Immunoreactive Trypsin neonatal Screening ELISA

Transkript

1 Kullanım Talimatı Immunoreactive Trypsin neonatal Screening ELISA Kan disk örneklerinden kantitatif immunoreaktif tripsin tayini için in-vitro-diyagnostik enzim immunoassay. IM58012 IM C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 I. KULLANIM AMACI Kan disk tripsin-mw ELISA kiti Schleicher ve Schuell #903 filtre kağıtlarında toplanan kan örneklerinden insan immunoreaktif tripsin (IRT) ölçümü için özel olarak tasarlanmıştır. II. GİRİŞ VE GENEL BİLGİLER Tripsin, prekürsör veya proenzimi tripsinojen (MW- 24,000) olarak ekzokrin pankreas asiner hücrelerinde sentezlenir ve salgılanır. İki farklı tripsinojen izoenzimleri tanınmıştır. Her iki form enzimatik aktif tripsine duodenal enterokinaz ile dönüştürülür. CA ++ ionların varlığında, enterokinaz tripsinojenden hexapeptid Val- (Asp)4, -Lys kaldırır ve tripsinojenin aktif formlarını salar. Tripsin kanda üç özel inhibitör enzim aktif şekli ile bulunmaktadır: á1 -anti-tripsin, á2 macro-globulin ve inter-á-tripsin inhibütörü. Bazı tripsinojenler, endojen faktörler ve spesifik antikor rekabeti ve değişken inhibisyonu nedeni ile dolaşıma serum tripsin olarak değişmeden girer. Tripsin MW ELISA toplam immunoreaktif tripsinbenzer aktivite veya IRT olarak ölçülen türleri açıklayan önceden bildirilen tahlil ile tutarlıdır. Tahlil için bir örnek olarak 3 mm çapında delgeç ile elde edilmiş filtre kağıdı diski kullanılır. Tahlil, bir gece artı 1 ¼ saat inkübasyondan oluşur. Tahlil, disk delme, pipetleme ve plak yıkama ekipmanları ile önemli ölçüde otomatik hale getirilebilir. Her laboratuar tarafından bu immunoreaktifler ile tutarlı normal bir aralık tespit edilip kullanılmalıdır. Farklı test sistemleri ve farklı kalibrasyon değerleri nedeni ile genel bir aralığın kullanılması sıkıntılıdır. III. Tripsin-MW ELISA PRENSİBİ Tripsin-MW ELISA kiti bir kan disk örneğinde insan tripsini kantitatif ölçmek için ELISA (enzyme-linkedimmonosorbent-assay) tekniğini kullanmaktadır. ELISA testinde, birbirini tamamlayan iki antikor yapılandırmalarının aynı antijenin iki farklı bölümüne karşı oluşmaktadır. ELISA da bir antikor sistemi mikroplak kuyucuğuna bağlı ve diğer antikor bir enzim ile işaretlenmiştir. Antijen varsa, her iki antikoru aynı anda bir köprü ya da sandviç şeklinde kuyucuğa bağlar. Tüm oluşan kompleksler kuyucuğa bağlı kalır. Bağlanmamış enzimi yıkadıktan sonra belirli bir substrat eklenir ve renkli bir ürüne dönüştürülür, bu reaksiyon hızla durdurma solüsyonu ile sonlandırılır. Her bir kuyucuk için 450 nm dalga boyunda absorbans okutması yapılır ve sonuçlar grafik kağıt üzerinde IRT konsantrasyonu ng/ml ye karşı absorbans olarak çizilir. Prosedürde Schleicher ve Schuell (#903) filtre kağıdında toplanan kan dairelerinin merkezinden bir disk delgeçlenir. Bu disk elüsyon tamponu ile birlikte antikorun bulunduğu kuyucuğa yerleştirilir. Bir gecelik inkübasyondan sonra, elüsyon tamponu ve kan diskleri aspire edilir ardından kuyucuklar iyice yıkanır ve enzim işaretli antikor pipetlenir. İkinci bir inkübasyondan sonra kuyucuklar