek lenfosite ait LC erime eğrisi analizi 68 Şekil 15. Sırasıyla tek lenfositlerden birine ait, anne ve babanın mikrosatellit markır analizi sonuç görüntüsü 69 Şekil 16. Olgu 2 için E prob seti kullanılarak IVSI-110 için yapılan LC erime eğrisi analizi 70 Şekil 17. Olgu 2 için F prob seti kullanılarak CD39 için yapılan LC erime eğrisi analizi 71 Şekil 18. Olgu 3 için C prob seti kullanılarak HbS için yapılan LC erime eğrisi analizi 73 Şekil 19. Olgu 4 için F prob seti kullanılarak CD39 için yapılan LC erime eğrisi analizi 75 Şekil 20. Olgu 5 için E prob seti kullanılarak IVSI-110 için yapılan LC erime eğrisi analizi 77 Şekil 21. Olgu 6 için E prob seti kullanılarak IVSI-110 için yapılan LC erime eğrisi analizi 79 IX

16 Şekil 22. Olgu 7 için D prob seti kullanılarak IVSI-6 için yapılan LC erime eğrisi analizi 81 Şekil 23. Olgu 8 için B prob seti kullanılarak CD8 için yapılan LC erime eğrisi analizi 83 Şekil 24. Olgu 9 için E prob seti kullanılarak IVSI-110 için yapılan LC erime eğrisi analizi 85 Şekil 25. Olgu 9 için A prob seti kullanılarak IVSII-745 için yapılan LC erime eğrisi analizi 86 Şekil 26. Olgu 10 için G prob seti kullanılarak IVSII-1 için yapılan LC erime eğrisi analizi 87 X

17 TABLOLAR DİZİNİ Tablo 1. Beta talasemide genotipik ve fenotipik özellikler 14 Tablo 2. Hafif ve sessiz HBB geni mutasyonları 17 Tablo 3. Türkiye de ve dünyada beta talasemi mutasyon görülme sıklıkları (%) 23 Tablo 4. Mikrosatellit markır analizinde kullanılan markırların primer dizileri, PCR ürün büyüklükleri ve tekrar dizileri 45 Tablo 5. PCR işleminde kullanılan malzemeler ve miktarları 46 Tablo 6. Heterozigotluk araştırması amaçlı mikrosatellit markır analizinde kullanılan PCR basamakları 47 Tablo 7. Lizis PCR basamakları 51 Tablo 8. HBB geninin belirli bölgesini çoğaltmak için kullanılan primerlerin dizileri, PCR ürün büyüklükleri 53 Tablo 9. Tek hücre PCR işleminde kullanılan malzemeler ve Miktarları 53 Tablo 10. Tek hücre PCR işlemi PCR basamakları 54 Tablo 11. Nested PCR miksi hazırlanırken kullanılan malzemeler ve miktarları 56 Tablo 12. Nested PCR da kullanılan primerlerin dizileri, PCR ürün büyüklüğü 56 XI

18 Tablo 13. Light Cycler da kullanılan problar, tarayabildikleri örnek mutasyonlar, prob dizileri, erime ısıları (Tm) ve mutasyon saptamada kullandıkları diziler 57 Tablo 14. LC cihazında kullanılan nested PCR ve mutasyon saptama program koşulları 60 Tablo 15. D11S4891, D13S314, GABRB, D11S2362 mikrosatellit markırları için saptanan alleller, boyutları(s), allel sayıları(n) ve allel frekansları (f) 65 Tablo 16. D11S4891, D13S314, GABRB3, D11S2362 mikrosatellit markırları için saptanan allel sayısı, beklenen ve gözlenen heterozigotluk oranları 66 Tablo 17. Toplam 10 çocuğa ait yaş, mutasyon, ebeveyn mutasyon ve ebeveynlerin akrabalık durumları bilgileri 67 Tablo 18. Olgu 1, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 69 Tablo 19. Olgu 2, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 72 Tablo 20. Olgu 3, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 74 Tablo 21. Olgu 4, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 76 XII

19 Tablo 22. Olgu 5, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 78 Tablo 23. Olgu 6, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 80 Tablo 24. Olgu 7, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 82 Tablo 25. Olgu 8, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 84 Tablo 26. Olgu 9, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları 86 Tablo 27. Olgu 10, hasta çocuk, anne ve babasına ait mikrosatellit 88 markır analizi sonuçları XIII

20 KISALTMALAR DİZİNİ PGT: Preimplantasyon Genetik Tanı IVF: In Vitro Fertilizasyon PCR: Polimeraz zincir reaksiyonu DNA: Deoksiribonükleik asit HLA: İnsan lökosit antijeni Hb: Hemoglobin ALA: δ-aminolevulinik asit MCV: Mean corpuscular volume LCR: Lokus kontrol bölgesi HBB: Hemoglobin beta (Beta globin geni) UTR: Untranslated region UGT1: UDP-glukuronosiltransferaz MCH: Mean corpuscular hemoglobin dntp: Deoksinükleotid tri-fosfat ddntp: Dideoksinükleotid tri-fosfat RT-PCR: Revers transkriptaz-pcr MCHC: Mean corpuscular hemoglobin concentration ARMS: Amplification refractory mutation system XIV

21 DGGE: Denaturing gradient gel electrophoresis SSCP: Single strand conformational polymorphism LC: LightCycler FRET: Flouresance Resonance Energy Transfer CVS: Koryon Villus Örneklemesi ICSI: İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu FISH: Flouresance in situ hybridization ADO: Allel dropout STR: Short tandem repeats XV

22 BÖLÜM I GİRİŞ 1. GİRİŞ ve AMAÇ 1.1. Araştırmanın konusu Ülkemiz açısından büyük bir sağlık sorunu olan beta talasemi hastalığını Türkiye de yaklaşık 1,5 milyon kişinin taşıdığı bilinmektedir. Taşıyıcı ve hasta bireylerin hasta çocuğa sahip olmamaları için uygulanabilen birçok yöntem bulunmaktadır. Genetik bilimindeki hızlı ilerlemeler sayesinde artık birçok kalıtsal hastalığın, embriyo döneminde tanısı konulabilmektedir. Sadece sağlıklı embriyoların seçilerek anneye transfer edildiği bu yönteme Preimplantasyon Genetik Tanı (PGT) adı verilmektedir. Bu teknik, genetik hastalıklı çocuk dünyaya getirme riski bulunan ve doğal yolla gebeliğin ilerleyen dönemlerinde invaziv prenatal tanı yöntemleriyle hastalıklı bir fetus nedeniyle gebeliği sonlandırma durumunda kalmak istemeyen çiftler ve gebeliğin sonlandılmasını dini, etik veya psikolojik nedenlerle istemeyen aileler için yeni bir alternatif haline gelmiştir. Bu amaçla, çiftler öncelikle tüp bebek tedavisi programına alınır. Anneden alınan yumurta hücreleri ile babadan alınan sperm hücreleri laboratuvar ortamında döllenir (IVF=In Vitro Fertilizasyon). Döllenmeyi takiben normal gelişim gösteren embriyolar 3. günde 7 8 hücreli aşamaya ulaştığında, 1 ya da 2 blastomer hücresi, her bir embriyodan biyopsi yapılarak alınır ve genetik analiz ile hastalığın embriyoda olup olmadığı belirlenebilir. Embriyo biyopsi yapılarak alınan blastomer, içerisinde eritme solüsyonu bulunan PCR tüplerine aktarılır. Bu yolla serbest kalan DNA daki hastalığın bulunduğu bölge özel dizayn edilmiş primerler kullanılarak tek hücre PCR ı

23 dediğimiz bir dizi enzimatik reaksiyon ile milyonlarca kopya halinde çoğaltılır. Bu işlemi takiben mutasyon analiziyle sağlıklı veya hastalıklı embriyolar ayırt edilebilir. DNA izolasyonu ve PCR tek hücre çalışmasının en önemli ve en hassas aşamalarıdır. Bu analizler sırasında tüm diğer laboratuvar işlemlerinden arındırılmış ayrı bir oda ve sadece bu işlemler için ayrılmış cihaz ve ekipmanların kullanılması büyük önem taşımaktadır. PGT ve diğer tek hücre PCR ında en önemli zorluk, tek hücre ile çalışma için yüksek beceri ve teknoloji gerektirmesidir. Yaklaşık 5 pg kadar çok az DNA içeren tek bir hücreden multipleks PCR yapmak ve mutasyonları tespit etmek zordur. Bunun için teknik, rutin uygulamaya geçmek için standardize edilmeden önce genomik DNA, dilüe edilmiş genomik DNA ve tek lenfositlerle çalışmak uygun olacaktır. Bu aşamada, anne ve baba mutasyonlarının bilinmesi, tek hücre kaynağından (lenfosit veya blastomer) elde edilen sonuçlarla karşılaştırılması bakımından çok önemlidir Araştırmanın Amacı Bu çalışma ile rutin tanısal PGT çalışmalarına temel oluşturmak üzere beta talasemi mutasyonu önceden bilinen bireylerden elde edilecek lenfositlerden tek hücrede multipleks PCR işlemi yapılarak real time PCR - Light Cycler ile mutasyon analizinin uygulanabilirliğinin test edilmesi amaçlanmıştır. Ayrıca testin güvenilirliğini arttırmak, olası kontaminasyonu görüntülemek ve allel dropout gibi istenmeyen durumları yakalamak amacıyla gen içi ve gen dışı toplam 4 adet mikrosatellit markırın kullanılması planlanmıştır. Bu markırları tek hücre PCR ında kullanmadan önce Türk populasyonundan oluşan 100 bireyde çalışılması ve heterozigotluk oranlarının hesaplanması ve bu konuda literatüre 2

24 katkıda bulunulması amaçlanmıştır. Bu çalışmanın sonuçlarına göre, tek lenfosit PCR işlemininde standardizasyon sağlandıktan sonra ileride planlanabilecek olan embriyonun genetik yapısının transfer öncesi belirlenebilmesi ve diğer tüm tek hücre çalışmalarına ışık tutması hedeflenmiştir Araştırmanın Önemi Türkiye de beta talasemi, kalıtsal hastalıklar içerisinde en sık gözlenen ve ülkemiz açısından taşıyıcılık oranı yüksek olan bir hastalıktır. Otozomal resesif bir kalıtım gösterdiği için akraba evliliklerin %25 düzeylerinde olduğu ülkemizde bu hastalığın önemi daha da artmaktadır. Talasemi taşıyıcısı olan çiftler, fetusun hasta olma riski açısından amniyosentez veya koryon villus biyopsisi gibi prenatal tanı yöntemlerine başvurabilmektedir. Bu uygulamalar, oluşmuş bir gebeliğin 3. veya 4. ayında yapılmakta ve sonuçlar ileri gebelik haftalarında elde edilmektedir. Etkilenmiş bir bebeğin tanımlanması, gebeliği sonlandırma ile sonuçlanabilmekte, bu durum ailede fiziksel ve psikolojik travmalara yol açmaktadır. PGT henüz gebelik oluşmadan, implantasyon öncesi embriyolarda genetik hastalıkların tanımlanmasını sağlayan bir yöntem olduğundan dolayı dünyada ve ülkemizde dikkat çekmektedir. Özellikle gelişmiş ülkelerde bu yöne doğru bir eğilim mevcuttur ve 100 den fazla tek gen hastalığı için PGT uygulanabilmektedir. Konunun bilimsel alandaki popülerliği de gün geçtikçe artmaktadır. Talasemi hastalığı saptanmış çocuklara sahip ailelerde, PGT ile talasemi tanısı yanında fetusta HLA (human leukocyte antigen) doku tiplerinin belirlenmesiyle doku tipi hasta çocuk ile uygun olanlar seçilebilmekte ve hasta çocuğa tedavi olanağı doğabilmektedir. PGT yöntemiyle aile, prenatal tanı işlemi sonrasında uygulanan gebelik sonlandırılmasına bağlı tıbbi ve psikolojik 3

25 travmalardan korunacaktır. Ayrıca gebelik öncesi tanı, hasta kişilerin yaşam boyu karşılaştıkları sağlık problemleri, hastalıkların tedavisindeki güçlükler ve yüksek tedavi maliyetleri nedeniyle ailelerin sağlıklı çocuk sahibi olmalarını sağlaması ve hasta kişiler için tedavi olanağı sunması yönleriyle önemlidir. Ülkemizde, özellikle üniversitelerde PGT ve tek hücre PCR çalışmaları oldukça kısıtlıdır. Light cycler cihazını kullanarak tek hücrede real time PCR ile tanı çalışmaları ülkemizde bulunmamaktadır. Bu çalışma, tek hücre PCR işlemi için multipleks ve daha sonra nested PCR işlemlerinin uygulanabilirliğinin test edilmesi bakımından önemlidir. Ayrıca bu çalışmada, Türk populasyonu açısından anlamlılık oranı yüksek mikrosatellit markırların saptanması da planlanmıştır. Bunlardan 2 tanesi beta talasemi geni ile bağlı, 2 tanesi gen dışı bölgeden (beta talasemi geni ile bağlı olmayan) seçildi. Kullanılacak olan markırlar ile ilgili Türk popülasyonunda yapılmış olan herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışma ile seçilen markırların Türk popülsyonundaki heterozigotluk oranları hakkında bilgi sahibi olunacak ve ileride yapılacak olan talasemi ve bu çalışma dışı çalışmalarda bu markırların kullanılabilirliği açısından bir kaynak teşkil edecektir. Bu çalışmayla birlikte beta talasemi hastalığıyla bir adım atılmış olacak, tek hücre izolasyonu ve PCR işlemlerinin test edilebilirliği saptandıktan sonra diğer tek gen hastalıklarının da çalışılabilmesi ve blastomer düzeyinde ileri çalışmaların uygulanabilmesi mümkün olacaktır. 4

26 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Anormal Hemoglobinler ve Talasemi Sendromları Hemoglobin Yapısı ve Fonksiyonu Hemoglobin (Hb), eritrositlerde bulunan temel oksijen taşıyıcı moleküldür. Arteriyel dolaşımda hemoglobin, oksijen için yüksek affinite gösterirken karbondioksit, organik fosfatlar, hidrojen ve klorid iyonları için düşük afinite gösterir. Venöz dolaşımda ise tam tersi bir afinite göstermektedir (2). Hemoglobinin iki komponenti bulunmaktadır; protein zinciri (globin) ve hem molekülü. Polipeptit tetramer yapısında bulunur ve 2 çift globin zincirinden oluşur (2). Her bir globin zinciri ise bir polipeptid zincir ve bir hem grubu taşıyan 4 subunitten oluşmuştur. Yetişkin hemoglobinin polipeptid zincirleri uzunluk olarak aynı fakat aminoasit dizileri bakımından ayrı alfa ve beta olmak üzere iki çeşittir. Tüm hemoglobinlerin embriyonik ve yetişkin dönemde alfa zincirleri aynıdır. Alfa dışı zincirler normal erişkin hemoglobinin beta zinciri, fetal hemoglobinin gamma zinciri ve HbA 2 nin delta zinciri olarak adlandırılır. Hemoglobinin yapısı embriyonel gelişim sürecinde değişikliğe uğramaktadır (3, 4). Hemoglobin çeşitleri olarak HbA (α 2 β 2 ), HbA 2 (α 2 δ 2 ), HbF (α 2 γ 2 ), Hb Portland (ζ 2 γ 2 ), Hb Gower 1 ( ζ 2 ε 2 ), Hb Gower 2 (α 2 ε 2 ) sayılabilir (Şekil 1). 5