yıkanır ve substrat pipetlenir. Enzim reaksiyonu hızla durdurma solüsyonu ile sonlandırılır ve absorbans okutulur. Standard eğri inşa edilerek örneklerin bilinmeyen tripsin konsantrasyonu hesaplanır. Anti-IRT-MW tavşan antikor En önemlisi, kan disk IRT ELISA, IRT moleküler formları açısından eşsiz özgüllük özellikleri olan IRT antikoru kullanılmaktadır. (23-27) Poliklonal IRT antikorunun NIH (National Institutes of Health) grant altında orjinal geliştirmesinden bu yana, patolojik IRT formunun normal dolaşan formuna göre gelişmiş reaktivitesindeki benzersiz yönler hakkında pekçok bildirimde bulunduk. Bu patolojik özgüllük kullanılan standartların mutlak değerinin kantitatif farklılıklarından bağımsızdır ve antikorun bir fonksiyonudur. Antikorun kapsamlı analiz sonuçları, saflaştırılmış intakt tripsine göre patolojik IRT nin moleküler türlerin veya etkileşimleri açısından antikorların daha sağlam ve güçlü olduğunu göstermiştir. Version 5/05 1/6

3 IV. KİT İÇİNDE BULUNAN REAKTİFLER NOT: Aşağıdaki reaktifler 2 çeşit kit te Single Assay Blood Spot Trypsin (Katalog No IM Plak) ve Bulk Assay (Katalog No IM Plak) içerir. Toplu test bulk assay için miktarları italik olarak belirtilmiştir. A. Poliklonal Anti-human tripsin kaplı kuyucuklar MTP (96 kuyucuk) 2 adet (20 adet): Açılmamış stripler için 2-8 C derecede kit üzerinde belirtilmiş olduğu gibidir, kilitli folyo poşet kullanım için açılmış olsa dahi. B. Tripsin-ELISA Enzim Konjugat ENZCONJ CONC Konsantre 0.5 ml (5.0 ml) Yabanturbu (horseradish)-peroksidaz PBS içinde monoklonal anti-tripsin antikora konjuge edilmiştir, ph 7.4. Kullanım için, enzim seyreltici vialin tüm içeriğini enzim konsantre vialin içine dökünüz, kapağı kapatınız ve karıştırmak için bir kaç kez yavaşca ters çeviriniz. Seyreltilmiş enzim reaktifin kararlılığı 2-8 C derecede 1 hafta (7 gün). Açılmamış enzim konjugatın kararlılığı etiketinde belirtilmiş olduğu gibidir. 1. Single Kit Assay: Kullanım için, enzim seyreltici ampulün tüm içeriğini enzim konsantre ampulün içine dökünüz, kapağı kapatınız ve karıştırmak için bir kaç kez yavaşca ters çeviriniz. Seyreltilmiş enzim reaktifin kararlılığı 2-8 C derecede 1 hafta (7 gün). Açılmamış enzim konjugatın kararlılığı etiketinde belirtilmiş olduğu gibidir. 2. Bulk Kit Assay: Kullanım için, konsantre enzimi enzim seyreltici ile (50x) seyreltiniz. Örnek: 4 Plak = 45 ml seyreltilmiş enzim ml enzim seyreltici ile 0.9 ml enzim konsantre ile dilüe edilir. Kullanmak için iyice karıştırın. Seyreltilmiş enzim reaktifin karalılığı 2-8 C derecede 1 hafta (7 gün). NOT: Şişenin kapağı açılırken bir kayıp olmaması için kapakta konsantre enzim olmamasına dikkat ediniz. Enzim reaktifinden birden fazla şişe gerekecekse, kullanımdan önce tüm seyreltilmiş enzimi birleştirerek havuz oluşturunuz ve karıştırınız. C. Standartlar CAL 1-7 (7 seviye), Kontroller CONTROL 1-3 (3 seviye) her kitte 1 kart (5 kart): Insan tam kanı ile emdirilmiş filtre kağıtları. Konsantrasyonları etiket üzerinde belirtilmiş olduğu gibidir. Açılmamış kart kararlılığı yine etiket üzerinde belirtilmiş olduğu gibidir. Kart poşeti açıldıktan sonra, kart kararlılığı -15 C derece ve altında saklandığında kitin raf ömrü kadardır. NOT: Güncel kalibrasyon seviyeleri lotlar arasında değişebilir. Güncel standartların etiketlerinde bulunan kalibrasyon değerleri hesaplamalarda kullanılmalıdır. D. Elüsyon tamponu ELUTINGBUF 40.0 ml (400.0 ml): Kararlılık, 2-8 C derecede tampon etiketinde belirtilmiş olduğu gibidir. E. Enzim seyreltici ENZDIL 22.0 ml (220.0 ml): Kararlılık, enzim konsantre ile birlikte kullanıldığında 2-8 C derecede 1 hafta (7 gün). F. Durdurma solüsyonu STOP 22.0 ml (220.0 ml): Deiyonize su içinde H 2 SO 4. Kararlılık, 2-8 C derecede solüsyonun etiketinde belirtilmiş olduğu gibidir. G. Renkli substrat SUBS 22.0 ml (220.0 ml): Kullanım için hazır 3,3,5,5 -tetrametilbenzidin (TMB). TMB kararlılığı açıldıktan sonra 2-8 C derecede 1 hafta (7 gün). H. Yıkama tamponu WASHBUF CONC Konsantre 50.0 ml (500.0 ml): % 0.5 lik Tween 20 içeren fosfat tampon. Kullanmadan önce distile su ile 10 kat (500 ml) sulandırınız. Seyreltilmiş yıkama tampon kararlılığı, 2-8 C derecede kitin etiketinde belirtilmiş raf ömrü kadardır. NOT: Dizi siparişlerde, bulk yıkama tamponu konsantresi otomatik yıkayıcıda kullanılmak üzere mevcuttur. Version 5/05 2/6

4 UYARI: İNSAN KAYNAKLI MALZEMELER Bulaş özelliğine sahip olarak muamele ediniz. Bu ürünün elde edildiği kaynak material HIV1, HIV2 antikor ve non-reaktif HBsAg ve Hepatit C için lisanslı reaktifler ile test edildiğinde donor düzeyinde non-reaktif bulundu. Hiçbir bilinen test yöntemi, insan kanından elde edilen ürünler için bulaşıcı olmayacağını garanti edemez. Bakınız; Mikrobiyoloji ve Biyokimya Laboratuvarları yayın (HHS Yayın No TBM ) TBM / NIH Biyo-Güvenlik. UYARI: SODYUM ASİT Bu reaktifler sodium asit içerdiği için, potansiyel olarak kurşun veya bakır tesisat giderlerinde patlayıcı metal-azid oluşturma eğilimleri vardır. Bu reaktiflerin bertarafı esnasında tesisat giderlerini her zaman büyük miktarlarda su ile yıkayınız. V. KALİBRASYON VE STANDARDİZASYON Örnekte (Kan diski) bulunan IRT miktarı bilinen bir miktarda tripsin ile hazırlanan standart eğri ile hesaplanır, bu standart eğri tanınmış kan disk IRT RIA ile kaşılaştırılıp kalibre edilir. Şu anda tripsin için hiçbir uluslararası referans bulunmamaktadır. VI. VII. VIII. PROSEDÜRÜN KISITLI OLDUĞU ALANLAR Doğru ve güvenilir sonuçlar temin etmek için, tüm kan disklerinin inkübasyon sırasında reaksiyon solüsyonu içinde bulunduğundan emin olun. Protokole sıkı sıkıya bağlı kalmak güvenilir sonuçlar elde etmek için tavsiye edilir. Kit veya metodlara yapılan herhangi bir değişiklik veya değişiklikler kullanıcının sorumluluğundadır. Bu test SADECE SCHLEICHER ve SCHUELL filtre kağıdında (#903) toplanan örnekler ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır. EKİPMAN VE GEREKLİ REAKTİFLER A. 450 nm dalga boyunda absorbans okuyabilecek Plak okuyucu. B. 100, 200 ve 300 µl ye kalibre edilmiş çok kanallı ve tek kanallı pipetler. NOT: 200 ve 300 µl yıkama adımı için kabul edilebilir. C. Otomatik Plak yıkayıcı (opsiyonel.) TOPLAMA VE KAN ÖRNEKLERİNİN MUAMELESİ En az iki