27 Kromozom 16 Kromozom 11 ζ α α ε γ γ δ β ζ 2 ε 2 α 2 γ 2 α 2 β 2 α 2 δ 2 Hb Gower 1 HbF HbA HbA 2 Embriyonik Fetal Yetişkin Şekil 1. Hemoglobin zincirlerinin yapısında bulunan globin zincirleri ve bunları kodlayan gen bölgeleri (5) Sağlıklı bir bireyde yaklaşık %95 oranında HbA, %3-4 oranında HbA 2 ve %1-2 oranında HbF bulunmaktadır. Embriyonik ve fetal dönemlerde ise Hb Portland ve Hb Gower bulunmaktadır (2) İntrauterin dönemde ilk olarak 8. haftaya kadar Hb Gower-1 (ζ 2 ε 2 ), Gower-2 (α 2 ε 2 ) ve Portland (ζ 2 γ 2 ) görülür, daha sonra 9. haftadan itibaren HbF (α 2 γ 2 ) tüm fetal dönemde temel hemoglobin olarak bulunur. Doğumdan hemen önce gama zincir üretimi kaybolmaya başlar ve 6-9 aydan sonra %2 nin altında bulunur (6). Yetişkin dönemdeki temel hemoglobin olan HbA (α 2 β 2 ) gestasyonel dönemde 1. aydan itibaren görülmeye başlar ve doğumda %30, 10. haftada %50, ve haftalarda yetişkin düzeyi olan %95 seviyelerine ulaşır. Yetişkin dönemde görülen diğer bir hemoglobin olan HbA 2 (α 2 δ 2 ) ise doğumdan sonra görülmeye başlar ve tüm yetişkinlik döneminde %1,5 3,5 seviyelerinde bulunur (Şekil 2). 6

28 Hücre tipi Megaloblast Makrosit Normosit Eritropoezin yeri Karaciğer Kemik iliği Yolk sac Dalak Toplam globin sentez yüzdesi Prenatal dönem (hafta) Doğum Postnatal dönem (hafta) Şekil 2. Hemoglobin zincirlerinin prenatal ve postnatal dönemdeki sentez yerleri, bu bölgelerde rol alan hücre tipleri ve sentez yüzdeleri (7) Hem, Fe +2 atomu içeren protoporfirin yapısında bir moleküldür. Mitokondride süksinil CoA ve glisinden ilk olarak ALA sentetaz aracılığı ile δ- aminolevulinik asit (ALA) oluşur. Porfobilinojen halindeyken sitoplazmaya geçer ve koproporfirinojen halinde mitokondride sentez devam eder ve burada tamamlanır (8). Oksijen her bir hem grubundaki ferröz atomuna geri dönüşümlü olarak bağlanır. Parsiyel oksijen basıncı 100 mmhg olduğunda kırmızı hücrelerdeki hemoglobin oksijen ile tamamen doymuş durumdadır (1) Hemoglobinopatiler Hemoglobinopatiler, hemoglobinin protein komponenti olan globin zincirinde anormal yapıya veya zincir sentezinde bozukluğa neden olan kalıtsal hastalık grubuna verilen isimdir. Tüm dünyada gözlenen en sık genetik bozukluktur (9). Hemoglobinin tetramer yapısındaki kalıtsal anomaliler, globin 7

29 zincirindeki yapısal anomaliler (varyant hemoglobinler) ve hemoglobin molekülünün polipeptid zincirlerinden bir veya birden fazlasının sentezini azaltan veya tamamen yok eden moleküler defektler (talasemiler) şeklinde ikiye ayrılır (5) Varyant hemoglobinler Orak hücreli anemi (Hemoglobin S) Tüm dünyada gözlenen en sık hemoglobin kalitatif değişikliğidir. Afrika nın bazı bölgelerinde toplumun %10-40 ı taşıyıcı olarak bilinmektedir. Malaryanın endemik olduğu bölgelerde malaryaya karşı koruyucu olduğundan daha sık gözlenir. Hemoglobin S, beta globin geninde 6. pozisyonda glutamik asidin yerine valin geçmesi ile oluşur (10). Deoksijene hemoglobin S uzun katı yapılar şeklinde polimerize olup hücreye orak benzeri görünüm verir. Hemoglobinin deoksijene olmasına yol açan hipoksi, asidoz ve artmış ısıda oraklaşma artar. HbS polimerizasyonu geri dönüşümlüdür; reoksijenizasyon gerçekleştiğinde oraklaşmış hücreler normal şekline döner. Heterozigot HbS olan bireyler genellikle asemptomatiktir. Aşırı hipoksik, asidik ve hiperozmolar çevreye bağlı renal medulla harabiyeti ile mikroskobik hematüri, splenik infarktlar ve ani ölüm görülebilir. Homozigot HbS olan bireylerde hastalığın kliniği aynı aile içinde içinde bile değişiklik göstermektedir. Genellikle 3-4 aylık iken bulgu verirler, o döneme kadar yüksek HbF seviyeleri koruyucu olmaktadır. Yüksek HbF seviyeleri hastalık kliniğini hafiflettiğinden bazı bireylerde yetişkin döneme kadar bulgu vermeyebilir. Ağrılı akut vazookluziv krizler, 3-4 yaşlarında ortaya çıkan sekestrasyon krizleri ve aplastik krizler temel bulgulardır. Enfeksiyonlar, 8

30 serebrovasküler komplikasyonlar, priapizm, safra kesesi taşları, retinopati gibi komplikasyonlar da görülebilir (10). Başka bir beta globin mutasyonu ile birlikte bileşik heterozigot olan bireyler genellikle semptomatiktir ve homozigot orak hücreli anemi bulguları verirler. HbS ve HbC ile bileşik heterozigot olan bireyler homozigot HbS olan bireylere göre daha hafif klinik bulgu verirler ve retinopatiye eğilim gösterirler; uzun kemik infarktları ve gebelik dönemi komplikasyonlar sıktır. Hafif splenomegali, enfeksiyonlara yatkınlık, hafif anemi görülmektedir. HbS/β + olan bireylerde az da olsa β globin zincir üretimi olduğundan daha hafif klinik gözlenirken HbS/β 0 olan bireylerde hiç β globin zincir üretimi olmadığından homozigot HbS benzeri bulgular gözlenmektedir. Beraberinde α talasemi olması hücre içi HbS seviyelerini azalttığından kliniği hafifletir. HbS ile etkileşime giren HbF düzyeni artıran nedenler (herediter persistan HbF ve bazı ilaçlar) de kliniği hafifletir (11) Hemoglobin C HbC tüm dünyada en sık görülen üçüncü hemoglobin kalitatif değişikliğidir. En sık Afrika nın batısında olmak üzere bu bölgede %2-3 lük heterozigotluk oranı bulunmaktadır. Hemoglobin C, β globin zincirinde 6. pozisyonda glutamik asit yerine lizin geçmesi ile oluşur. Hemoglobin S gibi deoksijene olduğunda polimerize olur. Heterozigot HbC hastaları klinik olarak bulgu vermez. Homozigot HbC hastaları da asemptomatiktir, hafif mikrtositik anemi dışında bulgu vermezler (12). 9

31 Hemoglobin E Tüm dünyada görülen 2. en sık hemoglobin kalitatif değişikliğidir. En sık güneydoğu Asya da görülmektedir. Hemoglobin E, β globin zincirinde 26. pozisyonda glutamik asit yerine lizin geçmesi ile oluşmaktadır (13). Heterozigot HbE klinik olarak sessizdir. Hafif mikrositoz görülür. Homozigot HbE olan bireylerde belirgin mikrositoz (MCV-mean corpuscular volume: fl), hipokromi görülür. Hemoglobin seviyeleri normal veya hafif azalmıştır. HbE nin klinik önemi β talasemi ile birlikteliğinde ortaya çıkmaktadır. Talasemi major gibi klinik oluşturabildiğinden dolayı önemlidir (14). Selüloz asetat elektorforezde alkalin ph da hemoglobin C ile hareket eder, ayırt etmek için asidik ph da sitrat agar elektroforezinde yürütülmelidir Talasemi Sendromları Talasemi sendromları bir veya daha fazla globin zincirinde yetersiz sentez veya sentez edilememe durumu ile karakterize kalıtsal geniş bir hastalık grubudur. Etkilenmiş globin zincir veya zincirlerine bağlı olarak α, β, γ, δβ, δ ve εγδβ talasemi olarak adlandırılır Beta talasemi ve Klinik Önemi Avrupalı klinisyenler 20. yy başlarında yenidoğan döneminde dalak büyüklüğü ile giden anemi sendromunu tanımlamışlardır (15). Talaseminin ilk klinik tanımlanması ise pediatrist Thomas B. Cooley ve Pearl Lee tarafından yapılmıştır (16). Talasemi terimi ise George Whipple tarafından konmuştur (17, 18). 10

32 Beta Talasemi Patofizyolojisi Beta talasemi, yapısal olarak normal beta globin zincirinde kantitatif azalma meydana geldiği zaman oluşur (19). Beta zincir üretiminin hepsinde defekt varsa β 0 talasemi, parsiyal defekt varsa β + talasemi olarak adlandırılır (20). Beta talasemide normal alfa globin zincir üretimi normal şekilde devam ederek eritroid prekürsörlerde aşırı alfa globin birikimi oluşmaktadır. Normal bireylerde β:α oranı 0,9:1,1 olarak bulunurken beta talaseminin ağır formlarında 0-0,35 oranlarında bulunmaktadır. Üretilemeyen beta zinciri yerine gama zincir sentezi ve HbF üretilmeye çalışılır ancak gama zincirleri ortamdaki tüm alfa zincirlerini bağlamada yetersiz kalır ve alfa zincirleri hücrede çöker. Eritrositlerde hemoglobin alt üniteleri miktarı artarak oksidasyon ile süperoksit ve hidrojen radikalleri gibi serbest oksijen radikalleri, methemoglobinler ve hemikromlar oluşur. Serbest alfa globin zincirleri tetramer yapısı oluşturamadığından kemik iliğinde kırmızı hücre prekürsörlerinde Heinz body olarak adlandırılan inklüzyon cisimleri şeklinde çökerler. Eritroid prekürsörlerin intramedüller yıkımından ve böylece beta talasemilerde gelişen yetersiz eritropoezden sorumludurlar (21). Tüm bu olaylar sonucunda gelişen inefektif eritropoez anemiye, eritropoetinin aşırı üretimine ve kemik iliğinin aşırı genişlemesine yol açar. Eritropoetik kemik iliği aktivitesinin artması sonucu osteopeni, osteoporoz, kemik hipertrofisi, yüz ve kafatası kemiklerinde deformiteler gibi iskelet anomalileri gözlenir. 11

33 β Talasemi Klinik Fenotipleri Beta talasemideki temel sorun, eritrositlerde defektif beta globin zincir sentezi ve alfa globin zincir birikimidir. Biriken zincirler kırmızı hücre prekürsörlerinde çöker ve anormal hücre maturasyonuna ve kemik iliğinde prematür yıkıma yol açar. Beta talaseminin klinik spekturumu globin zincir dengesizliğinin derecesine göre değişiklik göstermektedir (22). En ciddi klinik spekturum, HbA nın komplet yokluğu ile karakterize β 0 talasemi olarak adlandırılır (19). Klinik ve laboratuvar bulguları mutasyona ve beraberindeki alfa talasemi durumuna göre değişiklik göstermektedir. Tüm bulgular Tablo 1 de özetlenmiştir (19, 23, 24). Beta talasemi major, homozigot veya bileşik heterozigot şeklinde her iki beta globin zincirini kodlayan gende defekt sonucu oluşur ve genellikle hayatın ilk dönemlerinde kendini belli eden ciddi anemi ile karakterizedir. Beta globin zincirlerinde defekt, periferik kanda veya kemik iliğinde aşırı alfa globin zincirlerinin çökmesi sonucu oluşan hasarlar klinikten sorumludur. Ciddi anemi normalde gama zincir üretiminin azaldığı 3 6. aylarda kendini belli eder. Aneminin nedeni olarak yetersiz eritropoez, periferik kırmızı kan hücrelerinde hemoliz ve progresif splenomegali belirtilmektedir (19). Progresif splenomegali sonucunda plazma hacminde artış ve total kırmızı kan hücrelerinde azalma meydana gelir. Etkisiz eritropoezin sonucu oluşan kemik iliğinde hipertrofi, iskelet değişikliklerine yol açarken değişken derecelerde hepatosplenomegali de görülmektedir. Üretimi yetersiz olan beta globin zincirinin yerine aşırı üretilen gamma ve alfa zincirleri ile oluşan HbF seviyelerinde artış görülür. HbA 2 seviyeleri hastanın genotipine göre %0 6 arasında değişir. Retikülosit seviyeleri 12

34 genellikle %1 in altındadır. Ciddi anemi (Hb: 3-5g/dL) görülmektedir. Eritrositlerde anizokromi ile birlikte MCV<70 fl olan mikrositoz ve kemik iliğinde belirgin eritroid hiperplazi görülür. Serum ferritin seviyelerinde ise artış vardır. Çocuklarda ve genç erişkinlerde uzun kemiklerde incelme ve kemik iliği boşluklarında genişleme radyolojik anomaliler olarak kendini belli eder. Maksiller sinüslerde genişleme gibi karakteristik yüz görünümleri vardır. Kafatasındaki değişiklikler kulak, burun ve boğazda enfeksiyonlara yatkınlığa yol açar. Kronik anemi ve demir yüklenmesi sonucu hastaların yaşı ilerledikçe hipopituatirizm, hipotirodizm, hipoparatirodizm, diabetes mellitus, kardiyomyopati, testiküler ve overyan yetmezlik görülebilmektedir (25, 26). β talasemi intermedia: Daha hafif beta globin gen mutasyonları sonucu oluşan klinik tanımlamadır. Talasemi major ile minor arasında bir klinik verir. Birçok olgu hafif β + talasemi alleli için homozigot veya hafif β + ve ciddi β + alleli için bileşik heterozigot durumdadır. İntermedia ile major fenotipleri değişkenlik göstermektedir. Özellikle 2 α globin zincirinde yetersiz üretim varsa beklenenden daha hafif bir klinik gözlenebileceğinden prognozu önceden öngörebilmek zordur. Güneydoğu Asya da sık gözlenen HbE, homozigotlarda hafif anemi tablosu yaparken HbE/beta talasemi hiç semptom vermeyen durumdan tranfüzyon bağımlı kliniğe kadar varabilen fenotipik değişiklikler gösterebilmektedir (27). β talasemi minor: Hemoglobin (Hb: 9-12 g/dl) ve MCV (65-75fL) seviyelerinde azalma vardır. Hafif anemi dışında bulgu vermez. 13