daire tamamen dolacak şekilde filtre kağıdına kan aktarın. Kanın, filtre kağıdının diğer tarafına nufüz etmesi kesinlikle gereklidir. Kan, dairenin merkezinde tespit edilip ve dışa doğru yayılması sağlanmalıdır. Filtre kağıdının yüzeyinde yırtılma ya da bozulmadan kaçınılmalıdır. Örneklerin tamamen hava ile kurumasına izin verilmelidir (bir gece). Doğrudan güneş ışığına ısı yakınına veya emici yüzeylere koymayınız. Bir gece kuruduktan sonra, örneklerin tahliline kadar -15 C derece veya altında, hava geçirmez plastik ambalaj içinde muhafaza ediniz. Version 5/05 3/6

5 IX. TAHLİL ADIMLARI (Dublike çalışma önerilmektedir) NOT: En fazla iki plak ardışık çalışılabilmektedir. Büyük test serilerinde, muntazam plak işlemini temin etmek için, pipetleme zamanlanması iyi ayarlanmalıdır. A. Herbir kalibratör, kontrol ve örnek için dublike olarak: 1. Kan ile emdirilmiş filtre kağıdının merkezinden bir adet 1/8 (3 mm) kan diskini plakda uygun kuyucuğun içine delgeçleyiniz. 2. Her kuyucuğa 200 µl elüsyon tamponu ekleyiniz. 3. Plağı kapatınız, 30 saniye boyunca el ile çalkalayınız (yavaşça) ve oda sıcaklığında gece boyunca inkübe ediniz.* * Tüm kan disklerinin elüsyon tamponuna dalmış olduğundan emin olunuz. 4. Tüm kuyucukların içeriğini aspire ediniz. 200 µl ya da 300 µl yıkama tamponu ile 3 kere yıkayınız, her yıkamadan sonra sıvıyı uzaklaştırmak için aspire ediniz ya da her yıkamadan sonra plağı ters çevirerek içinde sıvı kalmayana kadar emici kağıt üzerine vurunuz. 5. Her kuyucuğa 100 µl seyreltilmiş enzim-konjugat ekleyiniz. 6. Plağı kapatınız, 30 saniye boyunca el ile çalkalayınız (yavaşca) ve oda sıcaklığında bir saat süreyle inkübe ediniz. 7. Tüm kuyucukların içeriğini aspire ediniz ya da plağı ters çevirerek içinde sıvı kalmayana kadar emici kağıt üzerine vurunuz µl yıkama tamponu ile 3 kere yıkayınız, her yıkamadan sonra sıvıyı uzaklaştırmak için aspire ediniz. ya da her yıkamadan sonra plağı ters çevirerek içinde sıvı kalmayana kadar emici kağıt üzerine vurunuz. 9. Her kuyucuğa 100 µl yeni substrat ekleyiniz dakika oda sıcaklığında inkübe ediniz. 11. Her kuyucuğa 100 µl durdurma solüsyonu ekleyiniz ve 10 saniye boyunca el ile sallayınız (yatay) nm dalga boyunda absorbansı okutunuz ve yarı-log grafik kağıt üzerinde çizdiriniz. (Abs. vs log doz ng/ml) X. KALİTE KONTROL Üç farklı seviyede (yüksek, orta, düşük) IRT içeren eksternal kan disk kontrolleri rutin olarak her çalışmaya dahil edilmelidir. Kontrol sonuçları kaydedilir ve saptanmış protokoller tarafından değerlendirilmesi gerekir, örneğin, Westgard, J.O. et al., Clinical Chemistry 27: , Internal (Kit) Kontroller: Aynı şekilde üç düzey kontroller kit ile birlikte rutin olarak belirtilen değerlere uyumluluk için izlenmelidir. Kit kontrolleri üreticinin spesifikasyonuna göre, kitin performansı ile ilgili değerli bilgiler sağlar. XI. HESAPLAMA VE YORUM A. Örnek absorbansını doğrudan ng/ml serum olarak eğriden okuyunuz. Örnek bir test sonucu ve standart eğri XII. bölümde sunulmuştur. B. En yüksek standart üzerindeki tripsin seviyeli örnekler. den daha büyük olarak rapor edilmelidir. Version 5/05 4/6