35 Tablo 1. Beta talasemide genotipik ve fenotipik özellikler Klinik sınıf Genotip Özellik Talasemi minor B talasemi trait β/β 0 Sessiz taşıyıcı δβ-talasemi trait β/(δβ) 0 veya + Azalmış MCV, artmış HbA 2, hafiforta anemi Talasemi intermedia β +Africa Talasemi β +Africa /β +Africa Talasemi minordan daha belirgin α + ve β 0 talasemi -α/-α/β/β 0 Heterozigot β 0 -Talasemi major (yüksek HbF ile birlikte) β 0 /β 0 yüksek HbF üretimi ile birlikte Belirgin mikrositoz ve hipokromi 0 veya +/Lepore (δβ) homozigot (δ/β) 0 veya +/Lepore / (δβ) 0 veya +/Lepore Artmış HbA 2, prognoz ileri yaşlarda belirginleşir, transfüzyon ihtiyacı olmayan ılımlı anemi, splenomegali yok Talasemi major β 0 - Talasemi major β 0 /β 0 Cooley anemisi β 0 /hemoglobin E β 0 /β E hücreler, çekirdekli eritrositler, artmış Azalmış MCV, hipokrom, hedef HbF 14

36 2.3. Beta Talasemide Genotip-Fenotip İlişkisi Beta Globin Geni Beta globin, 11p15.4 de lokalize diğer beta benzeri genlerle 70 kb lık bölgede bulunan yapısal bir gen tarafından kodlanmaktadır. Bölgede gelişimin farklı dönemlerinde eksprese olan 5 -ε G γ Α γ ψβ-δ β 3 olarak adlandırılan 5 adet fonksiyonel gen bulunmaktadır (7) (Şekil 3). βlcr β gen kümesi 3 HSI Anlamsız ve çerçeve kayması mutasyonları (β 0 ) Promotor bölge mutasyonları (β + ) İntron yapışma yerlerini etkileyen mutasyonlar (β 0 ve β + ) Promotor Transkripsiyonu etkileyen mutasyonlar (β + ) Translasyonun başlamasını etkileyen mutasyonlar (β 0 ) RNA kesim mutasyonları (β + ) Şekil 3. Beta globin gen bölgesi, beta globin yapısı ve mutasyon yerlerine ve sınıflamasına göre genotip-fenotip ilişkisi (28) Beta globin (HBB) geni 1600 bp uzunluğunda ve 146 aminoasidi kodlayan 3 ekzon ve 2 introndan oluşan bir gendir (28, 29). Ekzon 2, hem bağlayan ve 15

37 heterodimer formasyonundan sorumlu bölge iken ekzon 1 ve 3 beta globin zincirinin non-hem bağlayıcı bölgesini oluşturmaktadır. Genin fonksiyonunda önemli korunmuş bölgeler 5 promotor bölgesi, ekzon-intron birleşme yerleri ve 3 UTR (Untranslated region) bölgesidir Beta Talasemi Klinik Farklıkların Altındaki Mekanizmalar Beta talasemi aşırı değişken klinik spekturum göstermektedir. Her iki allelde mutasyon taşımasına rağmen hastalar arasında ciddi klinik farklılıklar gözlenebilmektedir. Homozigot veya bileşik heterozigot durumdaki hastaların en uç bulgu veren kısmında hayatın ilk yıllarında derin anemi bulguları ile giden ve ilk yıllarda kaybedilen olgular var iken major formundan daha hafif geçiren veya tesadüfen rutin kan sayımları sırasında tespit edilen olgular da bulunur. Aynı farklılıklar hetrozigot bireylerde de görülür. Klasik heterozigot olgularda hafif anemi gözlenirken hiçbir bulgu vermeyen hastaların yanında major formu kadar ağır bulgu veren otozomal dominant kalıtıma uyan hastalara da rastlanır (30). Hastalardaki belirgin klinik varyasyonun altında genetik ve çevresel faktörler birlikte rol almaktadır. Genetik faktörlerin bazıları direk olarak beta globin zincir sentezindeki temel defektler iken bazıları ise beta globinden ziyade hastalığın değişik komplikasyonlarını etkileyen faktörlerdir. Bu nedenle genetik modifiye edici faktörleri primer olarak beta globin zincirindeki mutasyonlar, sekonder olarak globin zincir sentezinde yer alan faktörler ve tersiyer olarak globin zincir sentezinde değil komplikasyonların gelişmesini etkileyen faktörler olarak sınıflandırılabilir (7). 16

38 Primer Modifiye Edici Faktörler (Beta Talasemi Alleleri) Beta talasemi hastalarında 200 den fazla mutasyon tariflenmiştir (31). Az miktarda görülen delesyonların dışında genellikle gen fonksiyonunu transkripsiyonel, translasyonel veya post-translasyonel seviyelerde etkileyen nokta mutasyonları görülmektedir (Tablo 2). Mutasyonlar sonucu hiç beta globin zinciri üretilemezse β 0 talasemi, beta zincirinde azalma belirgin ise β + veya hafif bir azalma varsa β ++ talasemi olarak adlandırılır. Tablo 2. Hafif ve sessiz HBB geni mutasyonları Hafif Beta Talasemi Mutasyonları Sessiz Beta Talasemi Mutasyonları -90 C>T 30 T>A CD 27 G>T Knossos 92 C>T -88 C>A 30 T>C IVS1 6 T>C 101 C>T 88 C>T 29 A>G 3 UTR 47 C>G 5 UTR +10 T 87 C>A 28 A>G PolyA AATAAA>AACAAA 5 UTR +33 C>G 87 C>G 5 UTR +22 PolyA G>A AATAAA>AATUAA IVS2 844 C>G 87 C>T CD 19 A>G PolyA Malay AATAAA>AATAGA CAP +1 A>C 86 C>G CD 24 T>A PolyA AATAAA>AATAAC 3 UTR +6 C>G 31 A>G CD 26 G>A (Hb E) 101 C>T Daha sonra anlatılacağı üzere β 0 talasemiler her zaman olmamakla beraber ciddi bir fenotiple ilişkilidir. β + ve β ++ talasemilerde ise klinik, β globin zincirlerindeki etkilerine göre değişiklik göstermektedir. 17

39 Bazı β talasemi mutasyonları sessiz mutasyonlar olarak adlandırılır. Taşıyıcılarda herhangi bir klinik bulgu vermezler; genellikle talasemi intermedia hastalarının anne ve babaları taranırken saptanır. Akdeniz toplumunda sık gözlenen -101 C>T mutasyonu dışında pek sık olarak görülmezler. Ciddi beta talasemi mutasyonları ile birlikteliklerinde hafif talasemi intermedia şeklinde klinik verirler (32). Hafif beta talasemi mutasyonları çoğunlukla β globin geninin promotor veya polya bölgesinde, bazen de ekzonların yapışma bölgeleri veya intronların ortak bölgelerinde bulunur (31). Klinik olarak heterozigotlarda hafif tanımlanabilen kırmızı hücre değişikliklerine, homozigotlarda ise intermedia benzeri bulgulara yol açar. Ciddi beta talasemi mutasyonları ile birlikteliklerinde ise transfüzyon bağımlı bozukluklara veya intermediadan daha ağır bulgulara yol açar. Hafif beta talasemi mutasyonlarından en sık olarak Afrika populasyonunda promotor bölge mutasyonları, Akdeniz bölgesinde IVSI-6 (T>C) ve güneydoğu Asya ve Hindistan da sık olarak gözlenen HbE ye yol açan CD26 (G>A) sayılabilir (33) Sekonder Modifiye Edici Faktörler Aynı beta globin geni mutasyonunu taşımasına rağmen farklı klinik bulgulara sahip olan olguların bulunmasından dolayı beta talasemi kliniğinde mutasyonların dışında etkili başka faktörlerin de olduğu düşünülmüştür (34). Beta zincir üretimi defektine bağlı alfa zincirinin aşırı birikimi ile oluşan bozukluklar nedeni ile alfa zincirinin klinik üzerine önemi bulunmaktadır. Alfa ve gama globin genlerindeki varyasyonların kliniği etkilediği tespit edilmiştir. 18

40 Birikimi sonucu hasar oluşturan alfa globin zincirinde defekt bulunması homozigot veya bileşik heterozigot β 0 kliniğini hafifletmektedir (35, 36). Alfa globin geninde delesyonlar sonucu alfa zincir üretimin azalması ile klinik hafiflerken alfa globin zincir üretimini arttıran gen triplikasyonları veya quadriplikasyonları aşırı alfa zincir birikimine yol açıp beta talasemi taşıyıcılarında bile intermediaya varan klinik ağırlaşmaya neden olmaktadırlar (37). Beta globindeki yetersiz üretim sonucu ortamdaki artan alfa zinciri ile gamma zinciri kompleks oluşturup HbF meydana getirmektedir. Beta talasemide HbF seviyelerini etkileyen faktörler ile talasemi kliniği arasında ilişki bulunmaktadır Tersiyer Modifiye Edici Faktörler Beta talasemi major hastalarında eritrositlerdeki hızlı döngü ve hem ürünlerinin hızlı yıkımı ile ağır klinik bulgu gösterenlerde sarılık ve safra kesesi taşı görülme sıklığı artmıştır. Beta talasemi minor olanlarda biluribin seviyelerini biluribinin hepatik glukuronidasyonununda görevli UDP-glukuronosiltransferaz (UGT1) deki promotor bölge polimorfizminin etkilediği gösterilmiştir. Beta talasemi minor olgularında (TA) 7 TAA polimorfizmine sahip olanlarda hiperbiluribinemi ve safra kesesi taşı görülme sıklığı artmış olarak tespit edilmiştir (38). Transfüzyona ve bağırsaktan artmış emilime bağlı gelişen aşırı demir yükü sonucu kalp ve karaciğer hastalıkları ile diabet gibi komplikasyonlar 19

41 görülmektedir. Demir birikimi ile sonuçlanan hemokromatozisten sorumlu HFE genindeki değişiklikler beta talasemi minor ve major hastalarındaki aşırı demir birikimi ile ilişkilendirilmiştir (39). Beta talasemi major hastalarında sık görülen sorunlardan biri olan osteoporoz, hipotalamik-pitüer aksın demir birikimine bağlı hasarlanması sonucu oluşan sekonder hipogonadizm nedeni ile oluşmaktadır. Bu komplikasyonun kemik metabolizmasında etkili vitamin D reseptör, kollajen ve östrojen reseptörlerindeki polimorfizmler ile modifiye edildiği düşünülmektedir (40-42) Beta Talasemi Mutasyonlarının Epidemiyolojisi Dünyadaki en yaygın tek gen hastalığı olan beta talasemi hastalığı için Dünya Sağlık Örgütü anormal hemoglobin sıklığını %5,1 olarak ve beta talasemi taşıyıcı sıklığını ise 266 milyon olarak bildirmiştir (43). Tüm dünyada klinik olarak bulgu veren 15 milyon talasemik bozukluk taşıyan kişi olduğu tahmin edilmektedir. En sık Yunanistan, İtalya, İspanya gibi Akdeniz ülkelerinde gözlenmektedir. Kıbrıs ta 1/7 oranında taşınmaktadır ve beta talasemi major taşıyan yenidoğan oranı 1/158 olarak belirtilmektedir (Şekil 4). 20

42 Şekil 4. Dünyada 1000 canlı doğumda gözlenen major hemoglobinopati sıklıklarının dağılımı Türkiye de beta talasemi taşıyıcılığı Çukurova, Akdeniz kıyı şeridi, Ege ve Marmara bölgelerinde sık görülmektedir. Sağlıklı Türk popülasyonunda beta talasemi taşıyıcı sıklığı %2,1 olarak bildirilmiştir (44). Türkiye de yaklaşık kişi taşıyıcı ve 4000 civarında hasta olduğu belirtilmektedir. Ülkemizdeki beta talasemi hasta dağılımı şekil 5 te verilmiştir. Son 5 yılda Sağlık Bakanlığı nca talaseminin sık görüldüğü 16 merkezde yapılan taramaların sonucuna göre bu bölgelerde taşıyıcılık ortalaması %4,3 olarak belirlenmiştir (45). Yapılan çalışmalarda %22 gebelikte risk belirlemeye ihtiyaç olacağı hesaplanmıştır (46). Aynı literatürde beta talasemi olma olasılığını 1000 konsepsiyonda 0,24, tüm hemogobinopatiler için ise aynı oran 0,41 olarak bildirilmiştir. Bu oranlar nüfusa uygulandığında yılda riskli gebelik 21

43 olasılığı ortaya çıkmaktadır. Taşıyıcılığın ve gebelik oranının bu kadar yüksek olduğu ülkemizde talasemi eradikasyonu için yeni yöntemler uygulanması zorunluluğu ortaya çıkmaktadır. Şekil 5. Türkiye de beta talasemi hasta dağılımı Türkiye de hemoglobinopatilerden en sık olarak %73 talasemi major, %23 orak hücreli anemi ve %4 HbH hastalığı gözlenmektedir. Talasemi major ve intermedia mutasyonlarından en yaygın olarak IVSI-110 (G>A) %41 sıklıkta görülmektedir. Daha sonra sırasıyla %10,3 sıklıkta IVSI-6 (T>C), %8,1 sıklıkta IVSII-1 (G>A), %6,2 sıklıkta IVSII-745 (C>G), %5,7 sıklıkta IVSI-1 (G>A), %4,7 sıklıkta Codon 8 (-AA), %4,2 sıklıkta -30 (T/A), %2,6 sıklıkta Codon 39 (C>T), %2,6 sıklıkta Codon 8/9 ve %1,8 sıklıkta Codon 44 mutasyonları gelmektedir. 22

44 Tüm bu 10 mutasyon toplam mutasyonların %87,2 sini kapsamaktadır (47). En sık gözlenen IVSI-110 Türkiye genelinde %40 oranında gözlenirken orta Anadolu da %50 den daha sık, Doğu ve Güneydoğu Anadolu da ise %25 den az oranda görülmektedir (48). Türk populasyonunda ve dünyadaki talaseminin sık görüldüğü toplumardaki mutasyon dağılım oranları Tablo 3 de verilmiştir (49). Tablo 3. Türkiye de ve dünyada beta talasemi mutasyon görülme sıklıkları (%) Akdeniz Asya ABD Mutasyon İtalya Yunanistan Türkiye Pakistan Hindistan Çin Tayland Afrikan- Amerikan -88 (C>T) 0,8 21,4-87 (C>G) 0,4 1,8 1,2-30 (T>A) 2,5-29 (A>G) 1,9 60,3-28 (A>G) 11,6 4,9 CAP+1 (A>C) 1,7 CD5 (-CT) 1,2 0,8 CD6 (-A) 0,4 2,9 0,6 CD8 (-AA) 0,6 7,4 CD8/9 (+G) 28,9 12,0 CD15 (G>A) 3,5 0,8 0,8 CD16 (-C) 1,3 1,7 CD17 (A>T) 10,5 24,7 CD24 (T>A) 7,9 CD30 (G>A) 0,9 CD30 (G>C) 3,5 0,9 CD39(C>T) 40,1 17,4 3,5 CD41/42 (-TCTT) 7,9 13,7 38,6 46,4 CD71/72 (+A) 12,4 2,3 IVSI-1 (G>A) 4,3 13,6 2,5 IVSI-1 (G>T) 8,2 6,6 IVSI-5 (G>C) 26,4 48,5 2,5 4,9 IVSI-6 (T>C) 16,3 7,4 17,4 IVSI-110 (G>A) 29,8 43,7 41,9 IVSII-1 (G>A) 1,1 2,1 9,7 IVSII-654 (C>T) 15,7 8,9 IVSII-745 (C>G) 3,5 7,1 2,7 619 bp delesyon 23,3 13,3 Diğer 4,1 2,2 9,7 0,5 0,9 6,8 7,9 10,6 23

45 2.5. Beta Talasemide Moleküler Tanı Modifiye edici faktörler tarafından etkilenmesi göz önüne alınarak değerlendirilmesine rağmen kabaca talasemi mutasyon taraması tam kan sayımında MCV, MCH, MCHC ve hemoglobin elektroforezi gibi değerlere bakılarak planlanmaktadır. Talasemide moleküler tanı için akış şeması Şekil 6 da verilmiştir (49). PCR temelli teknolojilerin gelişimi ile hızlı, kesin ve güvenli sonuçlar elde edilebilmektedir. Tam kan sayımı + Elektroforez MCV fl: MCH pg: HbA > 78 >27 <%3 < 78 <27 < 78 <27 < 78 <27 Varyant hemoglobin HbA2 HbF >%3,5 %0,1-7 >%3,5 >%3 %2-30 Oraklaşma testi Normal B Talasemi taşıyıcılığı Demir düzeyi Kantitatif HbF F hücre dağılımı Oraklaşma pozitif Oraklaşma negatif Sık mutasyonlar için DNA analizi Düşük Normal DNA analizi HbS Doğrulama Tanımlanmamış mutasyonların belirlenmesi Demir eksikliğini düzelt α talasemi taşıyıcısı α globin gen analizi β gen analizi δβ Talasemi veya HPFH Hb C, D, E, O Arab, Lepore Diğer DNA analizi δ+β talasemi taşıyıcılığı δβ-talasemi taşıyıcılığı Şekil 6. Taşıyıcı taraması ve mutasyon analizi için MCV, MCH, HbA2 ve HbF düzeylerine göre değerlendirme akış şeması 24

46 Moleküler Tanıda Kullanılan Yöntemler Talasemi hastalığının veya taşıyıcılığının kesin tanısı ancak son yıllarda yeni teknolojilerin gelişmi ile mümkün hale gelen DNA düzeyinde moleküler genetik incelemeler sonucu konabilmektedir. DNA elde edilebilen her durumda bilinen veya bilinmeyen mutasyonların tespitinde farklı yöntemler kullanılabilmektedir. Bilinen mutasyonları taramak için ARMS (amplification refractory mutation system), heterodupleks analizi, restriksiyon enzim analizi, dot-blot analizi, reverse dot-blot analizi (beta globin strip assay), real-time PCR gibi yöntemler uygulanabilirken, bilinmeyen mutasyonların tespitinde DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), SSCP (single strand conformational polymorphism), DNA dizi analizi gibi yöntemler kullanılabilmektedir (23, 50-52) Beta Globin Strip Assay DNA ürünlerinin PCR ile çoğaltıldıktan sonra membrana sabitleştirilmiş olignükleotid probları ile hibridizasyonu temeli ile gerçekleştirilmektedir. En sık gözlenen Akdeniz ülkelerine spesifik 22 adet mutasyonu kapsamaktadır. Taranan mutasyonlar (-87 (C>G), -30 (T>A), Cd5 (-CT), HbC, HbS, Cd6 (-A), Cd8 (-AA), Cd8/9 (+G), Cd22 (-7bp), Cd30 (G>C), IVSI-1 (G>A), IVSI-2 (T>A), IVSI-5(G>C), IVSI-6 (T>C), IVSI-110 (G>A), IVSI-116 (T>G), IVSI-25 (-25 bp), Cd 36,37 (-T), Cd39 (C>T), Cd44 (-C), IVSII-1 (G>A), IVSII-745 (C>G) ) Türkiye deki talasemi olgularının %84-90 ını kapsamaktadır (53). 25

47 DNA Dizi Analizi Mutasyon belirleme işleminde günümüzde altın standart olan yöntemdir. Dideoksi sonlanma metodu geliştirilmesi ile hızla kullanıma giren sekanslama işlemi, bilinmeyen mutasyonların taranmasında hızlı ve güvenli bir yöntem haline gelmiştir. dntp ve farklı 33P ile işaretli ddntp (DNA uzamasında gerekli 3 -OH grubu olmayan) karışımı içeren PCR da farklı floresan renkli ddntp ile sonlanmış farklı uzunluktaki PCR ürünleri otomatize dizi analizi cihazlarında analiz edilmektedir. Non-radyoaktif, tek tüpte gerçekleşen, hızlı, kesin ve güvenilir bir yöntem olarak belirtilmektedir (54) Real-time PCR Son yılllarda PCR reaksiyonlarında sıcaklık döngüleri sağlamak için kullanılan cihazların (thermocycler) hassaslaşması ve floresan ışıma tekniklerinin de gelişimi ile kinetik revers transkriptaz-pcr (RT-PCR) geliştirilmiştir. Bu sayede, gen kopya ürünlerinin düzeylerini sayısal değerlerle ölçmek, devam eden PCR reaksiyonunu ekranda izleyerek Real Time (eşzamanlı) olarak reaksiyonun gidişine müdahale etmek ve PCR döngülerinin sayısıyla oynayabilmek mümkündür. Birçok adlandırmayla anılan bu teknolojiye floresan okuma yapması nedeniyle literatürde Floresan Kantitatif RT-PCR, Kantitatif-kinetik PCR gibi çeşitli adlar altında rastlamak mümkündür. Gerçek zamanlı PCR reaksiyonu, bir reaksiyonda polimorfik DNA bölgelerinin kantifikasyonunun ve tek nükleotid polimorfizm genotiplendirilmelerinin yapılabildiği bir yöntem olarak özetlenebilir (55). Başlıca gen ekspresyonunun kantitasyonu, viral kantitasyon, patojenlerin tespiti, mikrosatellit instabilitesi 26

48 tespiti, metilasyon analizi, kemik iliği transplantasyonu sonrası kimerizm analizi, anne kanından izole edilen tek hücrede prenatal tanı, hemoglobinopatilerin prenatal tanısı gibi alanlarda kullanılmaktadır (52, 56-62). LightCycler (LC) (Roche) cihazı ile genotipleme çalışmaları için ilgili gen bölgesine özgün primerlerin yanında testin özgüllüğünü arttırmak amacıyla esas hedefe yönelik floresan boyalarla işaretlenen diziye özgü oligonükleotid hibridizasyon probları kullanılmaktadır. Bu problar DNA zincirine baş ve kuyruk pozisyonunda hibridize olacak şekilde dizayn edilmiştirler ve DNA zincirindeki polimorfik bölgeyi örten sensor hibridizasyon probu ile bu proba yakın bir bölgeye bağlanan anchor problardan oluşmaktadır (Şekil 7-A). Denatürasyon aşamasında, hibridizasyon probları solüsyon içerisinde birbirinden bağımsız olarak durmaktadırlar. Bu problar, amplifikasyon süresi boyunca ise hedef DNA bölgesi üzerinde birbirine 1-5 nükleotid uzaklıktaki mesafede bağlanırlar. Floresan boya ile işaretlenmiş olan uçlar yan yana gelmektedir. LC cihazının ışık kaynağından yayılan 470 nm deki mavi ışık, fluorescein ile işaretlenmiş olan sensor probunu uyararak daha uzun dalga boyundaki (530 nm) yeşil floresan ışığın yayılmasına neden olmaktadır. İki floresan boya ile işaretlenmiş olan probların yan yana gelmesiyle açığa çıkan enerji, ikinci prob üzerindeki alıcı boyayı etkileyerek floresans oluşumuna yol açmakta ve yeşil ışığın enerjisi LC Red 640 boyası içinde farklı bir dalga boyundaki (640 nm) kırmızı floresan ışığın yayılmasına neden olmaktadır. İki prob arasında meydana gelen bu enerji transferi, Fluoresance Resonance Energy Transfer (FRET) olarak adlandırılmaktadır. Bu enerji transferi sonucunda oluşan floresans miktarı, ortamdaki hibridizasyonun derecesine diğer bir ifadeyle PCR siklusu süresince oluşan amplikonların miktarına bağlı olarak artmaktadır. LC cihazının optikle 27

49 ilgili birimi olan F2 kanalı, 640 nm deki kırmızı ışığın yoğunluğunu ölçmektedir. Ölçüm, ışımanın maksimum olduğu bağlanma (annealing) fazı sonunda yapılabilmektedir (Şekil 7-B). Annealing fazından sonra, sıcaklık artar ve hibridizasyon probları başlayan uzama (elongation) aşaması sırasında amplikondan ayrılırlar (Şekil 7-C). Uzama aşamasından sonra oluşan amplikonlar çift iplikli olduklarından hibridizasyon probları ile hibridize olamazlar. Bu durumda, iki prob birbirlerinden uzakta ve serbest halde oldukları için FRET gerçekleşemez (Şekil 7-D) (63). Şekil 7. Light cycler çalışma prensibi 2.6. Beta Talasemide Prenatal Tanı Hemoglobinopatilerden ilk kez prenatal tanı, fetal fibroblastlardan elde edilen DNA ile alfa talasemide yapılmıştır (64). Gebelik haftasına göre amniyosentez, kordosentez veya koryonik villüs materyalinden elde edilecek fetusa ait DNA ile talasemi açısından yukarıda bahsedilen yöntemlerin biri kullanılarak moleküler analiz yapılabilmektedir. Mutasyon analizi sırasında elde edilen DNA nın anneye değil fetusa ait olduğu mutlaka doğrulanmalıdır. 28

50 a) Amniyosentez Gebeliğin haftalarında ultrasonografi eşliğinde transabdominal olarak, amniyotik sıvıdan örnek alma işlemidir. Erken amniyosentezde daha çok ekstraembriyonik doku hücreleri bulunurken, haftadan sonra fetal epidermis, gastrointestinal sistem ve üriner sisteme ait hücreler ile fetal membranlara ait hücreler baskındır. Gebeliğin haftaları arasında yaklaşık ml amniyotik sıvı bulunmaktadır ve buradan elde edilecek 1 ml gibi az bir miktardan DNA izolasyonu yapılıp uygun moleküler analiz yöntemleri kullanılabilmeketedir. İşleme bağlı olarak oluşabilecek gebelik kayıp oranı % 0,5-1 arasında bildirilmektedir (65). b) Koryon Villus Örneklemesi (CVS) Gebeliğin haftalarında ultrasonografi eşliğinde transservikal veya transabdominal kateter aracılığıyla koryon villuslardan parça alınarak yapılan işlemdir. CVS sonrası fetal kayıp riskinin amniyosenteze oranla daha yüksek olduğu bildirilse de haftalar arasında spontan fetal kayıp riskinin amniyosentez haftalarındakine göre daha yüksek olduğu göz önüne alındığında arada anlamlı bir fark gözlenmemektedir (66). CVS den elde edilen materyalde, en dış kısımda hormonal olarak aktif sinsityotrofoblast, ortada sitotrofoblast ve merkezde fetal kaynaklı kapiller dokular olmak üzere 3 doku bulunmaktadır. Prenatal tanıda kullanılanlar, merkezde bulunan fetal mezenkimal dokulardır. CVS ile alınan örnekler mikroskop altında fetal ve maternal hücreler birbirlerinden ayrılır, DNA izolasyonu sonrasında mutasyon analiz yöntemlerinden uygun olanları kullanılmaktadır. 29

51 c) Kordosentez Gebeliğin haftaları arasında ultrasonografi eşliğinde fetustan kord kanı alma işlemidir. Alınan fetal kan örneğinin anne kanı ile kontamine olup olmadığının anlaşılması için kan sayımı ve Kleihauer Betke testi ile kanın fetal kan olduğu gösterilmelidir. Mutasyon analizi için kolon kromatografisi, in vitro hemoglobin sentezi gibi yöntemler kullanılabilmekle beraber fetal DNA kullanılarak uygulanan moleküler genetik testler hem yöntem kolaylığı hem de doğruluk bakımından tercih edilmektedir (66). d) Maternal Kanda Fetal DNA Fetal DNA nın maternal plazmadan veya serumdan elde etme yöntemidir (67). Noninvaziv bir yöntem olarak bilinen bu teknik henüz çalışma aşamasındadır ve rutin tanı amaçlı kullanılmamaktadır. İleriki yıllar için büyük umut taşıyan bu yöntemde, PCR sırasında maternal kontaminasyon ve diğer DNA amplifikasyonunlarını önlemek amacıyla sınırlı sayıda PCR siklusu önerilmektedir (68) Preimplantasyon Genetik Tanı Günümüzde aileler, birçok kromozomal ve tek gen hastalıklarında gebelik döneminde prenatal tanı ile saptanan etkilenmiş bir fetusun sonlandırılacağı gebelik yerine gebelik oluşmadan tanı imkanı veren PGT yöntemini tercih edebilmektedirler (52). Esas amacı genetik olarak bir hastalık açısından etkilenmemiş embriyonun tespiti ve uterusa transferi olan PGT, in vitro fertilizasyon (IVF) veya intrasitoplazmik sperm injeksiyonu (ICSI) sonrası 30

52 oluşmuş embriyonun 3. gününde alınan blastomerinden veya oositin mayozdaki ilerlemesi sonucu oluşan birinci ve/veya ikinci polar cisimden veya blastokistinin trofoektoderm hücrelerinden yapılan PCR veya FISH (Flouresance in situ hybridization) temelli genetik analize dayanmaktadır (69). Hastaya ve hastalığa göre bu yöntemlerden biri veya birkaçı uygulanabilmektedir. Baba kaynaklı anomaliler polar body analizi ile gözden kaçabilirken ovumdaki mayotik hatalardan kaynaklanan mozaisizmler ve/veya uniparental dizomiler embriyo biyopsisi ile gözden kaçabilmektedir. Bu nedenle tek, çift veya bazen üçlü biyopsi kesin tanı için gerekli olabilmektedir (70) Preimplantasyon Genetik Tanı Uygulamaları PCR ın tek hücrede kullanılabileceğin ilk olarak gösterilmesinden sonra, preklinik ve klinik PGT testleri uygulanmaya başlandı (71). İlk olarak PCR temelli PGT, X e bağlı hastalık tanısında kullanılmıştır ancak daha sonraları birçok tek gen hastalığının tespitinde uygulanmıştır (72, 73). Cinsiyet tayini embriyodan tek bir blastomer alınıp Y kromozomuna spesifik primerler kullanılarak yapılan PCR amplifikasyonu ile gerçekleştirilmiştir. Ancak amplifikasyon başarısızlığını XX cinsiyet olarak değerlendirip yanlış tanı verildiğinde tek primer seti ile PCR yönteminin güvenilirliği tartışma konusu olmuştur (74). Daha birçok çalışmada benzer sorunlarla karşılaşılmasının ardından çözüm olarak bağlı polimorfik markırlar kullanılarak yapılan multipleks PCR geliştirilmiştir. Günümüzde PGT işlemleri tek hücre düzeyinde gerek kromozomal gerekse de gen düzeyinde başarılı olarak uygulanmaktadır. Prenatal tanıya 31

53 alternatif olarak değerlendirilmektedir (75). PGT endikasyonları arasında ileri anne yaşı, tek gen hastalığı, yapısal kromozomal anomali taşıyıcılığı, tekrarlayan yardımcı üreme tekniklerinde başarısızlık, tekrarlayan düşük öyküsü, non obstrüktif azospermi, dengeli translokasyon taşıyıcılığı sayılmaktadır. PGT nin amaçları arasında spontan abortusların azaltılması, implantasyon oranlarının arttırılması, çoklu gebeliklerin ve dondurulmuş embriyoların azaltılması sayılabilir. Sorunlar Preimplantasyon Genetik Tanıda (Tek Hücre PCR ında) Karşılaşılan DNA nın stabilitesi ve PCR amplifikasyonu Tek hücre ile tanıya ulaşılması ve bu tanının embriyonunun canlılığını kaybetmeden konması gerektiğinden her aşamada birçok sorunla karşılaşılabilmektedir. Başarılı bir tek hücre PCR ı için ilk koşul, hücrenin DNA kalıbının PCR a uygun olması ve DNA zincirinin primer bağlanma ve primerler arası bölgelerinden kırılmamış olması gerekmektedir. Tek hücre PCR ı için yapılan embriyo biyopsisi de DNA amplifikasyon başarısı açısından önemlidir. En önemli noktalardan bir tanesi, biyopsi sırasında hücrenin parçalanmasını (lizis) engellemektir. Hücre parçalanmış olup nukleus görünür halde bile tüpe alınmasına rağmen amplifikasyon başarısında ciddi sorunlar yaşandığı belirtilmiştir. Hücrenin alındıktan sonra kullanılan lizis protoklünün de amplifikasyonu etkilediği gösterilmiştir (76, 77). İyi bir morfolojye sahip ve görünür halde nukleusu olan bir emriyodan alınan blastomerdeki amplifikasyon başarısı %90 ın üzerindedir. Ancak arrested, fragmante, nukleusu tam 32

54 seçilemeyen bir embriyodan alınan blastomerin amplifikasyon başarısı daha düşük olacaktır (78, 79) Kontaminasyon Tek bir hücrenin DNA konsantrasyonunun çok düşük olması (~ 5 pg) PCR daki temel sorunlardan birisidir. Bu nedenle başarılı bir PCR işlemi için fazla amplifikasyon siklusuna ihtiyaç duyulmaktadır. Siklus sayısı arttıkça Taq polimeraz daha fazla yere bağlanmaya başlayıp nonspesifik bağlanmalar oluşturmakta ve kontaminasyon riskini arttırmaktadır. Kontaminasyon, oositi çevreleyen kümülüs hücrelerinden anne kaynaklı veya fertilizasyonu takiben zona pellusidada gömülü kalmış spermden ötürü baba kaynaklı olabileceğinden oositler kümülüs hücrelerinden tamamen temizlenmeli ve oosit fertilizasyonu için IVF yerine ICSI önerilmektedir (80-82). Parental kaynak dışında laboratuvar ortamı da bir diğer kontaminasyon kaynağıdır. Özellikle önceden amplifiye olmuş DNA fragmanlarının ortamda bulunması büyük tehlike teşkil etmektedir. Bu nedenle biyopsi ve PCR işlemlerinin yapıldığı yerler izole, steril ve kendine özgü ekipmaları olan laboratuvar bölgeleri olmalıdır ve o bölgede kullanılan malzemeler kesinlikle oda dışına çıkartılmamalıdır. Filtrasyon, UV ışık dekontaminasyona yardımcı olmakla beraber kesinlikle ilk basamak çözümler olarak değerlendirilmemelidir. Ayrıca, tüm PCR ajanlarının klinik vaka öncesi test edilmesi hem işlemin başarısını test etmek hem de kontaminasyonu gözlemlemek açısından önemlidir. PCR ın özgüllüğünü arttıran ve kontaminasyon riskini azaltan bir strateji, nested PCR olarak bilinmektedir (83). İlk turda dış primerler ile yapılan bir amplifikasyon, ikinci turda ise ilk turda elde 33

55 edilen ürün kalıp olarak kullanılarak iç primerler ile yeniden PCR uygulama işlemidir. İkinci amplifikasyonda daha dar bir bölge, daha yüksek kopya sayısında çoğaltılmaktadır. İlk siklusta bir kontaminasyon olmuş olsa dahi ikinci reaksiyonda, bu bölge yeni iç primerler nedeniyle çoğaltılamamaktadır. Kontaminasyonu aşmanın bir diğer yolu da ek hipervariabl DNA fragmanlarının amplifikasyonudur (84). Gen dışı bağlı olmayan (unlinked) veya bağlı (linked) mikrosatellit markırların kullanılması kontaminasyonun ekarte edilmesi amacıyla önemlidir Allel dropout (ADO) PCR temelli PGT de karşılaşılan bir başka sorun, tek hücrede parental allelerden sadece birinin amplifiye olması diğerinin olamaması allel dropout (ADO) olarak adlandırılmaktadır (85). Heterozigot bir hücrede, her 2 allel de eşit oranda etkilenebilir ve bunun önceden bilinmesi olanaksızdır. Yanlış tanıya yol açacağından, PCR başarısızlığı gibi sorunlara göre daha tehlikelidir. Özellikle normal olarak sonuçlandırılan dominant hastalıklarda ve taşıyıcı olarak sonuçlanan bileşik heterozigotluk durumlarında yanlış tanı açısından çok önemlidir. ADO, tek hücre reksiyonlarının %30 undan fazlasını etkilediğne dair yayınlar bulunsa da genel olarak insidansı %10-20 olarak verilmektedir (80, 86-88). Yüksek ADO oranı nedeniyle bazı gruplar aynı embriyodan 2 hücrenin analizini yapmaktadırlar. ADO nun tam olarak nedeni aydınlatılamamış olmasına rağmen, hücre lizis metodu ve tam başarılamayan lizis, uygunsuz PCR koşulları, hedef DNA dizisi, PCR ürününün boyutu gibi PCR etkinliğini düzenleyen birçok faktör suçlanmıştır (89-91). Bir çalışmada, denatürasyon 34

56 ısısının 90 0 C den 96 0 C ye çıkartılmasıyla ADO oranında kistik fibrozis lokusunda 4 kat, beta globin lokusunda 11 kat azalma tespit edilmiş (91). Alkali bir lizis tamponu veya proteinaz-k içeren bir lizis solüsyonunun da ADO yu azaltmada etkili oldukları belirtilmiştir (91, 92). Dejenere olmaya başlayan hücrelerdeki ADO oranlarının artması, DNA nın degradasyonu ile ilişkili olabileceğini ortaya koymuştur. Ayrıca ADO oranları hücre tipine göre de değişiklik göstermektedir. Bazı çalışmalarda, blastomerlerdeki ADO oranlarının diğer tek hücrelere göre çok daha fazla olduğu bildirilmiştir (87). ADO eradikasyonunda kullanılan yöntemlerin başında multipleks PCR olarak adlandırılan hastalığa neden olan gen civarında bulunan bir veya daha fazla bağlı (linked) polimorfik markırın aynı anda amplifikasyonudur. Multipleks PCR ilk kez denendiğinde 4 lokus tek bir PCR ile çoğaltılımıştı. Bir markır mutasyon için 4 markır ise bağlı veya bağlı olmayan markırlardan oluşmaktaydı. Mutasyon için kullanılan markıra ek olarak bir bağlı markır kullanıldığında ADO ya bağlı yanlış tanı riskinin en azından yarı yarıya azaldığını hesaplamışlar. Aynı araştırmacılar CFTR geninin ekzon 10 u için ADO oranını %33,3 intron 6 da bağlı bir markırın ise %20,4 olarak bulmuşlardır. İkisi birlikte çalışılarak hesaplandığında ise %13,9 olarak bulmuşlardır (87). ADO, aynı reaksiyonda gerçekleşen her bir amplifikasyonda aynı anda gerçekleşemeyeceğinden dolayı multipleks PCR güvenli bir yöntem olarak belirtilmektedir (93). Son yıllarda hem ADO yu hem PCR başarısızlığını hem de kontaminasyonu önlemek ve tespit etmek amacıyla multipleks PCR ile birlikte floresan PCR ın kullanıldığı platformlarda analizler gerçekleştirilmektedir (94). 35

57 Preimplantasyon Genetik Tanıda (Tek Hücre PCR ında) Kullanılan Multipleks PCR ve Mikrosatellit Tekrar Dizileri Birbiriyle ilişkili olmayan primer setleri kullanılarak tek bir PCR reaksiyonunda birçok bölgeyi çoğaltma işlemine multipleks PCR adı verilmektedir (95). PCR koşulları iyi optimize edilirse 15 kadar lokusun aynı anda çoğaltılabileceği gösterilmiştir (96). Tek bir hücre için de, uygun koşullar sağlandığı takdirde benzer amplifikasyon sayılarına ulaşabilmek mümkün olabilir. PCR sonrası yakın büyüklükteki ürünlerin ayrımı önceden problem iken günümüzde floresan PCR ile çözüme kavuşmuş oldu. Primerler, farklı renklerdeki floresan boyalarla işaretlenebilmekte ve aynı büyüklükteki PCR ürünleri bile kolayca ayırt edilebilmektedir. Tek hücre PCR ında yanlış tanıya neden olan allel dropout ve kontaminasyonu ekarte etmek amacıyla kısa tekrar dizileri (STR) içeren markırlar kullanılarak multipleks floresan PCR uygulanmaya başlanmıştır. Bu amaçla, bağlı veya bağlı olmayan markırlar kullanılmaktadır (97, 98). Anne ve babanın o lokus için 4 farklı allele sahip olması, incelenen hücrenin de aynı lokus için 2 farklı allele sahip olması istenir. İncelenen hücrede başka, ek bir allelin olması kontaminasyonu işaret edecektir (99). İkiden fazla parental allel varlığında ise kontaminasyon dışında anöploidi veya uniparental dizomi de akla gelmelidir (100). Kümülüs hücresi tarafından oluşan kontaminasyonda, maternal alleller dışında bir de paternal allel gözlenecektir. ADO tespitinde ise bağlı markırların kullanılması gerekmektedir. Bu, ayrıca kontaminasyonu tespit etmek için de kullanılabilir. Bağlı markırın allelleri mutasyonla beraber kalıtılacaktır, böylece ADO, elde edilen sonuçlara göre 36

58 değerlendirilmektedir. Bazı markırları çoğaltmak zordur ve elektroforez sonrasında stutter adı verilen istenmeyen ek DNA fragmanları oluşturabilmektedirler. Trinükleotid veya tetranükleotid tekrar dizilerinin kullanılması, standardize edilmiş hazır PCR ajanlarının kullanılması bu sorunları azaltacaktır Preimplantasyon Genetik Tanıda (Tek Hücre PCR ında) Kullanılan Bağlantı (Linkaj Analizi) Mutasyon analizi ve bağlı markır analizlerini birleştirip bir PCR protokolü oluşturmak, özellikle çok sayıda mutasyon bulunan hastalıklarda zor olabilmektedir. Böyle durumlarda mutasyonu doğrudan tespit etmek yerine polimorfik markırlar kullanarak mutasyonla beraber kalıtılan haplotipi tespit etmek bazı gruplar tarafından benimsenmiştir. Hastalık lokusu ile yakın ilişkide olan herhangi bir informatif polimorfizmin varlığı, mutasyonun olup olmadığının tespitinde kullanılabilmektedir. Gen içi veya gene çok yakın durumdaki markırlar bu amaçla seçilmektedir. Bu markırların, mayoz sırasında rekombinasyonla mutasyondan ayrılma olasılığı bulunmamaktadır. Bu işlemin dezavantajı ise hangi polimorfik varyantın mutasyonla birlikte kalıtıldığının gösterilebildiği bir aile çalışması gerektirmesidir. Bağlantı analizi, otozomal dominant hastalıklar arasından ilk kez Marfan sendromu için uygulanmıştır. Bu çalışmada, fibrillin geni ile bağlı dinükleotid polimorfizminin kaltımı incelenmiştir (101). Daha sonra birçok hastalık için bu yöntem başarıyla uygulanmıştır. 37

59 BÖLÜM II GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Olguların Seçimi Mikrosatellit markırların heterozigotluk oranlarını hesaplamak için 2009 yılında Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı na başvuran olgulardan, akraba olmadığı bilinen rastgele 100 olgu (50 erkek, 50 kadın) seçildi. Bu olguların cinsiyetleri, doğum yerleri ve yaşları kaydedildi. Tek hücre çalışmaları kapsamında olgular, yılları arasında, önceden fetusta beta talasemi riski için prenatal tanı amacıyla Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı na başvurmuş olan çiftler arasından seçildi. Tek hücre çalışmasına, bir çocuklarında talasemi taşıyıcılığı olan 7 çift, bir çocuklarında talasemi taşıyıcılığı ve diğer çocuklarında talasemi hastalığı olan 2 çift ve bir çocuklarında talasemi hastalığı bileşik heterozigot şeklinde gözlenen 1 çift olmak üzere çocuklarla beraber toplam 32 birey dahil edildi. Çalışma protokolü, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Etik Kurulu tarafından tarihli ve /4 sayılı karar ile onaylanmıştır. Çalışmaya katılanlar Gönüllü Olur Formunu nu imzalayarak çalışmaya katılmayı kabul etmişlerdir. Çalışmanın ekonomik desteği Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu tarafından sağlanmıştır. 38

60 2.2. Çalışmada Kullanılan Kimyasal Malzeme, Tamponlar ve Aletler Periferik Kandan DNA İzolasyonu 1. İnvisorb spin blood kit (INVITEK) Filtreli tüpler Receiver tüpler Eppendorf tüpleri Proteinaz K Lysis buffer A Binding buffer B6 Wash buffer I ve II Elution buffer D 2. Etanol (%95 99) 3. Otomatik pipetler (1 10 µl ve µl, Eppendorf) 4. Steril sarı ve beyaz pipet uçları (Brand) 5. 1,5 ml lik Eppendorf tüpleri (Axygen) 6. Eppendorf tüp taşıyıcıları 7. Vorteks (Heidolph Reaks Top) 8. Santrifüj (Sigma 1 15) 9. Thermomikser (Eppendorf AG) 10. Eldiven Periferik Kandan Tek Hücre (lenfosit) Ayrıştırması ve DNA İzolasyonu 1. Laminar flow (Heraus) 39

61 2. Alev kaynağı 3. Steril cam pastör pipetler 4. Ağız pipeti 5. Inverted Mikroskop (Olympus CK 40) 6. PCR Grade distile su (Roche) 7. Steril petri kapları (Greiner bio-one) 8. Steril 15 ml lik falkon tüpler (Greiner bio-one) 9. Histopaque 1083 (Sigma) 10. Proteinaz K, rekombinant, PCR Grade (Roche) C derin dondurucu 12. Steril NaCl 13. 0,2-0,5-1,5 ml lik Eppendorf tüpleri (Axygen) 14. FastStart High Fidelity PCR System, dntpack (Roche) Enzim miks MgCl 2 içeren 10x konsantrasyonlu reaksiyon miksi DMSO Nükleotid miks 15. Otomatik pipetler (1 10 µl ve µl, Eppendorf) 16. UV lambalı, PCR kabini (Thermo Holten) 17. Steril sarı ve beyaz pipet uçları (Brand) 18. Vorteks (Heidolph Reaks Top) 19. Santrifüj (Sigma 1 15) 20. Thermomikser (Eppendorf AG) 21. Thermal Cycler (Techne) 22. Beta globin geni ve mikrosatellit markırlar için primerler (TIB MOLBIOL) 40

62 23. Pudrasız eldiven Nested, Real-time PCR 1. Light Cycler (Roche) 2. Light Cycler kapillerleri (Roche) 3. Light Cycler Faststart DNA Master HybProbe (Roche) Enzim miks MgCl 2 PCR Grade distile su 4. Mutasyona özgü nested primerler ve light cycler probları (TIB MOLBIOL) 5. Otomatik pipetler (1 10 µl ve µl, Eppendorf) 6. 0,2-0,5-1,5 ml lik Eppendorf tüpleri (Axygen) 7. UV lambalı, PCR kabini (Thermo Holten) 8. Steril sarı ve beyaz pipet uçları (Brand) 9. Vorteks (Heidolph Reaks Top) 10. Santrifüj (Sigma 1 15) 11. Pudrasız eldiven Mikrosatellit Markır Analizi Heterozigotluk Araştırması İçin Mikrosatellit Markır Analizi 1. Taq polimeraz (Fermentas) 2. 10x Buffer (Fermentas) 3. MgCl 2 (Fermentas) 41

63 4. dntp set (Fermentas) 5. Steril distile su 6. Primerler (TIB MOLBIOL) 7. Otomatik pipetler (1 10 µl ve µl, Eppendorf) 8. 0,2-0,5-1,5 ml lik Eppendorf tüpleri (Axygen) 9. Steril sarı ve beyaz pipet uçları (Brand) 10. Thermal cycler (Techne) 11. ABI 3100 sekans cihazı (Applied Biosystems) 12. ROX size standard (Applied Biosystems) 13. POP-4 (Applied Biosystems) 14. Formamid Tek Hücre Çalışmasında Kullanılan Mikrosatellit Markır Analizi 1. ABI 3100 sekans cihazı (Applied Biosystems) 2. ROX size standard (Applied Biosystems) 3. POP-4 (Applied Biosystems) 4. Formamid 5. Otomatik pipetler (1 10 µl ve µl, Eppendorf) 6. 0,2-0,5-1,5 ml lik Eppendorf tüpleri (Axygen) 7. Steril sarı ve beyaz pipet uçları (Brand) 42

64 2.3. Heterozigotluk Araştırması Amaçlı Mikrosatellit Markır Analizi Çalışma Protokolü Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı na 2009 yılında herhangi bir nedenle başvuran olgulardan, akraba olmadığı bilinen rastgele 50 erkek, 50 kadın toplam 100 olgu seçildi. Tüm olgular için demografik veriler, aile bilgilerini içeren olgu formları dolduruldu. Her olgudan 2 şer ml EDTA lı periferik kan örneği alındı Periferik Kandan DNA İzolasyonu DNA izolasyonları, Invisorb spin blood kit (Invitek) ile gerçekleştirildi. 1. EDTA'lı tüplerden 200 µl kan eppendorf tüplere aktarıldı. Üzerine 20 µl proteinaz K ve 200 µl Lysis buffer A eklenerek saniye vortekslendi ve 56 0 C thermomikser de 10 dakika inkübe edildi. 2. Aynı zamanda Elution buffer D örnek başına 200 µl olacak kadar ependorf tübe alınıp 56 0 C Thermomikser e ısınması için bırakıldı. 3. Spin filtreler, Recevier tüplerine yerleştirildi. 4. Örneklerin üzerine 400 µl Binding buffer B6 eklendi, 5 saniye vortekslendi ve filtreli tüplere aktarıldı. 5. Filtreli tüpler içerisinde oda sıcaklığında 1 dakika inkubasyon uygulandı. 6. Bu filtreli tüplere 1 dakika sonra rpm de 2 dakika santrifüj işlemi gerçekleştirildi. 43

65 7. Santrifüj işlemi bitiminde filtreler Recevier tüplerinden çıkarıldı ve Recevier tüpleri boşaltıldı. Filtreler tekrar Recevier tüplerine yerleştirildi ve filtrelerin üzerine 500 µl Wash buffer I eklenerek tekrar santrifüje yerleştirildi rmp de 1 dakika santrifüj işlemi uygulandı ve tekrar Recevier tüpleri boşaltıldı. 8. Filtrelerin üzerine Wash buffer II solüsyonu eklendi ve rpm de 1 dakika santrifüj işlemi uygulandı. Santrifüj işlemi bitiminde Recevier tüpleri boşaltılarak (en yüksek) rpm de 4 dakika kuru santrifüj işlemi uygulandı ve filtreler Eppendorf tüplerine alındı. 9. Bu işlem sonrasında, daha önce 56 0 C Thermomikser de bekletilmiş olan Elution buffer D her örnek için 200 µl olmak üzere filtrelerin üzerine konuldu, 3 dakika oda sıcaklığında inkubasyona bırakıldı. 10. İnkubasyon bittikten sonra rpm de 1 dakika santrifüj yapılarak DNA izolasyon aşaması bitirildi. 11. DNA C de saklandı. 12. DNA izolasyon başarısı %1 lik agaroz jelde kontrol edildi Mikrosatellit Markır Analizi İçin PCR İşlemi Bu çalışmada, tek hücre PCR ında kullanılmak üzere seçilen, beta globin gen bölgesine bağlı (linked) D11S4891 ve D11S2362, bağlı olmayan (unlinked) D13S314 ve GABRB3 toplam 4 adet mikrosatellit markır kullanıldı. D11S4891 ve D11S kromozom üzerinde beta globin (HBB) geni ile bağlı, 44

66 D13S kromozom üzerinde Wilson hastalığı geni (ATP7B) ile bağlı ve 15. kromozom üzerinde GABRB3, Prader Willi / Angelman gen bölgesinde GABA A reseptörü b3 lokusunda yer almaktadır ( , 137). D11S4891, D13S314 ve GABRB dinükleotid, D11S2362 trinükleotid tekrar dizilerinden oluşmaktaydı. Kullanılan markırlara ait primerler, PCR ürün büyüklükleri, tekrar dizileri Tablo 4 de verilmiştir. Tablo 4. Mikrosatellit markır analizinde kullanılan markırların primer dizileri, PCR ürün büyüklükleri ve tekrar dizileri. * olan primerler FAM ile işaretli olarak sentez edilmiştir. (F: Forward, R: Reverse) Markır Primer Dizileri PCR Ürün Büyüklüğü (bp) Tekrar Dizisi D11S4891 D11S2362 D13S314 GABRB3 F:*5 GGAAATGGACCTCTGTCTC TG R: 5 CTTTTATTCCAGCCCCAC 3 F:*5 TGGACTATAGGACCCCCTTC TAA R:5 GAGAACAGCCTGTCACACCT 3 F:*5 GAGTGGAGGAGGAGAAAAGA CA R:5 GTGTGACTGGATGGATGTGA 3 F:5 CTCTTGTTCCTGTTGCTTTCAATACAC CA R:*5 CACTGTGCTAGTAGATTCAGCTC 3 Her bir örnek için hazırlanan total PCR reaksiyon karışımı 25 µl 'dir. Distile H 2 O, 10X buffer, MgCl 2 (25mM), dntp (4x25 µ mol), primerler ve Taq polimerazdan oluşan karışım 0,2 ml lik her bir reaksiyon tüpüne dağıtıldı ve en son DNA örnekleri eklendi. (Tablo 5). 45

67 Tablo 5. PCR işleminde kullanılan malzemeler ve miktarları Kullanılan Malzeme Miktar (µl) Distile H 2 O x Buffer 2.5 MgCl dntp 1 D11S4891, D11S2362, D13S314, GABRB3 F ve R primerleri 0.5 er (Toplam 4) Taq polimeraz 0.5 DNA 5 TOPLAM 25 Hazırlanan tüpler, thermal cycler a yerleştirildi ve ilgili PCR koşulları ile polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirildi (Tablo 6). Amplifikasyon ürünleri PCR programı bittikten sonra +4 0 C'de ışık almayan bir yerde saklandı. 46

68 Tablo 6. Heterozigotluk araştırması amaçlı mikrosatellit markır analizinde kullanılan PCR basamakları İşlem Sıcaklık Süre Döngü sayısı Denatürasyon 95 0 C 3 dakika 1 Denatürasyon 95 0 C 30 saniye Bağlanma 55,5 0 C 30 saniye 34 Uzama 72 0 C 45 saniye Final uzama 72 0 C 9 dakika Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçlarının Görüntülenmesi Her bir PCR ürünü için 10 µl formamid ve 0.5 µl ROX karışımı hazırlandı ve üzerine 2.5 µl PCR ürünü eklendi. Her bir PCR ürününe, ABI 3100 cihazında mikrosatellit analizi programında kapiller elektroforez uygulandı. ROX size standart a göre FAM florasan boyasıyla işaretli pikler elde edildi ve büyüklükleri baz çifti (bp) olarak kaydedildi Allel Frekansı ve Heterozigotluk Oranının Hesaplanması Türk toplumundan rastgele seçilen 100 bireyden toplam 200 allelde bu markırlar incelendi. Her bir mikrosatellit markır için bulunan allellerin büyüklükleri baz çifti (bp) cinsinden tek tek yazıldı. Görülme sıklıklarına göre 47

69 alleller sıralandı ve her bir allelin frekansı hesaplandı. Frekans hesaplaması, her bir lokusta saptanmış olan her bir allelin görülme sayısı toplam allel sayısı olan 200 e bölünerek hesaplandı. Her bir lokus için allel frekansları hesaplandığı için, beklenen (expected) heterozigotluk oranı formülüne göre hesaplandı (Pi: i allelinin frekansı). Gözlenen (observed) heterozigotluk oranı, çalışma grubumuzdaki heterozigotların sayısının toplam gönüllü sayısı olan 100 e bölünmesiyle elde edildi. Çalışmada kullandığımız toplam 4 lokus için ortak heterozigotluk oranı ise, 4 lokusa ait gözlenen heterozigotluk oranlarının aritmetik ortalaması alınarak hesaplandı. Heterozigotluk oranları MSTools programı kullanılarak doğrulandı ( Periferik Kandan Tek Hücre (Lenfosit) Ayrıştırması ve DNA İzolasyonu Çalışma Protokolü Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı na, beta talasemi prenatal tanısı için başvurmuş olan olgulardan, heterozigot veya bileşik heterozigot mutasyon taşıyıcısı çocukları olan çiftler dosya taraması ile tespit edildi. Heterozigot veya bileşik heterozigot mutasyon taşıması, her iki allelin de PCR sonucunda çoğalıp çoğalmadığını test etmek amacıyla önemliydi. Ebeveyn ve çocukların beta talasemi mutasyonları, daha önceden yapılan testler sonucunda bilinmekteydi. Toplam 32 birey (10 çift, birer çocukları, 2 hasta çocuk) çalışmaya dahil edilmiştir. Çalışmaya dahil edilen tüm bireylerin beta talasemi mutasyon analizleri, çalışma öncesinde sekans analiziyle konfirme edilmiştir. Ebeveynlerden 2 şer ml, çocuklarından 5 er ml EDTA lı 48

70 periferik kan örnekleri alındı. Ebeveynlerin ve hasta olan 2 çocuğun periferik kandan DNA izolasyonları bölüm de belirtilen şekilde yapıldı. Toplam 10 çocuktan alınan periferik kan örneklerine ise en geç 2 saat içerisinde taze olarak lenfosit ayrıştırması işlemi uygulandı Periferik Kandan Tek Hücre (Lenfosit) Ayrıştırması Beta talasemi mutasyonunu heterezigot veya bileşik heterozigot olarak taşıdığı bilinen toplam 10 çocuktan alınan periferik kandan lenfosit ayrıştırması Histopaque 1083 (Sigma) kullanılarak yapıldı. Polisukroz (64 g/l) ve sodyum diatrizoat (100 g/l) içeren karışım, periferik kandan canlı mononükleer hücrelerin elde edilmesine kullanılmaktadır (106). Tüm kullanılan malzemelerin steril olması, laminar flow altında çalışılması ve kontaminasyona azami dikkat edilmesi gerekmektedir. Çalışma öncesinde steril cam pipetlerden alev kaynağı kullanılarak yaklaşık 6 ųl iç çaplı mikro pipetler yapıldı. İşlem basamakları olarak aşağıdaki yöntem uygulanmıştır (107). karıştırıldı. 1. Falkon tüpe 2,5 ml EDTA lı kan ve 2,5 ml steril NaCl eklendi ve 2. Ayrı bir falkona 8,5 ml Histopaque 1083 kondu ve üzerine yavaş bir şekilde ilk falkon tüpteki kan ve NaCl den oluşan karışım eklendi. 3. Yirmibeş dakika, 2000 rpm de 13,5 ml lik yeni karışım santrifüj edildi. 4. Santrifüj sonrası mononükleer hücrelerin bulunduğu faz (halka) gözükmektedir (Şekil 8). 49

71 5. Yeni bir falkon tüpe, lenfosit fazı cam pipet yardımıyla alındı ve steril distile su ile 5 ml ye tamamlandı. 6. Karışım petri kabına kondu ve gerektiği takdirde distile su ile daha da dilue edildi. Ağız pipeti ve mikro pipet yardımıyla, faz-kontrast mikroskop altında lenfositler tek tek yakalandı ve içerisinde 10 µl distile su bulunan 0,2 ml lik ependorf tüplere kondu. 7. Her bir olgu için 10 adet tek lenfosit ayrıştırıldı (Toplamda 100 adet tek hücre). 1 tane tüp ise içerisinde sadece 10 µl distile su (negatif kontrol) olacak şekilde bırakıldı. Şekil 8. Mononükleer hücre elde etmek için kullanılan yöntemin şematik görünümü 50

72 2.4.2 Tek Hücrede (Lenfosit) PCR işlemi Bu basamaktan sonra lizis PCR a kadar aşağıdaki yöntemle devam edildi (108). Tek hücre PCR işleminde ise FastStart High Fidelity PCR System, dntpack (Roche) kiti kullanıldı. 1. Tek lenfosit ayrıştırma işleminden sonra, her bir olgu için toplam 11 adet olan 0,2 lik ependorf tüpler C de minimum 30 dakika bekletildi. 2. Daha sonra oda sıcaklığına getirilen tüpler, içindeki su eridikten sonra, su kontrol hariç diğer tüm tüplere 5 er µl proteinaz K eklendi. Bir tane 0,2 lik tüp proteinaz K negatif kontrol olarak çalışmaya eklendi. (Liofilize olarak gelen 25 mg proteinaz K 1,25 ml disitle suda çözündü ve C de stok olarak saklandı). 3. Toplam 12 örnek için lizis PCR işlemi uygulandı. Enzim aktivasyonu 37 0 C de 45 dakika ve 65 0 C de 10 dakika enkübe edilerek; enzim deaktivasyonu ise 97 0 C de 5 dakika enkübe edilerek sağlandı (Tablo 7). Bu işlem yaklaşık olarak 1 saat 12 dakika sürmektedir. Tablo 7. Lizis PCR basamakları Sıcaklık Süre Döngü sayısı 37 0 C 45 dakika C 10 dakika C 5 dakika C 10 dakika 1 51

73 4. FastStart High Fidelity PCR System, dntpack (Roche) kiti kullanılarak tek hücrede PCR işlemi uygulandı. Beta 1 ve beta 2 primerleri ile beta globin gen bölgesinin ilk yarısı (mutasyonların büyük çoğunluğunu kapsayan gen bölgesi) çoğaltıldı ( ) (Şekil 9). IVSII-1 mutasyonu, bu çoğaltılan bölgenin dışında kalmaktaydı. Sadece IVSII-1 mutasyonu için IVSII-1 EXT ve Nested 4 primerleri kullanıldı. Mikrosatellit markırlar (D11S4891, D11S2362, D13S314, GABRB3) kontaminasyon, allel dropout gibi istenmeyen durumları test etmek için kullanıldı. Beta 1, beta 2, IVSII-1 EXT ve nested 4 primer dizileri Tablo 8 de verilmiştir. Kullanılan malzemeler ve miktarları Tablo 9 da verilmiştir. Şekil 9. Beta globin (HBB) geni şematik görünümü. Kırmızı kutular ekzonları, beyaz kutular intronları göstermektedir. Gen üzerinde en sık gözlenen mutasyonlar aşağı yönde ok ile işaretlenmiştir. IVSII-1 mutasyonu gen üzerinde kesikli ok işaretiyle gösterilmiştir. Beta 1 - beta 2 ve nested 4 IVSII-1 EXT primerlerinin kapsadığı gen bölgeleri karşılıklı iki koyu ok ile gösterilmiştir. 52

74 Tablo 8. HBB geninin belirli bölgesini çoğaltmak için kullanılan primerlerin dizileri, PCR ürün büyüklükleri PRİMER PRİMER DİZİLERİ PCR ÜRÜN BÜYÜKLÜĞÜ (bp) Beta 1 (F) 5 GAAGTCCAACTCCTAAGCCA 3 Beta 2 (R) 5 CATCAAGCGTCCCATAGACTC 3 Nested 4 (F) 5 CAACTGTGTTCACTAGCAAC 3 IVSII-1 EXT (R) 5 -TAAAAGAAACTAAAACGATCC Tablo 9. Tek hücre PCR işleminde kullanılan malzemeler ve miktarları Kullanılan Malzeme Miktar (µl) Distile H 2 O 24,9 MgCl 2 İçeren 10x Reaksiyon Miksi 5 DMSO 1 Nükleotid miks 1 Beta 1 ve Beta 2 primerleri (IVS II-1 için IVSII-1 EXT ve Nested 4) 0,5 er (Toplam 1) D11S4891, D11S2362, D13S314, GABRB3 Forward (F) ve reverse (R) primerleri 0,2 şer (Toplam 1,6) Enzim miks 0,5 TOPLAM 35 53

75 5. PCR kabini içerisinde, kontaminasyona azami dikkat ederek her olgu için 10 lenfosit, 1 su negatif, 1 proteinaz k negatif, anne, baba ve PCR negatif olmak üzere toplam 15 reaksiyonluk PCR miks hazırlandı. 6. İçerisinde tek lenfosit bulunan toplam 10 tüpe, 1 su negatif, 1 proteinaz k negatif ve PCR negatife 35 er µl PCR miksten konuldu. Anne ve baba için ayrı 2 tüp hazırlandı ve içerisine 13 er µl distile su ve üzerine 35 er µl PCR miksten konuldu. Son olarak anne ve baba genomik DNA ları 2 şer µl ilgili tüplere eklendi. Böylece tüm tüplerde 50 µl final hacime ulaşılmış oldu. 7. PCR aşağıda belirtilen şekilde uygulandı (Tablo 10). Bu işlem yaklaşık olarak 2 saat 33 dakika sürmektedir. Tablo 10. Tek hücre PCR işlemi PCR basamakları İşlem Sıcaklık Süre Döngü sayısı Denatürasyon 95 0 C 15 dakika 1 Denatürasyon 95 0 C 45 saniye Bağlanma 60 0 C 1 dakika 36 Uzama 72 0 C 1 dakika Final uzama 72 0 C 15 dakika 1 Soğutma 4 0 C 1 54

76 2.5. Nested, Real-time PCR Real-time PCR işlemi Light Cycler (Roche) cihazı ve Light Cycler Faststart DNA Master HybProbe (Roche) kiti kullanılarak uygulandı. Nested PCR olarak dizayn edilen bu işlemde, mutasyon saptaması erime eğrisi analizi yöntemiyle yapıldı. Kullanılan tüm problar, çalışma öncesinde genomik DNA ve 1/1000 oranında dilue edilmiş genomik DNA ile çalışılarak test edildi. 1. Tek hücre PCR ından alınan örneklerin her birisi için, içerisinde 1 ml distile su bulunan 1,5 luk ependorf tüpler hazırlandı. Her birinin içerisine ilgili PCR ürününden 1 er µl alınıp karıştırıldı. 2. Light Cycler Faststart DNA Master HybProbe (Roche) kiti kullanılarak nested PCR miksi hazırlandı (Tablo 11). Nested 1 ve nested 2 primerleri HBB genindeki çoğu mutasyonu kapsamaktadır. Sadece IVSII-1 mutasyonunu için nested 3 ve nested 4 primerleri kullanılmıştır (Tablo 12). Kullanılan tüm problar Tablo 13 de ve Şekil 10 da verilmiştir. 55

77 Tablo 11. Nested PCR miksi hazırlanırken kullanılan malzemeler ve miktarları. Prob X ve Y olguya göre değişmektedir. Kullanılan Malzeme Miktar (µl) Distile H 2 O 6,4 MgCl 2, 25 mm 1,6 Nested 1 (IVSII-1 için Nested 4) 2 Nested 2 (IVSII-1 için Nested 3) 2 Prob X 2 Prob Y 2 Enzim miks 2 TOPLAM 18 Tablo 12. Nested PCR da kullanılan primerlerin dizileri, PCR ürün büyüklüğü Primer Primer Dizileri PCR Ürün Büyüklüğü (bp) Nested 1 (F) 5 GCTGTCATCACTTAGACCTCA 3 Nested 2 (R) 5 CACAGTGCAGCTCACTCA 3 Nested 4 (F) 5 CAACTGTGTTCACTAGCAAC 3 Nested 3 (R) 5 AAACGATCCTGAGACTTCCA

78 Tablo 13. Light Cycler da kullanılan problar, tarayabildikleri örnek mutasyonlar, prob dizileri, erime ısıları (Tm) ve mutasyon saptamada kullandıkları diziler Prob Set Mutasyon Hibridizasyon Prob Dizileri Tm ( 0 C) Mutasyon Saptama A IVSII-745 (C>G) (CAP+20 C>T) Acceptor: 5 LCRed705-CCTCAAA CAGACACCATGGTGCACCTG-P3 Donör: 5 -TTCTGACACAACTGTGT TCACTAGCA-FITC-3 69,3 59 Normal dizi B C Cd5 (-CT) Cd6 (-A) Cd8 (-AA) Cd8/9 (+G) HbS Cd6 (A>T) Acceptor: 5 LCRed640-GACTCCT GAGGAGAAGTCTGC-P-3 Donör: 5 -CCTCAAACAGACACCA TGGTGCACC-FITC-3 Acceptor: 5 -CTCCTGTGGAGAA GTCTGC- LCRed640-3 Donör: 5 -FITC-GTTACTGCCCTGT GGGGCAAGGTGAACGTGGATGA-3 55,8 66,7 52,5 79 Normal dizi Mutant dizi IVSI-1 (G>A, G>T) D E IVSI-2 (T>G, T>C, T>A) IVSI-5 (G>A, G>C, G>T) IVSI-6 (T>C) IVSI-110 (G>A) IVSI-116 (T>G) Acceptor: 5 LCRed705-TGTAACC TTGATACCAACCTGCCCA-P-3 Donör: 5 -TGCCCAGTTTCTATTGG TCTCCTTAAACCTGTC-FITC-3 Acceptor: 5 LCRed640-CCCTTAG GCTGCTGGTGGTCTAC-P-3 Donör: 5 -TCTGCCTATTGGTCTATT TTCCC-FITC-3 63,7 68,2 62,8 56,5 Normal dizi Normal dizi F Cd39 (C>T) Cd37 (TGG>TGA) Cd41/42 (-TTCT) Acceptor: 5 LCRed705-ACCCTTG GACCCAGAGGTTCTT-P-3 Donör: 5 -CCCTTAGGCTGCTGG TGGTC-FITC-3 60,3 61,3 Normal dizi G IVSII-1 (G>A) Acceptor: 5 LCRed640-TCTCAGG ATCCACGTGCAGCTTG-P-3 Donör: 5 -GTCCCATAGACTCACCCT GAAG-FITC-3 64,7 56,1 Normal dizi 57

79 Şekil 10. Light Cycler da kullanılan hibridizasyon probları, kapsadıkları örnek mutasyonlar. Şekil HBB genini temsil etmektedir. Mutasyonlar bulundukları yerlerinde ok işaretleriyle belirtilmiş ve altında kapsadıkları ilgili Light Cycler prob setleri gösterilmiştir 3. Kullanılan Light Cycler problarından sadece HbS ye özgü prob, mutant diziyi saptaycak şekilde dizayn edilmiş olup diğer tüm problar normal diziyi tanıyacak şekilde sentezlettirilmiştir. IVSII-745 mutasyonu amplifiye edilen 58

80 bölgenin dışında kalmaktadır. Ancak bu mutasyonun HBB geninin 5 translasyona uğramayan bölgesindeki (5 UTR) polimorfik baz değişimi (+20C>T) ile cis durumda olduğu; dolayısıyla IVSII-745 ile +20C>T polimorfizminin birlikte gözlendiği belirtilmiştir (111). Şekil 10 da gösterilen A probu, bu polimorfizmi içine alan ancak normal diziyi tanıyacak şekilde sentezlenmiştir. Çalışmada her olgu için ilgili mutasyonu kapsayan prob setleri kullanılmıştır. 4. Nested PCR için miks, olgu başına 16 reaksiyonluk hazırlandı (Lenfosit 1-10, anne, baba, su negatif, proteinaz k negatif, 1. PCR negatif, LC negatif). Soğuk blok üzerine dizilen 20 µl lik LC kapillerlerine (Roche) 18 er µl miks dağıtıldı. 5. Lenfosit 1-10, anne, baba, su negatif, proteinaz k negatif, 1. PCR negatif için sulandırılmış ilk PCR ürünlerinden ilgili kapillerlere 2 şer µl eklendi ve kapillerlerin üst kapakları kapatıldı. LC negatif için 2 µl reaksiyonda kullanılan su konuldu ve kapatıldı. 6. Tüm kapillerler en fazla 2000 rpm de 10 saniye kadar santrifüj edildi, reaksiyon karışımının her bir kapiller tüpün dibine çöktüğü kontrol edildi ve LC cihazına yüklendi. Cihazda ilk olarak nested PCR yapılıp daha sonra erime eğrisi analizi ile mutasyon tespiti ve genotiplendirme yapılmıştır. İşlemde kullanılan parametreler Tablo 14 de verilmiştir. 59

81 Tablo 14. LC cihazında kullanılan nested PCR ve mutasyon saptama program koşulları İşlem Hedef Derece ( 0 C) İnkübasyon Süresi (sn) Isı Geçiş Oranı ( 0 C/sn) Denatürasyon Amplifikasyon Erime Eğrisi Analizi ,3 1 Soğutma Döngü Sayısı 7. İşlem sonrasında ilgili mutasyona özgü F2 (LC Red 640) veya F3 (LC Red 705) kanalından erime eğrisi (melting curve) analizi işaretlenerek mutasyonlar incelenip kaydedildi. Mutasyonlar bilindiğinden dolayı amplifikasyon başarısızlığı, allel dropout, kontaminasyon durumları kolaylıkla incelenebildi Tek Hücre Çalışmasında Kullanılan Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçlarının Görüntülenmesi 1. Light Cycler işlemi devam ederken, ilk PCR ürünlerinden mikrosatellit markır analizi yapıldı. İlk PCR multipleks olarak dizayn edilmiş olup hem HBB geninin belirli bir bölgesini, hem de mikrosatellit markırları çoğaltmaktadır. 2. Her bir PCR ürünü için 10 µl formamid ve 0,5 µl ROX karışımı hazırlandı ve üzerine 2,5 µl PCR ürünü eklendi. Her bir PCR ürününe, ABI

82 cihazında mikrosatellit analizi programında kapiller elektroforez uygulandı. ROX size standart a göre FAM florasan boyasıyla işaretli pikler elde edildi ve boyutları baz çifti (bp) olarak kaydedildi. Anne, baba ve çocuklarına ait tek lenfositlerin pikleri karşılaştırıldı. Allel dropout, kontaminasyon durumları incelendi. 61

83 2.7. Tek Hücre Analizinde Uygulanan Tüm İşlem Basamaklarının Özeti Çalışma boyunca kullanılan işlem basamakları Şekil 11 de özetlenmiştir. Şekil 11. Tek hücre analizinde uygulanan tüm işlem basamaklarının özeti. Tek hücre izolasyonu, hücenin lizis aşamaları, lizis PCR, anne ve baba genomik DNA larının ve mikrosatellit markırların eklenmesiyle gerçekleştirilen multipleks PCR, Light Cycler cihazında yapılan nested PCR ve mutasyon tespiti analizleri ve yaklaşık zamanları 62

84 BÖLÜM III BULGULAR 3.1 Heterozigotluk Araştırması Amacıyla Yapılan Mikrosatellit Markır Analizi Bulguları Çalışma Grubunun Genel Özelliklerinin Karşılaştırılması Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı na 2009 yılında başvuran olgulardan rastgele, akraba olmadığı bilinen 50 erkek, 50 kadın olmak üzere toplam 100 olgu seçildi. Bu olguların cinsiyetleri, yaşları ve doğum yerleri kaydedildi. Ortalama yaş 28,85 ± 19,48 olarak saptandı. En düşük yaş 1 iken en yüksek yaş 65 olarak saptandı. Olguların 44 ü (%44) İzmir doğumlu olarak kaydedildi. Sırasıyla 13 kişi (%13) Manisa, 10 kişi Muğla (%10), 9 kişi Aydın (%9), 5 kişi Uşak (%5), 4 kişi Afyon (%4) ve 15 kişi (%15) diğer il doğumlu olarak saptandı (Şekil 12). 63

85 2% 2% 3% 4% 5% 9% 10% 13% 44% İzmir Manisa Muğla Aydın Uşak Afyon Kütahya Çanakkale Balıkesir Antalya Ardahan Adana Diyarbakır Ağrı Bursa Konya Malatya Şekil 12. Mikrosatellit markırların heterozigotluk çalışması amacıyla seçilen 100 olgunun doğum yerleri. Antalya, Ardahan, Adana, Diyarbakır, Ağrı, Bursa, Konya grafikte % 1 ile temsil edilmektedir Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçları Rastgele seçilen 100 bireyden toplam 200 allelde bu markırlar incelendi. Her olgu için her lokusta heterozigot ya da homozigot olma durumlarına göre genotiplendirme yapıldı ve ürün büyüklükleri baz çitfi olarak kaydedildi (Ek 1) Mikrosatellit Markır Analizi İstatistik Sonuçları Her lokus için, görülme sıklıklarına göre saptanan tüm alleller sıralandı ve 200 allel içerisinde kaç kez görüldükleri kaydedildi. Allel frekansları, bölüm de bahsedilen şekilde hesaplandı. (Tablo 15, Şekil 13). 64

86 Şekil 13. Bir olguya ait mikrosatellit markır analizi sonucu. D11S4891, D13S314, GABRB3 ve D11S2362 markırları ve üzerlerinde baz çifti (bp) olarak bulunan değerleri verilmiştir. Tablo 15. D11S4891, D13S314, GABRB, D11S2362 mikrosatellit markırları için saptanan alleller, boyutları (s), allel sayıları (n) ve allel frekansları (f) D11S4891 D13S314 GABRB3 D11S2362 S (bp) n f S (bp) n f S (bp) n f S (bp) n f , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,02 TOPLAM

87 Beklenen (expected) ve gözlenen (observed) heterozigotluk oranları Tablo 16 da verilmiştir. Çalışmada kullanılan toplam 4 lokus için ortak gözlenen heterozigotluk oranı ise %80 olarak hesaplandı. Tablo 16. D11S4891, D13S314, GABRB3, D11S2362 mikrosatellit markırları için saptanan allel sayısı, beklenen ve gözlenen heterozigotluk oranları Mikrosatellit Bulunan Allel Beklenen Gözlenen Markır Sayısı Heterozigosite Heterozigosite D11S %73 %85 D13S %87 %79 GABRB3 11 %77 %74 D11S %82 % Periferik Kandan Tek Hücre (Lenfosit) Ayrıştırması, DNA İzolasyonu ve Tek Hücre PCR Sonuçları Çalışma Grubunun Genel Özelliklerinin Karşılaştırılması Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı na, yılları arasında beta talasemi prenatal tanısı için başvurmuş olan 10 çift, 9 heterozigot ve 1 bileşik heterozigot mutasyona sahip birer çocukları ile birlikte toplam 30 bireyin bilgileri Tablo 17 de verilmiştir. Toplam 10 probandın 8 i kız, 2 si erkekti. Probandların yaşları 4 ay 26 yaş aralığında bulunmaktaydı. Ebeveynler arasında akrabalık, 1 aile dışında belirtilmedi. Farklı probları denemek amacıyla farklı mutasyonlara sahip olgular seçilmeye özen gösterildi. 66

88 Tablo 17. Toplam 10 çocuğa ait yaş, mutasyon, ebeveyn mutasyon ve ebeveynlerin akrabalık durumları bilgileri (K: Kadın, E: Erkek, HET: Heterozigot) Olgu Yaş Cinsiyet Mutasyon Anne Baba Akrabalık No Mutasyonu Mutasyonu 1 4 ay K IVSI.1 HET IVSI.1 HET IVSI.1 HET Yok 2 1 yaş K CD39 HET IVSI.110 HET CD39 HET Yok 3 7 ay K HbS HET HbS HET HbS HET Yok 4 26 yaş K CD39 HET CD39 HET CD39 HET Yok 5 11 yaş K IVSI.110 HET IVSI.110 HET IVSI.110 HET Yok 6 11 yaş K IVSI.110 HET IVSI.110 HET IVSI.110 HET Yok 7 14 yaş E IVSI.6 HET IVSI.6 HET IVSI.6 HET Yok 8 4 ay E CD8 HET CD8 HET CD8 HET Yok 9 7 yaş K IVSI.110/IVSII- IVSI.110 HET IVSII-745 Yok 745 HET 10 6 ay K IVSII-1 HET IVSII-1 HET IVSII-1 HET Var Tek hücre PCR ve Mikrosatellit Markır Analizi Sonuçları Tüm olgular için toplam 10 adet tek lenfositten, ebeveynlerin ve varsa hasta çocukların genomik DNA sından PCR işemi uygulandı. Nested PCR sonucu elde edilen mutasyon sonuçları ve ilk PCR dan elde edilen mikrosatellit markır analizleri her olgu için aşağıda verilmiştir. 67

89 a) Olgu 1: IVSI.1 heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 4 aylık kız olgu. Anne ve babası da aynı mutasyonu taşımaktaydı ve akrabalık belirtmediler. Başka çocukları yok ve aile öyküsünde ek bir bulgu saptanmadı. Tüm lenfositler, anne ve baba IVSI.1 heterozigot olarak saptandı (Şekil 14). Şekil 14. Olgu 1 için D prob seti kullanılarak elde edilen anne, baba ve tek lenfosite ait LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~61 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~52 0 C) mutant alleli (IVSI-1) göstermektedir. Mutasyon taşımayan olguya ait patern Normal olarak gösterilmiştir. Negatiflere ait patern aşağıda görülmektedir. 68

90 Anne, baba ve lenfositlere (olgu) ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 18, Şekil 15). Şekil 15. Sırasıyla tek lenfositlerden birine ait, anne ve babanın mikrosatellit markır analizi sonuç görüntüsü Tablo 18. Olgu 1, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) ( bp) ( bp) ( bp) ( bp) Olgu Anne Baba

91 b) Olgu 2: CD39 heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 1 yaşında kız olgu. Annesi IVSI-110 heterozigot ve babası CD39 heterozigot mutasyonu taşımaktaydı ve akrabalık belirtmediler. Aile öyküsünde ek bir bulgu saptanmadı. Tüm lenfositler CD39 heterozigot, anne IVSI-110 heterozigot ve baba CD39 heterozigot olarak saptandı (Şekil 16-17). Şekil 16. Olgu 2 için E prob seti kullanılarak IVSI-110 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~61 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~56 0 C) mutant alleli (IVSI-110) göstermektedir. Negatife ait patern aşağıda görülmektedir. Bu analizde, annenin IVSI-110 için heterozigot, baba ve lenfositin normal olduğu gözlenmektedir (Babanın IVSI-110 allelini taşımadığı biliniyor). 70

92 Şekil 17. Olgu 2 için F prob seti kullanılarak CD39 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~66 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~58 0 C) mutant alleli (CD39) göstermektedir. Negatife ait patern aşağıda görülmektedir. Bu analizde, baba ve lenfositin CD39 için heterozigot, annenin ise normal olduğu gözlenmektedir (Annenin CD39 allelini taşımadığı biliniyor). 71

93 Anne, baba ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 19). Tablo 19. Olgu 2, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) ( bp) ( bp) ( bp) ( bp) Olgu Anne Baba

94 c) Olgu 3: HbS heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 7 aylık kız olgu. Anne ve babası da aynı mutasyonu taşımaktaydı ve akrabalık belirtmediler. Çiftin HbS taşıyıcısı olan başka bir kız çocuğu var. Aile öyküsünde ek bir bulgu saptanmadı. Tüm lenfositler, anne ve baba HbS heterozigot olarak saptandı (Şekil 18). Şekilde Lenfosit 2 olarak adlandırılan lenfositte ADO gözlendi. Sadece mutant allelin amplifikasyonu çok belirginken, normal allelin amplifiye olamadığı düşünüldü. D11S4891 ve D11S2362 markırlarında heterozigot durum gözlendiğinden dolayı, ADO nun sadece beta globin genini ilgilendirdiği şeklinde yorumlandı. Şekil 18. Olgu 3 için C prob seti kullanılarak HbS için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~63 0 C) mutant alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~54 0 C) normal alleli göstermektedir. Lenfosit 2 de allel dropout olduğu düşünüldü. HbS için normal olan bir olgunun paterni de şekilde gösterilmiştir 73

95 Anne, baba ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 20). Tablo 20. Olgu 3, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) ( bp) ( bp) ( bp) ( bp) Olgu Anne Baba

96 d)olgu 4: CD39 heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 26 yaşında kız olgu. Anne ve babası da aynı mutasyonu taşımaktaydı ve akrabalık belirtmediler. Çiftin 1 tane 2,5 aylık abortus öyküleri mevcut. Bir lenfositte amplifikasyon sağlanamadı; diğer lenfositler, anne ve baba CD39 heterozigot olarak saptandı (Şekil 19). Şekil 19. Olgu 4 için F prob seti kullanılarak CD39 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~66 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~58 0 C) mutant alleli göstermektedir. Bu analizde anne, baba ve lenfositin CD39 için heterozigot olduğu gözlenmektedir. Ayrıca CD39 alleli taşımayan normal bir olguya ait patern de gösterilmiştir. 75

97 Anne, baba ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 21). Tablo 21. Olgu 4, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) ( bp) ( bp) ( bp) ( bp) Olgu Anne Baba

98 e) Olgu 5: IVSI-110 heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 11 yaşında kız olgu. Anne ve babası da aynı mutasyonu taşımaktaydı ve akrabalık belirtmediler. Çiftin IVSI-110 homozigot hasta kız çocukları var. Tüm lenfositler, anne ve baba IVSI-110 heterozigot olarak saptandı (Şekil 20). Şekil 20. Olgu 5 için E prob seti kullanılarak IVSI-110 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~61 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~56 0 C) mutant alleli göstermektedir. Bu analizde, anne, baba ve lenfositin IVSI-110 için heterozigot olduğu gözlenmektedir 77

99 Anne, baba ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 22). Tablo 22. Olgu 5, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) ( bp) ( bp) ( bp) ( bp) Olgu Anne Baba

100 f) Olgu 6: IVSI-110 heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 11 yaşında kız olgu. Anne ve babası da aynı mutasyonu taşımaktaydı ve akrabalık belirtmediler. Çiftin 1 tane IVSI-110 homozigot hasta kız ve 1 tane normal erkek çocukları var. Tüm lenfositler, anne ve baba IVSI-110 heterozigot olarak saptandı (Şekil 21). Şekil 21. Olgu 6 için E prob seti kullanılarak IVSI-110 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~61 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~56 0 C) mutant alleli göstermektedir. Bu analizde, anne, baba ve lenfositin IVSI-110 için heterozigot olduğu gözlenmektedir 79

101 Anne, baba ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 23). sonuçları Tablo 23. Olgu 6, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) ( bp) ( bp) ( bp) ( bp) Olgu Anne Baba

102 g) Olgu 7: IVSI-6 heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 14 yaşında erkek olgu. Anne ve babası da aynı mutasyonu taşımaktaydı ve akrabalık belirtmediler. Çiftin 1 tane IVSI-6 homozigot hasta erkek çocuğu 15 yaşındayken ex olmuş ve yaşayan 1 tane IVSI-6 homozigot hasta erkek çocukları var. Hasta çocuğa ulaşılamadığından dolayı çalışmaya alınamamıştır. Tüm lenfositler, anne ve baba IVSI-6 heterozigot olarak saptandı (Şekil 22). Şekil 22. Olgu 7 için D prob seti kullanılarak IVSI-6 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~67 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~53 0 C) mutant alleli göstermektedir. 81

103 Anne, baba ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 24). Tablo 24. Olgu 7, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) ( bp) ( bp) ( bp) ( bp) Olgu Anne Baba

104 h) Olgu 8: CD8 heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 4 aylık erkek olgu. Anne ve babası da aynı mutasyonu taşımaktaydı ve akrabalık belirtmediler. Çiftin 1 tane CD8 homozigot hasta kız çocukları var. Bu çalışmada, olguya ek olarak hasta olan bireyden de periferik kan alınıp genomik DNA elde edildi. Bu olgunun da PCR ı anne ve babayla beraber çalışıldı. Tek hücre (lenfositler), anne ve baba IVSI-6 heterozigot olarak saptandı. Homozigot hasta olan çocukları ise IVSI-6 homozigot olarak saptandı. (Şekil 23). Şekil 23. Olgu 8 için B prob seti kullanılarak CD8 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~67 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~57 0 C) mutant alleli göstermektedir. CD8 alleli taşımayan bir olguya ait patern Normal olarak gösterilmiştir 83

105 Anne, baba, hasta çocuk ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 25). Mutant alleler, hasta çocuğun allellerine göre, D11S4891 ve D11S2362 bağlı markırlar baz alınarak belirlenmiştir. Tablo 25. Olgu 8, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları. * ile işaretli alleller mutant allelleri göstermektedir Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) ( bp) ( bp) ( bp) ( bp) Olgu Hasta Çocuk Anne 101 * * Baba 101 * *

106 i) Olgu 9: IVSI-110 / IVSII-745 bileşik heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 7 yaşında beta talasemi hastası kız olgu. Annede IVSI-110 heterozigot, babada IVSII-745 heterozigot mutasyon bulunmaktaydı. Akrabalık belirtmediler. Tüm bireylere ait mutasyonlar doğru olarak saptandı (Şekil 24-25) Şekil 24. Olgu 9 için E prob seti kullanılarak IVSI-110 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~61 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~56 0 C) mutant alleli göstermektedir. Bu analizde, annenin ve lenfositin IVSI-110 için heterozigot, babanın normal olduğu gözlenmektedir (Babanın IVSI-110 allelini taşımadığı biliniyor). 85

107 Şekil 25. Olgu 9 için A prob seti kullanılarak IVSII-745 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~67 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~60 0 C) mutant alleli göstermektedir. Bu analizde, babanın ve lenfositin IVSII-745 için heterozigot, annenin normal olduğu gözlenmektedir (Annenin IVSII-745 allelini taşımadığı biliniyor). Anne, baba ve lenfositlere ait mikrosatellit markır analizleri aşağıda verilmiştir (Tablo 26). Tablo 26. Olgu 9, anne ve babasına ait mikrosatellit markır analizi sonuçları Olgu D11S4891 (TG) D13S314 (CA) GABRB (CA) D11S2362 (TAA) ( bp) ( bp) ( bp) ( bp) Olgu Anne Baba

108 j) Olgu 10: IVSII-1 heterozigot mutasyon taşıdığı bilinen 6 aylık kız olgu. Anne ve babası da aynı mutasyonu taşımaktaydı ve çiftler arasında birinci derece kuzen evliliği bulunmaktaydı. Çiftin 1 tane IVSII-1 homozigot hasta erkek çocukları var. Bu çalışmada, olguya ek olarak hasta olan bireyden de periferik kan alınıp genomik DNA elde edildi. Bu olgunun da PCR ı anne ve babayla beraber çalışıldı. Bir lenfositte amplifikasyon sağlanamadı; diğer lenfositler, anne ve baba IVSII-1 heterozigot olarak saptandı. Homozigot hasta olan çocukları ise IVSII-1 homozigot olarak saptandı. (Şekil 26). Şekil 26. Olgu 10 için G prob seti kullanılarak IVSII-1 için yapılan LC erime eğrisi analizi. Mavi çizgi ile işaretlenen pik (~65 0 C) normal alleli, kırmızı ile işaretlenen pik (~58 0 C) mutant alleli göstermektedir. Bu analizde, anne, baba ve lenfositlerin IVSII-1 için heterozigot oldukları gözlenmektedir. Hasta çocuk IVSII-1 homozigot olarak saptanmıştır. IVSII-1 için normal patern şekilde belirtilmiştir 87