6 XII. TEST ÖZELLİKLERİ, DOĞRULUK VE GÜVENİRLİK A. Örnek test Kalibratör Kalibratör yada Örnek ng/ml Absorbans Net. Absorbans Grafik NSB Seviye I Seviye II Seviye III B. DOĞRUSALLIK (Presizyon) Saflaştırılmış tripsin içeren farklı örneklerin tahlil içindeki değişkenliği B1 de gösterilmiştir. Tripsin eklenen veya endojen tripsin (IRT) içeren farklı örneklerin tahlilleri arasındaki değişkenlik B2 de gösterilmiştir. 1. Intra-Assay (Absorbans): Örnek n IRT ng/ml X Absorbans Standart Sapma Değişim katsayısı (%) A B C D Intra-Assay (IRT ng/ml): Örnek n IRT ng/ml Standart Sapma Değişim katsayısı (%) A B C D C. Geri kazanım Bilinen miktarlarda ilave edilen tripsinli stabil örneklerin geri kazanım yüzdeleri aşağıdaki tabloda gösterilmiştir. Örnek n Beklenen IRT Saptanan IRT Geri kazanım ng/ml ng/ml % A B C D Ortalama geri kazanım - tüm örneklerin ortalaması = % D. Hassasiyet Minimum saptanabilen doz Sıfır kalibratörün tekrarlayan analizleri ile belirlenmiş olan minimum tespit edilebilir kan disk dozu IRT-MW ELISA < 5 ng/ml dir. Version 5/05 5/6

7 XIII. ANTİKOR BİLEŞENLERİ Kan disk IRT ELISA kiti kuyucuklarında poliklonal yakalama/capture antikor konfigürasyon kullanılır ve tamamlayıcı olarak bir tracer HRP-işaretli monoklonal antikor. Monoklonal antikorlar, insan tripsini ile aşılanmış farelerden elde edilir. Poliklonal antikorlar tripsin ile aşılanmış tavşanlarda çoğaltılmıştır. XIV. REFERANSLAR 1. Adrian, T.E. et al., Clin. Chem. Acta. 97:205, Andrulli, A., et al., Dig. Dis. Sci. 26:532, Lake-Bakaar, G et al., Lancet i:66, Gamble, D. R. et al., J. Clin. Pathol, 32:897, Elias, E. et al., Lancet i:66, Adrian, T. E, et al., Gut. 19: A446, Healey, A. F., Watson D., Clin. Chem. 29:2011, Kirby, L. T. et al., Clin. Chem. 27: 678, Crossley, J. R. et al., Lancet, i March 3, 472, Kirby, L., et al., 29:1559, Travis, J. C., Unpublished observations, Fahrenkrug, J. et al., Clin. Chem. 27:1655, Koehn, H. D., A. Mostbeck, Clin. Chem 27:502, Travis, J. C., et al., Clin. Chem., 25,735, Coury, A. J., et al., Clin, Chem., 29:1593, Scwachwon, H., Mohmoodian, A., Clin. Chem., 25:158, Thompson, L. S., Clin. Chem. News, pg 8, Ryley, H. C., J. Clin, Pathol., 34:179, Margolies, R., Boat, T.F., Pediatr. Res., 17:931, Quissel, D. O., et al., Pediatr. Res., 17:899, Reiter, E. O., et al., Clin. Endocrinol., 16: Malvano, R. et al., Scand J. Gastroenterol., Supp. 62, 150:3, Travis, J. C., Poster III International Conference on NewbornScreening for Cystic Fibrosis, Oct. 5-6, 1988, CAEN, France. 24. Travis, J. C., Poster 7th National Neonatal ScreeningSymposium, Nov , 1989, New Orleans, LA. 25. Travis, J.C., Poster IVth International Conference on NewbornScreening for Cystic Fibrosis, Oct. 8-9, 1990, Estes Park, CO. 26. Travis, J. C., Poster 8th International Neonatal ScreeningSymposium and Inaugural Meeting of the International Societyfor Neonatal Screening, Leura, N.S.W., Australia, Nov , Travis, J. C., Poster 9th National Neonatal ScreeningSymposium, Raleigh, NC, April 7-11, Version 5/05 6/6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /