MEME KANSERİ HÜCRELERİNDE KOSTİMÜLATÖR B7 AİLESİ LİGANDLARININ EKSPRESYONU VE YARDIMCI T HÜCRE YANITLARI ÜZERİNE ETKİSİ

T.C HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ MEME KANSERİ HÜCRELERİNDE KOSTİMÜLATÖR B7 AİLESİ LİGANDLARININ EKSPRESYONU VE YARDIMCI T HÜCRE YANITLARI ÜZERİNE ETKİSİ Uzm. Biol. Pınar KARAŞAR Tümör Biyolojisi ve İmmünolojisi Programı YÜKSEK LİSANS TEZİ ANKARA 2013

T.C HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ MEME KANSERİ HÜCRELERİNDE KOSTİMÜLATÖR B7 AİLESİ LİGANDLARININ EKSPRESYONU VE YARDIMCI T HÜCRE YANITLARI ÜZERİNE ETKİSİ Uzm. Biol. Pınar KARAŞAR Tümör Biyolojisi ve İmmünolojisi Programı YÜKSEK LİSANS TEZİ TEZ DANIŞMANI Doç. Dr. Güneş Esendağlı ANKARA 2013

ONAY SAYFASI iii

iv TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim sırasında beni her zaman yüreklendiren, destek olan, kendimi geliştirmemde bana yol gösteren, öğrencisi olmaktan onur duyduğum değerli danışmanım Sayın Doç. Dr. Güneş Esendağlı ya en içten duygularımla minnettarlığımı ifade ederim. Benden ilgilerini esirgemeyen, bana güvendiğini her an hissettiren Sayın Prof. Dr. Dicle Güç e, engin bilgi ve tecrübeleriyle bana ışık tutan Sayın Prof. Dr. Emin Kansu ya, her zaman güler yüzlü pozitif enerjileriyle motivasyonumu artıran sevgili hocalarım Sayın Doç. Dr. Lale Doğan a, Sayın Öğr. Gör. Dr. Hande Canpınar a ve Sayın Öğr. Gör. Dr. Füsun Özmen e en içten duygularımla şükranlarımı sunarım. Benden hiç bir konuda yardımını esirgemeyen bilgileriyle çalışmalarıma katkıda bulunan Dr. S. Altuğ Kesikli ye ve Uzm. Biol. Yusuf Dölen e, benim aile sıcaklığını hissettiğim huzurlu ve mutlu bir ortamda çalışmama katkıda bulunan tüm Temel Onkoloji ailesine sonsuz teşekkür ederim. Sevgili çalışma arkadaşlarıma ve dostlarıma, yardımları ve desteğiyle her zaman yanımda olan Hakkı Toy ve Simge Çelebi ye beni hiçbir zaman yalnız bırakmadıkları sevgi ve hoşgörüyle yaklaştıklarından dolayı şükranlarımı sunarım. Çalışmalarım boyunca her zaman yanımda olan, beni her daima motive eden ve özellikle tez yazımı aşamasında bütün nazımı ve kaprisimi büyük bir sevgi ve sabırla çeken sevgili Volkan Şen e çok teşekkür ederim. Beni her zaman koşulsuz seven, sınırsızca destekleyen, hayattaki en büyük moral kaynağım olan çok değerli canım anneme, babama ve kardeşime yürekten teşekkür ederim. Bu tez, Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir.

v ÖZET Karaşar P. Meme Kanseri Hücrelerinde Kostimülatör B7 Ailesi Ligandlarının Ekspresyonu ve Yardımcı T Hücre Yanıtları Üzerine Etkisi. Hacettepe Üniversitesi Kanser Enstitüsü Tümör Biyolojisi ve İmmünolojisi Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2013. B7 ligandları T hücre yanıtlarını düzenleyen en kritik kostimülatör moleküllerdir. Bu moleküller esas olarak profesyonel antijen sunucu hücreler üzerinde bulunmalarına rağmen tümör hücreleri üzerinde de eksprese olabilirler. B7 ligand ailesi üyelerinden B7-1 ve B7-2 naif T hücrelerin uyarılmasında kritik bir rol oynar ancak aktive T hücre üzerinde eksprese olan CTLA-4 e bağlanarak inhibe edici özellik de gösterebilir. B7-H1, B7-DC ve B7-H4 inhibe edici, B7-H2 aktive edici, B7- H3 ün ise T hücre yanıtlarında düzenleyici etkileri vardır. Bu çalışmada, meme kanseri hücrelerinde bulunan B7 ligandlarının yardımcı T hücre yanıtlarına etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Lüminal MCF-7, BT-474, SK-BR-3, T-47D, ZR-75-1; bazal-benzeri, MDA-MB-231, MDA-MB-468, HCC38 meme kanseri hücre hatlarının ve normal meme epiteli hücre hattı MCF-12A nın kültürleri gerçekleştirildi. Ayrıca, hücreler LPS ve IFN-γ ile uyarıldı. Tüm B7 ailesi moleküllerinin mrna düzeyleri RT-PCR ile; B7-H1, B7-H2 ve B7-DC protein düzeyi ise akım sitometri ile belirlendi. Periferik kandan ayrımlanan CD4 + T lenfositler anti-cd3 uyarıcı antikor varlığında miyeloid hücreler ile uyarıldı ve daha sonra geri saflaştırıldı. Bu hücrelerin meme kanseri hücreleri ile farklı oranlarda ko-kültürü yapıldı. CD154, CD25 ve CD69 T hücre aktivasyon belirteçlerinin ve CFSE analizi ile çoğalma düzeyleri değerlendirildi. PD-1 ligandları, B7-H1 ve B7-DC ko-inhibitör moleküllerinin bazal-benzeri moleküler tipteki meme kanseri hücre hatlarında, ICOS ligandı B7-H2 ko-aktivatör molekülünün ise luminal tipteki hücrelerde seçici ve belirgin düzeyde eksprese oldukları bulunmuştur. LPS ile uyarım ekspresyon düzeylerinde belirgin bir fark yaratmazken, IFN-γ nın bazal-benzeri hücrelerde B7-H1 ve B7-DC düzeylerini artırdığı gözlenmiştir. İlginç olarak, ko-kültürler sonucunda bazal-benzeri meme kanseri hücre hatlarının T lenfosit aktivasyonunu ve çoğalmasını desteklediği yönünde bulgular elde edilmiştir. Yapılan analizlerde bu kanser hücreleri tarafından salgılanan faktörlerin uyarıcı, yüzey moleküllerinin ise inhibitör etkiye sahip olabileceği görüldü. Bulgularımız, bazal-benzeri meme kanserlerinin T hücre aktivasyon ve inhibisyon mekanizmalarını eş zamanlı olarak modüle edebildiğine işaret etmektedir. Anahtar kelimeler: Meme kanseri, kostimülasyon, B7 ligand ailesi Bu çalışma, Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir.(bab, Destek No: 013D03104001)

vi ABSTRACT Karasar, P. The expression of co-stimulatory B7 ligands on breast cancer cells and their effects on T helper responses. Hacettepe University Cancer Enstitute. A dissertation for the degree of Master of Science in Tumor Biology and Immunology. Ankara, 2013. B7 ligands are the most critical costimulatory molecules that regulate T cell responses. Although these molecules are mainly expressed on professional antigen presenting cells, they may also be expressed on tumor cells. Among the members of B7 ligand family, B7-1 and B7-2 play a critical role in stimulating naive T cells. However, these molecules may also engage CTLA-4 that is expressed on activated T cells and inhibit T cell function. B7-H1, B7-DC and B7-H4 exert inhibitory effects, whereas B7-H2 has activatory and B7-H3 has regulatory effects on T cell responses. The aim of this study is to determine the effects of B7 ligands, which are present on on breast cancer cells, on T helper cell responses. Luminal breast cancer cell lines MCF-7, BT-474, SK- BR-3, T-47D, ZR-75-1; basal-like breast cancer cell lines MDA-MB-231, MDA-MB-468 and HCC38 as well as a normal basal-like breast epithelial cell line MCF-12A were propagated in in vitro cultures. Additionally these cells were stimulated with LPS and IFN-γ. The mrna levels of all B7 family members were analyzed with RT-PCR and proteine levels of B7-H1, B7-H2 and B7-DC were analyzed with flow cytometry. CD4 + T lymphocytes sorted from peripheral blood of healty subjects were stimulated with myeloid cells in the presence of anti-cd3 monoclonal antibodies and were back-sorted afterwards. These activated lymphocytes were co-cultured with breast cancer cell lines at different ratios. T cell proliferation levels were investigated by CFSE analyses and the presence of CD154, CD25 and CD69 activation markers were determined. Selective and significantly increased expression of co-inhibitory PD-1 ligands B7-H1 and B7-DC on basal-like breast cancer cell lines as well as of the co-activatory ICOS ligand B7-H2 on luminal breast cancer cell lines were observed. Although stimulation with LPS did not change the expression levels significantly, levels of B7-H1 and B7-DC were significantly increased on basal-like cells upon IFN-γ stimuation. Interestingly, basal-like breast cancer cell lines were found to support T cell activation and proliferation.our analyses revealed that factors secreted by these cancer cells may have stimulatory effects, whereas surface molecules expressed on them may impose inhibitory actions. These findings indicate that basal-like breast cancers may modulate the mechanisms for T-cell activation and inhibition simultaneously. Key words: Breast cancer, costimulation, B7 ligand family This study was supported by Hacettepe University Scientific Research Projects Coordination Unit. (BAB, Grant Number, 013D03104001).

vii İÇİNDEKİLER Sayfa ONAY SAYFASI... iii TEŞEKKÜR... iv ÖZET... v ABSTRACT... vi İÇİNDEKİLER... vii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... ix ŞEKİLLER DİZİNİ... xi TABLOLAR DİZİNİ... xiv 1.GİRİŞ... 1 2.GENEL BİLGİLER... 3 2.1. Meme Kanseri... 3 2.2. Meme Kanserinin Moleküler Alt-Tipleri... 3 2.2.1. Lüminal A Alt-tipteki Meme Kanserleri... 5 2.2.2. Lüminal B Alt-tipteki Meme Kanserleri... 6 2.2.3. HER2-Pozitif Alt-tipteki Meme Kanserleri... 6 2.2.4. Bazal-benzeri Alt-tipteki Meme Kanserleri... 7 2.2.5. Normal Meme-Benzeri Alt-tipteki Meme Kanserleri... 8 2.2.6. Klaudin düşük Alt-tipteki Meme Kanserleri... 8 2.2.7. Apokrin Alt-tipteki Meme Kanserleri... 9 2.3. Meme Kanserine Karşı İmmün Yanıtlar... 9 2.3.1. Meme Kanseri ve İnflamasyon... 9 2.3.2 Meme Kanserinde T Hücre Yanıtları... 14 2.4 Kostimülasyon... 20 2.4.1 B7 Kostimülatör Ligand Ailesi... 20 3. GEREÇ VE YÖNTEMLER... 28 3.1. Çalışmada Kullanılan Maddeler... 28 3.2. Hazırlanan Tamponlar ve Çözeltiler... 28 3.3. Hücre Kültürü Deneyleri... 30 3.3.1. Hücre Hatlarının Kültürü... 30 3.3.2. CD4 + T Hücrelerin İzolasyonu... 32

viii 3.3.3 Ko-kültür Deneyleri... 33 3.4. Akım Sitometri Analizleri... 37 3.5. Moleküler Teknikler... 39 3.5.1. RNA İzolasyonu... 39 3.5.2. İzole Edilen RNA nın Saflık ve Kalite Analizi... 39 3.5.4. Polimeraz Zincir Reaksyonu (Polymerase Chain Reaction, PCR)... 41 3.5.6. Agaroz Jel Elektroforezi... 43 3.6. İstatistiksel Analiz... 44 4.BULGULAR... 45 4.1. Meme Kanseri Hücre Hatlarında B7 Ligand Gen Ekspresyonunun Araştırılması... 45 4.3. Lüminal ve Bazal-benzeri Meme Kanseri Hücre Hatlarının CD4 + T Hücre Proliferasyonu Üzerine Etkisi... 54 4.3.1 Miyeloid Kökenli KG-1 Hücreleri ile T Hücre Proliferasyonunun Uyarımı... 54 4.3.2. Meme Kanseri Hücreleriyle Ko-kültürü Yapılan Naif veya Ön-Uyarımı Yapılmış T Hücrelerin Proliferasyonu... 56 4.3.3. CD4 + T Hücrelerin, KG-1 ve Fikse veya Kontrol Meme Kanseri Hücreleri Varlığında Proliferasyonu... 60 4.4. Meme Kanseri Hücreleri ile Ko-Kültürü Yapılan CD4 + T Hücrelerde Aktivasyon Belirteçlerinin Analizi... 66 5. TARTIŞMA... 70 6. SONUÇ VE ÖNERİLER... 80 KAYNAKLAR... 82 EKLER... 91 EK-I: Etik Kurul İzni... 91 EK-II: Çalışmanın sunulduğu bilimsel toplantılar.... 92

ix SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ AR Androjen reseptörü AC Adenokarsinom ASH Antijen sunucu hücre BBMK Bazal-benzeri meme kanseri Bcl-2 B-cell lymphoma 2 CK Cytokeratin COX2 Siklooksijenaz 2 CSC Cancer stem cell CTL Cytotoxic T lymphocyte DC Dendritik hücre DEPC Dietil pirokarbonat DMEM Dulbecco s Modified Eagle Medium ECM Extra celular matrix EGF Epidermal Growth Factor EGFR Epidermal Growth Factor Receptor EMT Epithelial to mesenchimal transition ER Estrogen receptor FACS Fluorescence-activated cell sorting FBS Fötal Buzağı Serumu GATA3 Trans-acting T-cell-specific transcription factor GATA-3 GM-CSF Granülosit-makrofaj koloni-stimüle edici faktör HER2 Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 HIF1α Hypoxia-inducible factor 1α htert Human Telomerase reverse transcriptase ICOS Inducible T-cell Costimulator IDC İnvaziv duktal karsinom IDO İndolamin 2,3-dioksigenaz IFGBP-2 Insulin-like growth factor-binding protein 2 IFN İnterferon Ig İmmünglobulin

x IgSF Immunoglobulin superfamily LAG3 Lymphocyte-activation gene 3 LPS Lipopolysaccharide MAPK Mitogen-activated protein kinase MDSC Myeloid-derived suppressor cells MHC Major histocompatibility complex MKI67 Antigen KI-67 MYBL2 Myb-related protein B NF-kB Nuclear factor-kb NK Natural killer NKT Natural killer T PBS Phosphate-buffered saline PI3K Phosphatidylinositide 3-kinases PR Progesterone receptor PTEN Phosphatase and tensin homolog RTK Reseptör tirozin kinaz SHP Src homology region 2 domain-containing phosphatase STAT3 Signal tarancducer and activator of transcription 3 TAM Tumor-associated macrophages TCR T cell receptor TGF-β Transforming growth factor beta Th1 T helper 1 Th2 T helper 2 TN Triple negative TNF Tumor Necrosis factor TNFRSF Tumor necrosis factor superfamily Treg Regulatory T cells TSLP Thymic stromal lymphopoietin VEGF Vascular endothelial growth factor

xi ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Meme dokusu hücreleri ve memenin dukto-lobüler (kanal-lobül) yapısı... 4 Şekil 2.2. Meme kanserinin gen ekspresyon profiline göre moleküler sınıflandırması..... 4 Şekil 2.3. Kanser gelişiminde etkili inflamatuvar yolaklar..... 11 Şekil 2.4. Meme kanseri gelişimi immün hücrelerin bol infiltrasyonu ile karakterizedir..... 12 Şekil 2.5. Tümör gelişimi süresince T hücre yanıtlarının polarizasyonu.... 14 Şekil 2.6. CTL ler tarafından tümörün reddi.... 15 Şekil 2.7. Th2-tipi immün yanıtların TSLP ile indüklenmesi.... 17 Şekil 2.8. Treg hücreleri tarafından kullanılan baskılama mekanizmaları.... 19 Şekil 2.9. B7 ligand ailesi ve reseptörlerinin yapısı... 21 Şekil 2.10. B7-CD28 ligand-reseptör ilişkisinin modellemesi T hücrenin ikinci sinyaller aracılığı ile uyarılması ve daha sonra baskılanması..... 22 Şekil 2.11. T hücrelerde ko-sinyal etkileşimleri... 23 Şekil 2.12. CD28 ailesi reseptörlerinin ko-stimülatör ve ko-inhibitör sinyal yolakları.... 24 Şekil 3.1. A. CD4 + T hücrelerin FACS yöntemiyle izole edilmesi. B. Sort başarısı analizi..... 33 Şekil 3.2. A. CD4 + T hücrelerin geri saflaştırılması. B. Geri ayırım başarısı analizi...... 34 Şekil 3.3. Meme kanseri hücreleri ile CD4 + T hücrelerin 96 kuyucuklu kültür kabına ekim oranları. (1 = 2.5x10 4 hücre)... 36 Şekil 3.4. 50 bp DNA ladder (MBI Fermentas, Litvanya)... 44 Şekil 4.1. Optimize edilen RT-PCR koşulları ile elde edilmiş ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonucu.... 45

xii Şekil 4.2. Meme kanseri hücre hatlarında B7 ligandlarının gen ekspresyon RT-PCR analizi sonuçları.... 46 Şekil 4.3. B7-H2 molekülünün temsili akım sitometri histogramları.... 49 Şekil 4.4. B7-H2 pozitifliği gösteren meme kanseri hücrelerinin yüzdeleri... 50 Şekil 4.5. B7-H1 molekülünün temsili akım sitometri histogramları.... 51 Şekil 4.6. B7-H1 pozitifliği gösteren hücrelerin yüzdeleri.... 52 Şekil 4.7. B7-DC molekülünün temsili akım sitometri histogramları.... 53 Şekil 4.8. B7-DC pozitifliği gösteren meme kanseri hücrelerinin yüzdeleri.. 54 Şekil 4.9. A. CD4 + T hücrelerin miyeloid kökenli KG-1 hücreleri ile uyarımı gerçekleştirilen CFSE analizine ait temsili akım sitometri grafikleri. B. CD4 + T hücrelerin miyeloid kökenli KG-1 hücreleri ile yapılan ko-kültür ve önuyarımda T hücrelerin proliferasyon yüzde değerleri.... 56 Şekil 4.10. Naif CD4 + T hücreler ile iki lüminal (MCF-7, BT-474) ve iki bazalbenzeri (MDA-MB-468, MDA-MB-231) özellikteki meme kanseri hücrelerinin ko-kültüründen 96 saat sonra, T hücre proliferasyonunun temsili akım sitometri histogramları.... 57 Şekil 4.11. Ön-uyarılmış CD4 + T hücreler ile iki lüminal (MCF-7, BT-474) ve iki bazal-benzeri (MDA-MB-468, MDA-MB-231) özellikteki meme kanseri hücrelerinin ko-kültüründen 96 saat sonra, T hücre proliferasyonunun temsili akım sitometri histogramları.... 58 Şekil 4.12. Lüminal ve bazal-benzeri hücreler ile ön-uyarımı yapılmış veya yapılmamış T hücreler anti-cd3 mab varlığında 96 saat boyunca yapılan kokültürlerde, T hücre proliferasyonu yüzdeleri..... 59 Şekil 4.13. Fikse edilmiş meme kanseri hücreleriyle beraber T ve KG-1 hücrelerinin ko-kültürlerinde T hücre proliferasyonunun temsili akım sitometri grafikleri.... 61 Şekil 4.14. Fikse edilmemiş (kontrol) meme kanseri hücreleriyle beraber T ve KG-1 hücrelerinin ko-kültürlerinde T hücre proliferasyonunun temsili akım sitometri grafikleri.... 62

xiii Şekil 4.15. Fikse edilmiş ve edilmemiş (kontrol) meme kanseri hücreleriyle beraber T hücre ve KG-1 hücrelerinin üçlü ko-kültürlerinde anti-cd3 mab varlığında T hücrelerinin proliferasyon yüzdeleri.... 63 Şekil 4.16. MDA-MB-231 hücreleri ile T hücre ve KG-1 hücrelerinin üçlü kokültür sonuçlarının temsili akım sitometri histogramları... 64 Şekil 4.17. A. Naif ve ön-uyarımı yapılmış T hücrelerle meme kanseri hücrelerinin ikili ko-kültürü ile elde edilen T hücre proliferasyon değerleri... 65 B. KG-1, T hücre ve fikse edilen veya fikse edilmeyen (kontrol) meme kanseri hücreleriyle yapılan üçlü ko-kültürlerde (0.125:1:1) T hücre proliferasyon değerleri gösterilmiştir.... 65 Şekil 4.18. Naif T hücreler ile meme kanseri hücrelerinin (MCF-7, BT-474, MDA-MB-468 ve MDA-MB-231) 20 saat ko-kültüründen sonra T hücre aktivasyon belirteçleri CD25, CD69 ve CD154 ekpresyonlarının temsili akım sitometri histogramları.... 67 Şekil 4.19. Ön-uyarımı yapılmış T hücreler ile meme kanseri hücrelerinin (MCF-7, BT-474, MDA-MB-468 ve MDA-MB-231) 20 saat ko-kültüründen sonra T hücre aktivasyon belirteçleri CD25, CD69 ve CD154 ekpresyonlarının temsili akım sitometri histogramları.... 68 Şekil 4.20. Naif ve Ön-uyarımı yapılmış T hücreler ile meme kanseri hücrelerinin (MCF-7, BT-474, MDA-MB-468 ve MDA-MB-231) 20 saat kokültüründen sonra aktivasyon belirteçleri CD25, CD69 ve CD154 ekpresyonlarının karşılaştırmalı grafikleri (*P<0.05).... 69

xiv TABLOLAR DİZİNİ Sayfa Tablo 3.1. Meme kanseri hücre hatları ve özellikleri.... 30 Tablo 3.2. Akım sitometride kullanılan antikorlar... 38 Tablo 3.3. cdna sentez reaksiyonu bileşenleri ve koşullar... 41 Tablo 3.4. Standart PCR bileşen miktarları ve son konsantrasyonları.... 42 Tablo 3.5. Standart PCR thermal cycler koşulları.... 42 Tablo 3.6. Gen ekspresyon analizlerinde kullanılan primer dizileri.... 43

1 1.GİRİŞ Meme kanseri klinik, morfolojik ve moleküler düzeyde farklı gösterir. Bu heterojenite tümör histopatolojisi, klinik seyir ve tedaviye verilen cevaplar açısından incelendiğinde; bütün meme kanseri çeşitlerinin kendine özgü bir moleküler portresi olduğu ortaya çıkmıştır (1). Meme kanseri gen ekspresyon profillerine göre 5 ana alt-tipe ayrılmaktadır; östrojen reseptörü (ER)-pozitif ve progesteron reseptörü (PR)-pozitif olan Lüminal A, Lüminal B alt-tipleri ve ER-negatif olan HER2-pozitif, bazal-benzeri ve normal meme benzeri alttipleridir (1). İnflamasyon, kanserin temel belirteçlerindendir. Çeşitli immün hücreler tümöre karşı veya tümörü destekleyici özellik gösterir. İmmün hücreler, normal meme stromasının önemli bileşenlerinden değildir. Ancak, edinsel ve doğal immün sistem hücreleri meme kanserinde belirgin düzeyde artış gösterir. İmmün hücre infiltrasyonu hem in situ hem de invaziv karsinomlarda gözlenmektedir. İmmün hücre infiltrasyonunun artışı, memede tümörogenezin ilerlemesi ile paralellik gösterir. Naif T hücrelerin aktivasyonu için MHC/antijen kompleksinin tanınması yeterli değildir. T hücresinin etkin aktivasyonu için ASH tarafından sağlanan kostimülatör moleküllere ihtiyaç vardır. Fakat T hücre aktivasyonunu sağlayan kostimülatör moleküllerin tümör mikroçevresindeki ekspresyonu sınırlı düzeydedir (2). CD28 ve B7 en iyi tanımlanmış ve kostimülasyonda en önemli rol oynayan IgSF reseptörler ailesidir. B7 ailesi üyeleri; B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), B7-H2 (ICOSLG, CD275), B7-H1 (PD-L1, CD274), B7-DC (PD-L2, PDCD1LG2, CD273), B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1) ve B7-H6 dır. Meme kanserinde B7 ailesi düzeylerinin ekspresyonunun varlığı veya nasıl düzenlendiğine dair sınırlı sayıda çalışma mevcuttur. Meme kanserinde, B7-H1 (PD-L1), B7-H4 moleküllerinin ekspresyonu bilinmektedir ve kötü prognozla korelasyon gösterir (3-5). B7-H3 molekülü primer meme kanserinde eksprese olmakta ve metastazla ilişkilidir (6). Bu çalışmanın amacı kapsamında; meme kanseri hücreleri üzerinde B7 ailesi moleküllerinin varlığı ve ekspresyonunun inflamatuvar koşullar

2 altında nasıl düzenlendiği araştırılmıştır. Meme kanseri hücreleri üzerinde yüksek düzeyde varlığı saptanan kostimülatör moleküllerin yardımcı T hücre fonksiyonlarını nasıl etkilediği de belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar lüminal ve bazal-benzeri meme kanseri hücrelerinin yardımcı T hücre aktivasyonu ve proliferasyonunu farklı kostimülatör yolaklar ile modüle ettiğine işaret etmektedir. Bazal-benzeri meme kanseri hücrelerinin T hücre aktivasyonunu desteklemesi ancak aktive T lenfositlerin yüzeyinde bulunan PD-1 inhibitör reseptörüne ait ligandlar B7- H1 ve B7-DC yi sürekli eksprese etmesi söz konusudur.

3 2.GENEL BİLGİLER 2.1. Meme Kanseri Meme kanseri, kadınlarda en sık görülen kanser çeşididir. Meme kanserinin sıklığı Kuzey Amerika, Avrupa ve Avustralya da; Afrika, Güney ve Doğu Asya daki diğer bölgelere kıyasla daha yüksek seyreder (7). Meme kanseri klinik, morfolojik ve moleküler düzeyde farklılıklar gösterir. Bu heterojenite tümör histopatolojisi, klinik seyir ve tedaviye verilen cevaplar açısından incelendiğinde; bütün meme kanseri çeşitlerinin kendine özgü bir moleküler portresi olduğu ortaya çıkmıştır (1). 2.2. Meme Kanserinin Moleküler Alt-Tipleri Meme kanserinin alt-tipleri iki esas epitel hücre tipinin gen ekspresyon profiline göre isim almışlardır. Lüminal epitel hücreler normal meme dokusunda kanal veya lobüllerin lümenini kaplayan tek sıralı hücre tabakasını oluşturur. Bazal miyoepitelyal hücreler ise lüminal hücreleri çevreleyen ikincil hücre katmanını oluşturur. Bu katman bazal membran ile doğrudan temas halindedir (1). Meme dokusunun yapısal bileşenlerini oluşturan hücrelerin yerleşimi Şekil 2.1 de gösterilmiştir. Gen mikrodizin analizlerine göre; meme kanseri östrojen reseptörü (estrogen receptor, ER)-pozitif ve ER-negatif olmak üzere iki temel alt-tipe ayrılmaktadır. Daha sonra, farklı biyolojik ve klinik özelliklerine göre ek alt gruplar ayrılır (Şekil 2.2). Meme kanserlerinin yaklaşık %75 i ER ve/veya progesteron reseptör (progesterone receptor, PR) pozitifliği gösterir. ERpozitif tümörler tipik olarak lüminal epitel hücrelere özgü genleri ifade ederler. Bu nedenle, bu alt-grup Lüminal olarak adlandırılmıştır. Lüminal grup kendi arasında Lüminal A ve Lüminal B şeklinde iki alt gruba daha ayrılır (1).

4 Şekil 2.1. Meme dokusu hücreleri ve memenin dukto-lobüler (kanal-lobül) yapısı (Smalley ve Ashworth (8) den uyarlanmıştır.) Şekil 2.2. Meme kanserinin gen ekspresyon profiline göre moleküler sınıflandırması. (Valentin, M.D., 2012 (1) den uyarlanmıştır).er; östrojen reseptörü, PR; progesteron reseptörü, BBMK; bazalbenzeri meme kanseri, CK; sitokeratin.

5 Meme kanserinin %20-25 ini ER-negatif tümörler oluşturur. ER-negatif kanserler HER2-pozitif, bazal-benzeri ve normal meme-benzeri olmak üzere üç alt-gruba ayrılır: HER2-pozitif tümörler, HER2 gen amplifikasyonuna sahiptirler veya bu yolakla ilişkili genleri yüksek seviyede eksprese ederler. Normal meme-benzeri grubundaki tümörler adipoz hücre ve epitel-olmayan hücre tiplerine ait genlerin yüksek ekspresyon profilini taşırlar. Aynı zamanda, düşük seviyelerde lüminal belirteçleri de eksprese ederler (9). Ancak, bu alt grubun varlığı araştırmacılar arasında halen tartışma konusudur. Bazal-benzeri alt-tipe ait tümörler sitokeratin (cytokeratin, CK)5, CK14, CK17 ve laminin gibi bazal/miyoepitel belirteçlerini yüksek düzeyde barındırırlar. Bu grupta ER, PR ve HER2 reseptörlerine rastlanmaz. Bu nedenle, üçlü negatif (triple negative, TN) olarak da nitelendirilirler. Yine de üçlü negatif ve bazal-benzeri terminolojilerinin birbirinin yerini tutmadığı bildirilmektedir (10). Meme kanserinin yeni tanımlanan alt-tiplerinden biri de klaudin genini düşük düzeyde eksprese eder. Bu nedenle, bu grup Klaudin-düşük (Claudinlow) olarak isimlendirilmiştir. Bu alt-tip, sıkı bağlantı bölgelerinin ve hücrehücre adezyon molekülleri olan klaudin 3, klaudin 4, klaudin 7, occludin ve E- kaderin ile ilgili genlerin düşük düzeyde ifade olmalarıyla karakterizedir. Bu meme kanseri hücrelerinde epitelyal-mezenkimal dönüşüm (epithelial to mesenchimal transition, EMT) sürecinde rol alan ve kök hücre özelliklerini yansıtan genlerin yüksek ifadesi gözlenir. Meme kanserinin en son tanımlanan alt-tipi ise Moleküler Apokrin Tümörler (Molecular Apocrin Tumors) dir. Bu tümörler immünhistokimyasal olarak ER-, PR- ve androjen reseptörü (AR)-pozitiftir (1). 2.2.1. Lüminal A Alt-tipteki Meme Kanserleri Lüminal A, meme kanserinin %50-60 oranıyla en sık rastlanan alt tipidir. Meme kanallarının lüminal epitel hattı boyunca ER transkripsyon faktörünün aktive ettiği genlerin ekspresyonuyla karakterizedir. Hücre proliferasyonuyla ilgili genleri ise düşük düzeyde eksprese ederler. İmmünhistokimyasal profili ER, PR, Bcl-2, lüminal CK 8/18 pozitif; HER2

6 negatiftir. Düşük histolojik evre gösterir. Lüminal A alt-tipinde GATA3 biyobelirteçleri yüksek seviyededir. Bu alt-tipteki meme kanseri hastaları iyi prognoz gösterir ve diğer alt-tiplere göre önemli ölçüde düşük relaps oranına sahiptir. Relapstan sonra sağkalım süresi de uzun (median 2.2 yıl) seyreder. Ancak, relapslar farklı organ metastazları ile ortaya çıkabilir. Yüksek oranda kemik metastazı, düşük oranlarda ise merkezi sinir sistemi, karaciğer ve akciğer metastazları gözlenebilir (11). 2.2.2. Lüminal B Alt-tipteki Meme Kanserleri Meme kanserlerinin %10-20 sini Lüminal B alt-tipi oluşturur. Lüminal A ile karşılaştırıldığında daha agresiftir ve kötü prognoz gösterir. ER düzeyi Lüminal A alt-tipine göre daha düşüktür. Memenin lüminal epitel içeriklerinin, örneğin lüminal sitokeratinlerin CK8/18, ER ve ER aktivasyonunuyla-ilişkili genlerin (siklin D1 gibi) ekspresyon paternini taşır. İki alt-tip arasındaki esas biyolojik farklılık, MKI67, MYBL2 ve siklin B1 gibi proliferasyon genlerinin ekspresyonlarındaki artıştır. Lüminal B de epidermal büyüme faktöri reseptörü (epidermal growth factor receptor, EGFR) ve HER2 ekspresyonu da gözlenebilir. Meme kanserinde, fosfatidilinozitol 3 kinaz (PI3K) sinyal yolağı aktivasyonu mevcuttur. ERBB2/HER2 aktivasyonu, PTEN gibi negatif düzenleyicilerin kaybı, Akt ve PIK3CA amplifikasyonları meme kanserinde gösterilmiştir. Preklinik çalışmalar PI3K sinyal yolağında yer alan genlerin ekspresyon artışını Lüminal B alt-tipindeki meme kanserlerinin bir özelliği olarak tanımlamıştır (11-14). 2.2.3. HER2-Pozitif Alt-tipteki Meme Kanserleri Meme kanserlerinin yaklaşık %15-20 sini HER2-pozitif alt-tipi oluşturur. HER2, EGFR ailesine ait bir reseptör tirozin kinaz (RTK) dır (15). HER2 17q12 kromozom bölgesinde bulunur. HER2-pozitif meme kanseri, HER2 geni ve HER2 sinyal yolağıyla ilişkili genlerin yüksek ekspresyonuyla veya amplifikasyonuyla karakterizedir. (11). HER2 nin alt sinyal yolaklarına sinyal iletebilmesi için diğer ERBB (HER olarak da bilinir) ailesi üyeleri (EGFR, ERBB3, ERBB4) ile dimerizasyonu veya oligomerizasyonu gereklidir.

7 HER2 geninin amplifiye olması durumunda rastgele dimerizasyonlar gerçekleşir ve sinyal iletiminde artış gözlenir (15). HER2-pozitif tümörlerde hücresel proliferasyonla ilişkili genler aşırı düzeyde ifade bulur. Bu tümörlerin %75 i ileri histolojik evrededir ve %40 tan fazlası p53 mutasyonlarını taşır. İmmünhistokimyasal profili, ERnegatif/HER2-pozitif olan tümörlerin sadece %70 inin HER2 proteinini aşırı düzeyde eksprese ettiği bulunmuştur. Ayrıca, mikrodizin analizlerine göre bütün HER2 amplifikasyonu veya aşırı ekspresyonu gösteren tümörlerin de bu alt-gruba dahil edilemeyeceği sonucuna varılmıştır. Örneğin, klinik olarak ER/HER2-pozitif tümörlerin önemli bir bölümü moleküler olarak Lüminal B altgrubuna girer. HER2 amplifikasyonuna sahip tümörler de kendi aralarında klinik sağkalım açısından 3 alt-gruba ayrılır. İlk grup, %12 oranında 10 yıllık sağkalım gösterir ve kötü prognoza sahiptir. Diğer gruplar ise, %50 ve %55 oranlarında 10 yıllık sağkalım gösterirler. Bu durum, tümörlerin iyi ve kötü prognoza göre derecelendirilmesini sağlamış ve HER nin prognostik belirteç olarak kullanılmasına yol açmıştır (11). 2.2.4. Bazal-benzeri Alt-tipteki Meme Kanserleri Meme kanserlerinin %10-20 sini bazal-benzeri alt-tip oluşturur. Genellikle bazal/miyoepitel hücre belirteçlerini yüksek düzeyde eksprese ederler. Bunlar, yüksek moleküler ağırlık gösteren sitokeratinler CK5, CK6, CK14, CK17, vimentin, P-kaderin, caveolin1, caveolin2, nestin, CD44 ve EGFR dir. Ayrıca, lüminal epitel genleri olan CK8/18 ve c-kit de eksprese edebilirler. Ancak, bu genlerin ifade seviyeleri lüminal alt-tipteki kanserlerden belirgin seviyede düşüktür. Bazal-benzeri tümörler yüksek mitotik indeks, nekroz, yayılım ve belirgin lenfositik infiltrasyon ile karakterize invaziv duktal karsinom özelliklerini taşımaktadır. Bazal-benzeri meme kanserleri, sıklıkla merkezi sinir sistemine ve lenf düğümlerine metastaz yapar. İmmünhistokimyasal profili, ER-, PR- ve HER2-negatiftir. Bu nedenle üçlü negatif de denir. Bazal-benzeri alt-tipi belirlemek için immünhistokimyasal olarak 5 belirteç belirlenmiştir: ER, PR, HER2, EGFR ve CK5/6 (11). Bu tip kanserlerde integrin moleküllerinin ekspresyonunda da düzensizlikler

8 saptanmıştır. Bazal-benzeri meme kanseriyle ilişkili pek çok gen, hücre proliferasyonu, sağkalımı, migrasyonu ve invazyonunu destekler. Bu süreçte çok çeşitli sinyal yolakları rol oynasa da mitojen-aktiflenmiş protein kinaz (mitogen-activated protein kinase, MAPK), PI3K-AKT ve nükleer faktör-kb (nuclear factor-kb, NF-kB) en çok düzensizlik gösteren sinyal yolaklarıdır (1). Bazal-benzeri meme kanserinde Wnt sinyal yolağının aktivasyonu da gözlenmektedir. Sitoplazmada ve çekirdekte β-katenin birikimi söz konusudur. İnsan meme tümörlerinde ve fare modellerinde aktive olan Wnt sinyal yolağının meme tümörogenezini desteklediği gösterilmiştir (16, 17). Bazal-benzeri tümörler, lüminal alt-tipteki tümörlere göre daha kötü prognoz gösterir. Bu tümörlerin taşıdıkları p53 mutasyonları agresifliğinin ve kötü prognozunun kanıtı niteliğindedir. BRCA1 geninde germ-line mutasyon taşıyan tümörler de bu gruba girmektedir. BRCA1, DNA tamirinde önemli rol oynar. BRCA1 in mutasyonları nedeniyle inaktivasyonu, tümör büyümesiyle ilişkili genetik instabilitenin oluşmasına yol açar (11). 2.2.5. Normal Meme-Benzeri Alt-tipteki Meme Kanserleri Meme kanserlerinin %5-10 unu normal meme-benzeri alt-tip oluşturur. Adipoz doku genlerinin ekspresyonuyla karakterizedir. Normal meme-benzeri alt-tipinin prognozu lüminal alt-tipe kıyasla daha kötü, bazal-benzeri alt-tipe kıyasla ise daha iyidir. Bazal-benzeri alt-tipteki meme kanserleri gibi üçlü negatif immünhistokimyasal profile sahiptirler. Ancak, bazal-benzeri alt-tipte görülen CK5 ve EGFR genlerini eksprese etmezler (11). Bazı araştırmacılar mikrodizin çalışmaları sırasında tümör dokusunun adipoz/bağ doku ile yüksek kontaminasyonu nedeniyle bu grubun belirlendiğini düşünmektedir (18). 2.2.6. Klaudin düşük Alt-tipteki Meme Kanserleri Sıkı bağlantı ve hücreler arası adezyon molekülleriyle ilgili genlerin düşük ekspresyonlarıyla karakterizedir. Klaudin 3, klaudin 4, klaudin 7, cingulin, ocludin ve E-kaderin ekpresyonu eksikliklerinden dolayı Klaudindüşük (claudin low) adını alırlar. Hiyerarşik gruplamada bu alt-tip bazal-

9 benzeri alt grubun yanında yer alır. Ancak, bazal-benzeri alt-grubun aksine tümörde immün infiltrasyonun artmasını indüklediği bilinen 40 adet geni aşırı düzeyde eksprese eder. Bu tümörlerde hücre çoğalmasıyla ilişkili genler düşük düzeyde ifade olmasına rağmen kötü prognoz görülür. Epitelyalmezenkimal geçiş (EMT) ve mezekimal farklılaşma ile ilgili genlerin ekspresyonları sebebiyle kanser kök hücre (cancer stem cell, CSC) fenotipi kazanırlar. İmmünhistokimyasal olarak üçlü negatif olarak nitelendirilirler. Ancak, bazal-benzeri alt-tipte olduğu gibi klaudin-düşük alt-tipinde vakaların yaklaşık %20 sinin hormon reseptörü pozitifliği de gösterebileceği bildirilmiştir (1, 11). 2.2.7. Apokrin Alt-tipteki Meme Kanserleri Apokrin tümörler, invaziv duktal karsinomların bir alt-tipi olarak tanımlanmışlardır. Bu tümörler, androjen reseptörü (AR) ekspresyonuyla karakterizedir. Fakat ER ve PR ekpresyonu yoktur. Apokrin tipteki kanserlerde sıklıkla HER2 nin aşırı ekspresyonu görülmektedir. HER2 ekspresyonu olmayan apokrin tümörler üçlü negatif fenotipine girer. 2.3. Meme Kanserine Karşı İmmün Yanıtlar Lökosit infiltrasyonu ve tümör mikroçevresinde yer alan hücre tipleri meme dokusunun neoplastik dönüşümünde ve kanserin progresyonunda önemli etkilere sahiptir (19). 2.3.1. Meme Kanseri ve İnflamasyon İnflamasyon, kanserin temel belirteçlerindendir. Çeşitli immün hücreler tümöre karşı veya tümörü destekleyici fonksiyon gösterir. İnflamasyon ve kanser arasındaki ilişki iki yolak altında incelenmektedir: İntrinsik yolak ve ekstrinsik yolak (Şekil 2.3). İntrinsik yolak, neoplaziye sebep olan genetik değişikliklerle aktive olur. Bu değişiklikler, mutasyon sonucu onkogen aktivasyonu, kromozom rearanjmanı veya amplifikasyonu ve tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonudur. Bu süreçte, transforme olan hücrelerin inflamatuvar aracılar üretmesi nedeniyle inflamatuvar bir mikroçevre oluşur.

10 Meme kanserinde de bu yolak çalışmaktadır. Ekstrinsik yolakta ise, patojen veya yaralanma sonucu oluşan inflamasyon ve enfeksyon kanser gelişimi riskini artırır. Her iki yolak da, tümör hücrelerindeki benzer transkripsyon faktörlerini aktive eder. Bu süreçte yer alan en önemli transkripsyon faktörleri, nükleer faktör-kb (NF-kB), signal tarancducer and activator of transcription 3 (STAT3), hypoxia-inducible factor 1α (HIF1α) dır. Bu transkripsyon faktörleri sitokinler ve kemokinler gibi inlamatuvar aracıların ve siklooksijenaz 2 (COX2) nin üretimini düzenler. Bu sayede tümör dokusuna çeşitli lökositler çağırılır ve aktive edilirler. Üretilen inflamatuvar sitokinler de stromal hücreler ve tümör hücrelerinde yine benzer transkripsyon faktörlerini uyarırlar. Böylece, inflamatuvar aracıların düzeyi yükselir ve kanser mikroçevresi gelişir. Kanser nedenli inflamasyonun alevlenmesinin tümörü destekleyen pek çok yanı vardır. Hücre proliferasyonu, sağkalımı, epitelyal mezenkimal dönüşüm, anjiyogenez, tümör hücresinin migrasyonu, invazyonu ve metastaz desteklenirken, özellikle edinsel anti-tümör immün yanıtlar inhibe edilir

11 Şekil 2.3 Kanser gelişiminde etkili inflamatuvar yolaklar (Mantovani ve ark. (20) den uyarlanmıştır).

12 İmmün hücreler, normal meme stromasının önemli bileşenleri arasında değildir. Ancak, edinsel ve doğal immün sistem hücreleri meme tümörü dokusunda belirgin düzeyde artış gösterir. İmmün hücre infiltrasyonu hem in situ hem de invaziv karsinomlarda gözlenmektedir. İmmün hücre artışı, memede tümörogenezin ilerlemesi ile paralellik gösterir (Şekil 2.4). Tümör mikroçevresinde hem doğal bağışıklık hücreleri, doğal öldürücü (natural killer, NK) hücreler, doğal öldürücü T (natural killer T, NKT) hücreleri, makrofajlar ve dendritik hücreler (DC), hem de edinsel bağışıklık hücreleri; yardımcı T hücreleri, sitotoksik T hücreleri ve B hücreleri bulunur (19). Şekil 2.4. Meme kanseri gelişimi immün hücrelerin bol infiltrasyonu ile karakterizedir. Normal, pre-malin ve malin tümörlerin hematoksilen ve eozin (H&E) boyası ile boyanmış temsili fotoğrafları gösterilmiştir. Kırmızı oklar tümöre infiltre olan immün hücreleri göstermektedir (DeNardo ve ark., (19) den uyarlanmıştır).

13 Doğal bağışıklık hücreleri dokunun tamirinde ve yeniden şekillendirilmesinde görev alır. Bu hücreler tarafından salgılanan faktörler genellikle tümör büyümesini destekler (21). Makrofajlar salgılanan proinflamatuvar sitokinlerin ana kaynağıdır. Bu hücreler genellikle tip 1 (M1) veya tip 2 (M2) fenotipinde bulunurlar. M1 lerden salgılanan IL-12, yardımcı T hücre 1 (Th1) gelişimine ve anti-tümör sitotoksik etkilerine yardımı olur (22). M2 ler immün baskılayıcı sitokinler salgılar ve tümör hücrelerinin büyümesini destekler. Tümör-ilişkili makrofajlar (TAM lar) genellikle M2 fenotipindedirler. Bu hücrelerin infiltrasyonu pek çok kanserde kötü prognozun belirtecidir. TAM lar invazyon ve metastazı artıran pek çok proteaz salgılar. Salgıladıkları sitokinler tümöre özgül edinsel immün yanıtları inhibe eder ve anjiyogenik faktörler de neovaskülerizasyonu artırır (23). Miyeloid kökenli baskılayıcı hücreler (Myeloid-derived suppressor cells, MDSC ler), kanser büyümesine destek olan başka bir grup doğal immün sistem hücreleridir. MDSC ler miyeloid öncüllerden matür miyeloid hücre oluşumunun engellendiği kronik inflamasyon sırasında oluşurlar. Bu hücreler edinsel immün yanıtları çeşitli mekanizmalarla inhibe ederler. Salgıladıkları faktörlerle düzenleyici T hücreleri (regulatory T cells, Treg) uyarırlar. Ayrıca, MDSC lerin anti-tümör immüniteyi yardımcı T hücre 2 (Th2) yanıtlarına dönüştürmede rol oynadığı da gösterilmiştir (Sinha, P. ve ark. 2007). Diğer immün sistem hücreleri; nötrofiller, mast hücreleri ve eozinofiller de proliferatif özellikteki tümör mikroçevresinin oluşumuna katkıda bulunur (21). Ayrıca, dendritik hücreler (DC), etkin anti-tümör immün yanıtların uyarılmasında kritik öneme sahiptir. Tümör mikroçevresinde yer alan DC ler ve diğer profesyonel antijen sunucu hücreler, T hücreleri uyarmakta başarısız olarak tümörün immün sistemden kaçışına yardımcı olabilirler (24). Adaptif immün sistem hücreleri de tümör büyümesine yardımcı olabilir. B hücrelerinin de doğal immün sistem hücrelerinin tümöre yönelmesinde önemli rol oynayabildiği gösterilmiştir (25).

14 2.3.2 Meme Kanserinde T Hücre Yanıtları Tümöre özgül immün yanıtlar, matür antijien sonucu hücreler ve proinflamatuvar çevre arasındaki etkileşimler tarafından yönetilir (26). CD4 + yardımcı T hücreler, inflamatuvar süreçlerde anahtar rol üstlenir. Yardımcı T hücrelerin alt grupları; Th1, Th2, Th9, Treg, Th17 ve Th22, farklı inflamasyon tiplerini desteklemek üzere özelleşmişlerdir. Salgıladıkları sitokinler özgül immün yanıtların oluşmasına olanak sağlar. Tümör gelişimi sırasında tüm yardımcı T hücre alt-tiplerinin farklı şekillerde fonksiyon gördüğü bilinmektedir (Şekil 2.5). Şekil 2.5. Tümör gelişimi süresince T hücre yanıtlarının polarizasyonu (Johansson, M. (26) dan uyarlanmıştır. Th1 alt tipindeki CD4 + sitotoksik T lenfosit (CTL) aktivasyonunu, immünglobulin (Ig)G2a ve IgG3 üretimini destekler (27). Bu sayede hücre içi patojenler dahil, pek çok enfeksiyöz mikroorganizmanın yok edilmesinde önemli rol oynarlar. Kanser gelişiminde, interferon (IFN)-aracılı anti-tümör immünite, Th1 yanıtlarını düzenler (28). Th1 polarizasyonu, T hücre reseptör

15 (TCR) aktivasyonunun STAT1 sinyal yolağı aracılığıyla gerçekleşmesi ile oluşur. Bu yolağı uyaran sinyaller IL-12 reseptörü IL-12Rβ2 zincirinin ekspresyonunu artırır (29). Böylece, Th1 farklılaşması için gerekli olan IL-12 daha yüksek düzeyde algılanır. Bu durum IFN-γ ve IL-18R-α ekspresyonunu da uyarır. Matür Th1 efektör hücreler TCR-bağımlı yolaklarla IFN-γ üretir; ancak, IL-12 ve IL-18 ile aktive edilirlerse antijen uyarımından bağımsız olarak da sitokin üretebilmektedir (26). Th1 hücreleri dendritik hücrelerin uyarımıyla akut inflamasyonu indükler ve CTL oluşumunu destekler. IL-12, IFN-γ, TNF-α ve IL-2 gibi sitokinler ve tümör hücrelerinden eksprese edilen pek çok tümöre özgül antijenler (mutant veya aberan eksprese edilen p53, IFGBP-2, HER2 ve htert gibi) CTL lerin çoğalmasını, tümöre infiltrasyonunu ve tümör hücrelerinin öldürülmesini sağlar (Şekil 2.6). Şekil 2.6. CTL ler tarafından tümörün reddi. Gri şekiller lizize uğrayan ve ölü tümör hücrelerini göstermektedir (Disis, M (30) den uyarlanmıştır) Th2 hücrelerinin tümörü ilerletme kapasiteleri iyi bilinmektedir. Meme kanseri, yüksek seviyede IL-4, IL-13 ve TNFα eksprese eden Th2 hücrelerini infiltre edilebilir (31). Bu hücreler, dendritik hücrelerin tümörden salgılanan timik stromal lenfopoietin (thymic stromal lymphopoietin, TSLP) ye yanıt olarak eksprese ettikleri OX40 ligand (OX40L) tarafından yönlendirilirler (Şekil 2.7) (32). Th2 hücrelerinin IL-13 üretimi açısından insan özellikleri

16 taşıyan farelerde meme kanserinin büyümesini artırdığı gösterilmiştir (31). IL- 13, miyeloid hücrelerin TGFβ üretimini uyarır. Bu durum, Treg hücrelerinin gelişimini tetikler ve sitotoksik T lenfositleri baskılar (33). Meme kanseri hücreleri IL-13 uyarımına yanıt olarak STAT6 (phospho-signal tranceducer and activator of transcription 6) eksprese eder. Böylece kanser hücrelerinde anti-apoptotik yolaklar aktive olur. Ayrıca, bu durumun sitotoksik CD8 + T hücrelere ve sitotoksik ilaçlara dirençle de ilgisi olabilir (34). Transgenik meme kanseri modelinde IL-4 ün ise TAM ların M2 fenotipine geçişini sağladığı gösterilmiştir (35). Th2 ler tümör mikroçevresinde IL-4 ve IL-13 salgılayarak doğrudan veya makrofajlar aracılığıyla dolaylı olarak tümör gelişimini destekler. Doğrudan etkileri, epitel kanser hücreleri üzerinde antiapoptotik yolakları veya steroid metabolizmasını çalıştırmasıdır. Dolaylı etkileri ise, TAM ların EGF ve pro-anjiyojenik VEGF ekspresyonunu artırmaktır. Ayrıca, TAM lar indüklenebilen nitrik oksit sentaz (inos) ve arjinaz eksprese ederek CD8 + T hücre proliferasyonunu baskılar. Klinik olarak, Th2 hücreleri ve transkripsyon faktörü GATA-3 meme kanseri hastalarının lenf düğümlerinde arttığı gözlenmiştir. Bu artış hastalığın ilerlemesini hızlandırır ve sağkalım oranlarını düşürür (36) (Bkz. Şekil 2.5).

17 Şekil 2.7 Th2-tipi immün yanıtların TSLP ile indüklenmesi. Tümör mikroçevresinde bulunan DC ler tümörden salgılanan faktörlere maruz kaldığında, ekprese ettikleri OX40L ile Th2-tip inflamasyonu başlatır. (Coussens ve ark., (36) den uyarlanmıştır). CD4 + hücrelerin bir diğer sınıfı düzenleyici T (Treg) hücreleridir. Treg ler, transkripson faktörü FoxP3 ü yüksek düzeyde taşır ve özgül immün yanıtları ve inflamasyonu baskılar (37). T hücre reseptörünün antijenle uyarımı, IL-2 salınımı ve transforme edici büyüme faktörü-β (TGF-β) varlığında Foxp3 indüklenir (38). Treg ler sitotoksik T lenfositlerin efektör etkilerini baskılar ve otoimmün hastalıklardan korunmada önemli rolleri vardır (39, 40). Treg hücrelerinin, timusta bulunan doğal Treg hücreleri ve periferal dokularda farklılaşan adaptif Treg hücreleri olarak tanımlanan iki alt grubu bulunmaktadır. Doğal Treg hücreleri CD4 + CD25 + FoxP3 + hücrelerdir ve timusta biçimlendirilirler (40). Doğal Treg ler hücre yüzey molekülleri olan

18 CTLA4, membran bağımlı TGF-β ile immün yanıtları baskılarlar. Adaptif Treg hücreleri CD4 + CD25 + FoxP3 +/low hücrelerdir ve IL-10, TGF-β varlığında periferal dokularda biçimlenirler. Adaptif Treg hücreleri IL-10 ve TGF-β salgılayarak immün yanıtları baskılar (Bkz. Şekil 2.6). Treg lerin aktivasyonu için TCR uyarımı gereklidir. Ancak, Treg hücresi bir kez aktive oldu mu körü körüne diğer T hücreleri baskılar (27). Treg hücrelerinin dört temel baskılama mekanizması; inhibitör sitokinler IL-10, IL- 35, TGFβ aracılı baskılama, sitoliz (granzim-a, granzim-b ve perforinbağımlı) ile baskılama, metabolik bozulma ve DC lerin matürasyonunu veya fonksiyonunu değiştirerek baskılama olarak sıralanabilir. Metabolik bozulmada Treg hücresi IL-2 ye yüksek afinite gösteren CD25 molekülünü eksprese eder. CD25 IL-2R2α alt birimidir ve ortamdaki IL-2 yi bağlayarak uzaklaştırır. Ayrıca, silkik AMP (camp) aracılı baskılama veya CD39-CD73, adenozin reseptör 2A aracılı baskılama da metabolik düzeyde gerçekleşir. DC hedeflendiğinde ise, lenfosit aktive edici gen 3 (LAG3)-MHC sınıf II aracılı baskılama yapar ve CTLA-4-CD80/CD86 etkileşimi ise immünsüpresif bir molekül olan indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) nun eksprese edilmesini sağlar (Şekil 2.8). Meme kanserinde Treg hücreleri FoxP3 pozitifliği gösterir ve tümörün agresifleşmesine paralel olarak artış gösterir. İnvaziv meme kanserlerinde bulunan yüksek sayıdaki FoxP3 + T hücreleri hastaların sağ kalımındaki düşüşle korelasyon gösterir (41).

19 Şekil 2.8 Treg hücreleri tarafından kullanılan baskılama mekanizmaları. Sitokin aracılı baskılama, sitoliz, metabolik bozulma ve DC lerin baskılanması gösterilmektedir (Dario ve ark. (42) den uyarlanmıştır). Naif T hücrelerden Th17 gelişimi TGF-β ve IL-6 varlığında meydana gelir (43). IL-1, IL-18 ve IL-23 varlığında uyarılmış Th17 hücrelerinde sitokin üretimi daha da güçlenir (27). CD4 + Th17 hücreleri hücre dışı bakterilerin yok edilmesine, otoimmün hastalıklarda granülositlerin göçünü ve IgM, IgG, IgA ekspresyonunu sağlayarak katkıda bulunur (27). Tümöre infiltre Th17 hücreleri düşük düzeyde anti-inflamatuvar sitokin olan IL-10 da eksprese ederler ancak bu hücrelerin çok büyük bir bölümü efektör sitokinler olan IL-2, granülosit-makrofaj koloni-stimüle edici faktör (GM-CSF), IFN-γ ve tümör nekroz faktör (TNF) üretirler (44). IL-17 ve IFN-γ, tümör hücrelerinden CXCL9 ve CXCL10 kemokinlerinin ekspresyonunu uyarır. Bu durum sitotoksik CD8 + T hücrelerinin tümöre yönelmesine yol açar. Bu hücrelerin esas protümöral etkileri anjiyogenezle ilgilidir. Miyeloid hücrelerin tümör mikroçevresine göçüne ve nötrofillerin elastaz salgılamasına yol açarlar.

20 2.4 Kostimülasyon Dokuda yerleşen antijen sunan hücreler (ASH), antijenin hücre içerisine alınması ve sunulmasında mükemmel rol üstlenirler. Ancak, bunların neoplastik dokuda anti-tümör immün yanıtların en etkin oyuncusu olan T hücreyi uyarma yetenekleri sınırlıdır. Naif T hücrelerin aktivasyonu için MHC/antijen kompleksinin tanınması yeterli değildir. T hücresinin etkin aktivasyonu için ASH tarafından sağlanan kostimülatör moleküllere ihtiyaç vardır. Fakat T hücre aktivasyonunu sağlayan kostimülatör moleküllerin tümör mikroçevresindeki ekspresyonu sınırlı düzeydedir (2). Ancak, kostimülatör moleküllerin bazı tümör hücrelerinin yüzeyinde (örneğin, akut miyeloid lösemiler, B hücreli lenfoma, multipl myeloma gibi) eksprese olduğu bildirilmektedir. Bu kostimülatör moleküller immün yanıtta aktivasyon, düzenleme ve inhibisyon gibi farklı etkileri bulunmaktadır. Bir çok ko-sinyal molekülü immün immünglobulin süperailesi (Immunoglobulin superfamily, IgSF) veya tümör nekroz faktörü süperailesi (tumor necrosis factor superfamily, TNFRSF) üyesidir. B7 kostimülasyon molekül ailesi IgSF içinde yer almaktadır. Ayrıca, CD150 sinyali lenfositik aktivasyon molekülü (SLAM) ve CD2 kostimülasyon molekül aileleri de bulunmaktadır. 2.4.1 B7 Kostimülatör Ligand Ailesi CD28 ve B7 en iyi tanımlanmış ve kostimülasyonda en önemli rol oynayan IgSF reseptörler ailesidir. CD28 ailesi üyeleri iki istisna dışında B7 ailesi üyeleri ile etkileşirler. Bunlardan birisi TNFRSF14 e bağlanan koinhibitör reseptör; B ve T lenfosit attenüe edici (BTLA) molekülü, diğeri ise doğal öldürücü hücre p30-ilişkili protein (NKp30) a bağlanan B7-H6 dır (45). B7 ailesinin ko-aktivatör reseptörler ile etkileşimi immün yanıtları güçlendirir. Ancak, bazı B7 molekülleri ko-inhibitör reseptörler ile etkileşir ve immün cevapların sonlandırılmasında rol alır (46). B7 ailesi üyeleri; B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), B7-H2 (ICOSLG, CD275), B7-H1 (PD-L1, CD274), B7-DC (PD- L2, PDCD1LG2, CD273), B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1) ve B7-H6 dır.

21 T hücrede bulunan kostimülatör reseptör sitotoksin T hücre antijen 4 (Cytotoxic T lymphocyte antigene 4, CTLA-4, CD28, indüklenebilir T hücre kostimülatör (Inducible T cell costimulator, ICOS) ve programlı hücre ölümü (programmed cell death 1, PD-1) tek bir immünglobulin değişken (IgV) bölgesinden oluşur. B7-1, B7-2, B7-DC, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4 ise benzer yapısal özellikler taşırlar. Membrana yakın olan immünglobulin sabit (IgC) bölgesi ve uzak olan IgV bölgelerinden oluşurlar (47) (Şekil 2.9). B7 ligand ailesinin hem aktivatör hem de inhibitör özellik gösteren üyeleri vardır. B7-1 ve B7-2 bağlandıkları reseptöre göre T hücreleri aktive edici veya inhibe edici sinyaller gönderebilirler. B7-H2 molekülü de aktive edici sinyal gönderen moleküllerdendir. B7-H1, B7-H4 ve B7-DC molekülleri ise inhibitör sinyaller gönderen ko-inhibitör moleküllerdir (Şekil 2.11). Ayrıca B7-H3 hem aktivatör hem de inhibitör sinyaller gönderen B7 ligandıdır. Şekil 2.9. B7 ligand ailesi ve reseptörlerinin yapısı (Zou ve Chen (48) den uyarlanmıştır). ASH, antijen sunan hücre. T hücre aktivasyonu için, antijenle uyarım ve ikincil uyarımın gerekli olduğu klasik iki sinyal hipotezi oluşturulmuştur. Naif CD4 + ve CD8 + T hücreler sürekli olarak CD28 eksprese ederler. CD28 in antijen sunucu

22 hücreler üzerinde bulunan B7-1 ve B7-2 ile bağlanması T hücrelerin büyümesi ve sağkalımı için gerekli ikinci sinyali oluşturur. T hücre aktivasyonu sonucu eksprese olan CTLA-4 T hücre yanıtlarını inhibe edebilecek sinyaller ileten bir reseptördür. CTLA-4 ün ekspresyonu arttıkça, CD28 endositoz ile hücre yüzeyinden uzaklaştırılır (49). Antijen sunucu hücre aktivasyonuyla B7-1 ve B7-2 moleküllerinin ekspresyonu düzenlenir. B7-2 nin ASH ler üzerinde düşük seviyelerde ekspresyonu devamlı olarak bulunur. ASH lerin enfeksiyon, stres veya hücre hasarlarını tanımasından sonra B7-1 ve B7-2 moleküllerinin ekspresyonları uyarılır. Bu nedenle, T hücreler ve ASH ler üzerindeki reseptörlerin ve ligandların düzenlenmesi, T hücrelerin aktivasyonu ve yabancı antijenlere karşı yanıtlarının yanı sıra anormal veya otoreaktif T hücre yanıtlarının kontrolü için de gereklidir (Şekil 2.10). Şekil 2.10 B7-CD28 ligand-reseptör ilişkisinin modellemesi T hücrenin ikinci sinyaller aracılığı ile uyarılması ve daha sonra baskılanması. IDO, indolamin 2,3-dioksijenaz (Chen ve Flies (45) den uyarlanmıştır).

23 Bazı kostimülatör moleküllerin etkileşimleri iki yönde de sinyal iletimini tetikler. Örneğin, dendritik hücreler üzerinde bulunan B7-1 ve B7-2 nin CTLA-4 ile bağlanması indolamin 2,3-dioksijenaz ekspresyonunu uyarır. IDO, ortamdaki triptofanı azaltır ve bu sayede T hücrelerin fonksiyonlarının baskılanmasını sağlar (Şekil 2.11). Ayrıca, B7-1 eksprese eden T hücrelerin B7-H1 eksprese eden T hücrelerle etkileşmesi sonucunda inhibitör sinyaller her iki T hücreye de ulaşır (50, 51). Ayrıca, B7-H1-PD1 etkileşimlerinde de iki yönlü sinyal iletimi oluşmaktadır. PD-1, T hücrelerde B7-H1 ile bağlanmasını takiben inhibitör sinyaller gönderir. Şekil 2.11 T hücrelerde ko-sinyal etkileşimleri (Chen ve Flies (45) den uyarlanmıştır)

24 CD28 molekülünün pek çok fonksiyonu sitoplazmik kuyruklarında bulunan YMNM ve PYAP motifleri aracılığyla oluşur. Proksimal YMNM motifi PI3K sinyal yolağıyla ilişkilidir. CD28-PI3K-AKT yolağının aktivasyonu, NFkB aktivasyonuyla beraber T hücrelerin çoğalmasını ve sağ kalımını destekler (52). ICOS da bulunan proksimal motif PI3K yolağının aktivasyonunu daha yüksek seviyede yapar böylece CD28 ile karşılaştırıldığında AKT sinyalleri güçlü uyarılır. ICOS ayrıca C-MAF yolağı aracılığıyla IL-4 üretimini de tetikler (53). Ko-inhibitör moleküller BTLA, PD-1 ve CTLA-4 T hücre aktivasyonunu ve fonksiyonlarını hücre-içi SH2 bölgesi-içeren tirozin fosfatazlar (Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1, SHP1) ve SHP2 aracılığıyla baskılar. Bu fosfatazların defosforilasyonu T hücrelerin kostimülasyonu için elzemdir. PD-1 ayrıca RAS-ERK sinyal yolağını da baskılar (Şekil 2.12). Şekil 2.12 CD28 ailesi reseptörlerinin ko-stimülatör ve ko-inhibitör sinyal yolakları (Chen ve Flies (45) den uyarlanmıştır).

25 İmmün kontrol moleküllerinden olan PD-1 ve ligandı PD-L1, PD-L2 ekspresyonu T hücre yanıtlarını düzenleyen inhibitör yolaklarının başında gelir. Tümör ve tümöre infiltre miyeloid hücrelerde PD-L1 ekspresyonu, PD-1 eksprese eden T hücreler üzerinde inhibe edici sinyaller gönderir ve tümör hücrelerinin immün gözetimden kaçışını sağlar. Tümör mikro çevresinde sürekli olarak antijenlere maruz kalan CD4 + T hücreler ve CD8 + T hücreler PD-1 eksprese ederler. Kronik viral enfeksyonlarda, PD-1 sinyal yolağının blokajı CD8 + T yanıtlarını artırmıştır (54, 55) Bunun aksine, başka çalışmalarda konvansiyonel kemoterapinin PD-L1 eksprese eden makrofajların sayısını artırdığı ve CD8 + T hücrelerini inhibe ettiği gösterilmiştir(55). Aktive T hücreler üzerinde eksprese olan PD-1 ko-reseptörünün ve periferal dokularda ve aktive T hücre, B hücre, monosit ve DC lerde ekspresyonu bilinen PD-1 ligandları B7-H1 (PD-L1) ve B7-DC (PD-L2) nin (2) etkileşerek immünsüpresif bir tümör mikroçevresi oluşturduğunu gösterilmiştir. B7-H1 normal meme dokusunda eksprese olmaz, fakat meme kanseri doku örneklerinde ER-pozitif tümörlerde %21, ER-negatif tümörlerde ise %45 oranlarında B7-H1 pozitifliği gösterilmiştir (3). Ayrıca bazı meme kanseri hücre hatlarında da sürekli ekspresyonunun olduğu bilinmektedir(56). B7-H1 polimorfizmlerinin sporadik meme kanseriyle ilişkili olduğu da Hua ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir (57). Tümörde B7-H1 ekspresyonu, ERnegatif/PR-negatif tümörlerde Evre III ile ilişkilidir. Evre III ve HER2-pozitif meme tümörlerine infiltre olan lenfositlerde PD-1 pozitifliğinin tümör boyutu arttıkça yükseldiği gösterilmiştir. Ayrıca, meme kanseri doku örneklerinde B7- H1 ekspresyonu ile FoxP3 + Treg infiltrasyonu arasında korelasyon belirlenmiştir (58). Tümörde B7-H1 ekspresyonu, FoxP3 + Treg ve PD-1 + lenfositlerin infiltrasyonu yüksek histolojik evre ile ilişkilidir (3, 59). B7-H1 ekspresyonu, IFN-γ başta olmak üzere pek çok sitokin tarafından düzenlenir(60). Birçok hücre hattıyla yapılan çalışmalarda IFN-γ nın, B7-H1 ekspresyonunu yüksek seviyelere çıkardığı bulunmuştur (59). IFN-γ, normal epitel hücrelerinde, vasküler endotelyal hücrelerde ve miyeloid DC lerde B7-

26 H1 ekspresyonunu artırır (3, 59). B7-H1 eksprese eden kanser hücreleri de bu bağlanmanın sonucunda anti-apoptotik sinyaller alırlar (61, 62). B7-H2 (ICOSL), B hücreler, makrofajlar ve lenfoid-olmayan dokularda eksprese olur. CD28 ailesinin diğer bir üyesi olan, B ve T hücreler üzerinde bulunan ICOS reseptörüne bağlanarak ko-aktivasyona aracılık eder. B7-H2- ICOS bağlantısı CD4 + T hücrelerin aktivasyonu, efektör hücreye farklılaşması ve fonksiyonlarının düzenlenmesi için gereklidir. En son dönemde yayınlanan bir çalışmada, B7-H2 kostimülatör molekülünün CD28 reseptörüne de bağlanabildiği ve T hücre aktivasyonunda etkili olduğu gösterilmiştir (63). ICOS, Th2 hücrelerin çoğalmasını ve fonksiyonlarını artıran sinyaller üretir. Ancak, ICOS un diğer yardımcı T hücrelerin (Th1, Th2, Th17, T FH ) ve Treg lerin de fonksiyonlarını ve çoğalmalarını belirli koşullarda desteklediği gösterilmiştir (49, 53, 64). B7-H2-ICOS bağlanması T hücrelerde yüksek düzeylerde IL-4 ve IL-10 üretimini uyarır. In vivo çalışmalarda ICOS un Th1 ve Th2 hücrelerinde hem ilk uyarımda hem de efektör fonksiyonları boyunca sitokin üretimine destek olduğu belirlenmiştir (65). B7-H2 ekspresyonu doku tümörlerinde, miyeloma ve akut miyeloid lösemi hücrelerinde bulunmaktadır(66, 67). Ayrıca T hücre, B hücre, makrofaj, epitel ve endotel hücreler üzerinde de ekspresyonu bulunur (68). Faget ve arkadaşları meme kanserinde infiltre ICOS + T hücrelerle ilgili yaptıkları çalışmada; ICOS + hücrelerin lenfoid agregatlarda yüksek sayıda bulunduğunu, bu infiltrasyonun lüminal A/B moleküler alt-tiplerle, negatif ER ve HER2/neu aşırı ekspresyonu ve üçlü negatiflik durumuyla ilişkili olduğunu, ancak ICOS Ligandı B7-H2 yi hem hücre hatlarında hem de meme kanseri dokularında gösteremediklerini belirtmişlerdir (69). İnsan B7-H3 molekülü aktive monosit ve dendritik hücrelerde, hava yolu epitel hücrelerinde, kas hücrelerinde, inflamasyon koşullarında sinoviyositlerde ve pek çok tümör hücresinde eksprese olabilir. B7-H3 ün T hücrelerin hem ko-aktivasyonunda, hem de ko-inhibisyonunda rol oynadığı yönünde bulgular vardır. Bu nedenle, T hücre aracılı immün cevapları düzenlemede fonksiyon gördüğü düşünülmektedir. B7-H3 ün immün aktivasyonun erken dönemlerinde Ag-spesifik T hücre proliferasyonunu

27 artırdığı, sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonu ve IFN-γ üretimini uyardığı belirlenmiştir. Diğer yandan, bağımsız gruplar tarafından gerçekleştirilen farklı çalışmalarda B7-H3 ün T hücre yanıtlarını inhibe edebildiği yönünde de bulgular elde edilmiştir. Pek çok kanserde B7-H3 ekspresyonunun ileri evre, metastaz ve/veya kötü prognoz ile bağlantılı olduğu gösterilmiştir (70, 71). Primer duktal ve lobüler meme kanseri hastalarında yapılan bir çalışmada alınan örneklerin %90.6 sında B7-H3 molekülünün ekspresyonu gösterilmiştir (72). B7-H4 molekülünün immün sistem hücrelerinden ziyade epitel dokuda, böbrek, akciğer ve pankreasta ekspresyonu vardır. IL-6 ve IL-10 monosit, makrofaj ve miyeloid dendritik hücrelerde B7-H4 ekspresyonunu uyarır. GM- CSF ve IL-4 ise azaltır. In vitro çalışmalar B7-H4 ün CD4 + ve CD8 + T hücre proliferasyonunu, sitokin üretimini ve alloreaktif sitotoksik T lenfosit gelişimini inhibe ettiğini göstermiştir (4, 5). B7-H4 ekspresyonu kanser dokusunda yüksek düzeyde olabilir. Ovaryum kanserlerinde TAM populasyonları üzerinde yüksek seviyelerde B7-H4 bulunmuştur. B7-H4 + makrofajlar T hücre efektör fonksiyonlarını etkin şekilde inhibe edebilmektedir (73). Tringler ve arkadaşları, immünhistokimyasal olarak belirlenen %95 primer meme kanserinde ve %98 metastatik meme kanserinde (invaziv duktal ve invaziv lobüler) B7-H4 pozitifliği belirlemişlerdir (5). B7 ailesinin en son keşfedilen üyesi, B7-H6 yüzey molekülünün ekspresyonu normal insan dokularında bulunmamış ancak tümör dokularında gözlemlenmiştir. B7-H6, doğal öldürücü NK hücreleri üzerinde bulunan aktivatör NKp30 reseptörüne bağlanır. Bu sayede, NK hücre-aracılı antitümör immün yanıtların tetiklendiğine dair bulgular mevcuttur (74).

28 3. GEREÇ VE YÖNTEMLER Bu çalışma Temmuz 2012 Mayıs 2013 tarihleri arasında, Hacettepe Üniversitesi Kanser Enstitüsü, Temel Onkoloji Anabilim Dalı Araştırma Laboratuvarı nda gerçekleştirilmiştir. 3.1. Çalışmada Kullanılan Maddeler Çalışmada kullanılan kimyasal ve biyolojik malzeme tedarik edildiği firmalara göre aşağıda sıralanmıştır. Fosfat tamponlanmış tuz çözeltisi (PBS) (Tablet) (ICN Biomedicals INC., ABD); 2-mercaptoethanol, dietil pirokarbonat (DEPC), LPS, hidrokortizon, epidermal büyüme faktörü (EGF), insülin (Sigma Chemical Co.,ABD); Tris-Borik asit-edta (TBE) (Dr. Zeydanlı, Türkiye); Seakem Le Agaroz (Lonza, ABD); L-glutamin, Penisilin-Streptomisin, Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM), RPMI 1640 (Lonza, Belçika); Tripsin-EDTA (1x) (PAA Cell Culture Co., Avusturya); Fötal Buzağı Serumu (FBS) (Biological Industries, İsrail); 10x Taq Buffer (NH 4 ) 2 SO 4, MgCl 2, dntp mix, Taq DNA Polimeraz (rekombinant) (Thermo Scientific, Litvanya); Ficoll 1.077 (Biochrome AG, Almanya); McCoy s 5A (Invitrogen, Gibco, İngiltere); Karboksifloresan süksinimidil ester (CFSE) (Invitrogen Eugene, ABD); IFN-γ (R&D Systems, ABD); non-esansiyel amino asitler (HyClone,); Facs Flow cell wash (BD Biochemicals, ABD); Anti-insan CD3 monoklonal antikor (ebioscience, ABD) 3.2. Hazırlanan Tamponlar ve Çözeltiler Tris-Borik asit-edta (TBE) Çözeltisi: 10x TBE çözeltisi distile su ile 1x e seyreltildi. PBS Çözeltisi (1x): Bir tablet PBS 100 ml distile suya eklendi ve iyice karıştırıldı. Daha sonra otoklavlanarak sterilize edildi. İnsülin Çözeltisi: İnsülin son konsantrasyonu 10 mg/ml olacak şekilde, RPMI 1640 ile çözüldü. 1.5 ml lik tüplere 1 er ml alikotlanarak, -20 o C de saklandı.

29 Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) Çözeltisi: FBS içeren (%5 oranında) RPMI 1640 ile 20 μg/ml konsantrasyonunda EGF stok çözeltisi hazırlandı. Stok çözeltisinden 500 μl alınarak, son konsantrasyonu 1 μg/ml olacak şekilde, RPMI 1640 ile 10 ml ye tamamlandı. 1.5 ml lik tüplere 1 er ml konularak, -80 o C de saklandı. Tam RPMI Hücre Kültürü Ortamı: L-glutamin içeren RPMI 1640 üzerine son konsantrasyonu %10 olacak şekilde FBS, %1 olacak şekilde penisilin/streptomisin eklendi. Hazırlanan tam RPMI hücre kültürü ortamı, 4 o C de saklandı. Tam RPMI+İnsülin Hücre Kültürü Ortamı: L-glutamin içeren RPMI 1640 üzerine son konsantrasyonu %10 olacak şekilde FBS, %1 olacak şekilde penisilin/streptomisin ve 0.01 μg/ml olacak şekilde insülin eklendi. Hazırlanan tam RPMI+insülin hücre kültürü ortamı, 4 o C de saklandı. Tam DMEM Hücre Kültürü Ortamı: L-glutamin içermeyen DMEM üzerine son konsantrasyonu %10 olacak şekilde FBS, %1 olacak şekilde penisilin/streptomisin ve L-glutamin eklendi. Hazırlanan tam DMEM hücre kültürü ortamı 4 o C de saklandı. Tam DMEM-F12 Hücre Kültürü Ortamı: L-glutamin içermeyen DMEM üzerine son konsantrasyonu %10 olacak şekilde FBS, %1 olacak şekilde penisilin/streptomisin, 1x MEM non esansiyel amino asit çozeltisi, son konsantrasyonu 10 μg/ml olacak şekilde EGF, son konsantrasyonu 1 μg/ml olacak şelilde insülin, son konsantrasyonu 500 ng/ml olacak şekilde hidrokortizon eklendi. Hazırlanan tam DMEM-F12 hücre kültürü ortamı 4 o C de saklandı. Tam McCoy s 5A Hücre Kültürü Ortamı: L-glutamin içermeyen McCoy s 5A üzerine son konsantrasyonu %10 olacak şekilde FBS, %1 olacak şekilde penisilin/streptomisin ve L-glutamin eklendi. Hazırlanan tam McCoy s 5A hücre kültürü ortamı 4 o C de saklandı. Anti-insan CD3 monoklonal antikor (Klon: HIT3a) Çözeltisi: Stok konsantrasyonu 1 mg/ml olan anti-cd3 mab u son konsantrasyonu 2 μg/ml olacak şekilde serum içermeyen hücre kültürü ortamında seyreltildi. 1.5 ml lik tüplere alikotlanarak -20 o C de saklandı.

30 %1 Gluteraldehit-PBS Çözeltisi: PBS içerisinde hazır alınan %2 lik gluteraldehit çözeltisi PBS ile %1 olacak şekilde seyreltildi. Çözelti 0.2 μm birim filtreden süzülerek sterilize edildi. 3.3. Hücre Kültürü Deneyleri 3.3.1. Hücre Hatlarının Kültürü MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 ve BT-474 hücreleri tam DMEM kültür ortamında; HCC38, ZR-75-1 ve KG-1 hücreleri tam RPMI kültür ortamında; T47D tam RPMI+insülin kültür ortamında; MCF-12A hücreleri tam DMEM-F12 kültür ortamında; SK-BR-3 hücreleri tam McCoy s 5A kültür ortamında büyütüldü. Hücre hatları ve özellikleri Tablo 3.1 de gösterilmiştir. Hücre yoğunluğunun hücre kabının %80 ini doldurmasıyla (sub-confluence) hücreler pasajlanarak ilgili deneylerde kullanıldı. Haftada iki kez kültür ortamı yenilendi ve hücre kültürünün devamlılığı sağlandı. Hücreler 37 o C de nemli ve %5 CO 2 içeren inkübatörde muhafaza edildi. Tablo 3.1. Meme kanseri hücre hatları ve özellikleri. (Driessens ve ark.(2) den uyarlanmıştır.)

31 Met AC: Metastatik Adenokarsinom, IDC: İnvaziv duktal karsinom, AC: Adenokarsinom, DC: Duktal karsinom Meme kanseri hücre hatları transkripsyonel profillerine göre lüminel ve bazal-benzeri (A ve B) olmak üzere alt-tiplere ayrılır. Lüminal hücre hatları ER imzası taşır ve Lüminal A/B moleküler profilini taşıyan tümörlerle benzerlik gösterir. Bazal A hücre hatları ETS (E-Twenty six transkripsyon faktörü) sinyal yolağı ve BRCA1 mutasyonlarıyla ilişkilidir. Bu hücreler bazalbenzeri tümörlere benzer. Bazal B hücre hatları mezenkimal ve kök hücre karakterine sahiptir. Hücre hatları ile tümörler karşılaştırıldığında hücre hatlarının genetik olarak tümörlerden daha karmaşık yapıya sahip olduğu gösterilmiştir (2). Aderan Hücrelerin Pasajlanması: Primer kültür ortamı uzaklaştırılıp hücrelerin yüzeyini örtecek miktarda 1xPBS ile hücreler birkaç kez yıkandı. Daha sonra, T25 kültür kabı için 200 μl, T75 kültür kabı için 600 μl tripsin- EDTA çözeltisi (Tripsin:EDTA, 1:250) ile hücrelerin yüzeyi kaplandı ve inkübatöre kaldırıldı. İnkübatörde 3 dk boyunca 37 o C de bekledikten sonra inkübatörden alınan kültür kabına avuç içiyle vurularak hücrelerin iyice sökülmesi sağlandı. Inverted mikroskop altında incelenerek tüm hücrelerin büyüme yüzeyinden ayrıldığından emin olundu. Daha sonra, tam hücre kültürü ortamı eklenerek tripsin inaktive edildi. Hücreler sayılarak yeni kültürler oluşturuldu. Süspanse Hücrelerin Pasajlanması: Hücrelerin kültür ortamı içinde homojen dağılması sağlanacak şekilde pipetaj yapıldı. Kültür ortamının yarısı aspire edildi ve atıldı. Yeni hücre kültürü ortamı eklendi. Hücre Sayımı: Tripsinizasyon işleminden sonra tam kültür oramı içindeki hücreler pipetaj yapılarak süspanse hale getirildi. Süspansiyondan 10 μl alınarak 10 μl tripan mavisi ile karıştırıldı. Bu karışımı Thoma lamı üzerinde yaymak suretiyle hücre sayımı yapıldı. Her sayım için Thoma lamı üzerinden 4 alan seçildi ve aritmetik ortalaması alındı. Kullanılan Thoma lamının ölçüleri 0.1 mm x 0.1 mm olup lam ile lamel arasındaki uzaklık da 0.1 mm dir. Bu nedenle hücrelerin sayıldığı her alan 0.001 mm 3 e (0.0001 ml ye) karşılık geldiğinden sayılan hücrelerin aritmetik ortalaması 10 000 ile

32 çarpıldı. Elde edilen değer, hücre süspansiyonu tripan mavisi ile boyandığında 1:1 oranında seyreldiğinden, 2 ile çarpılarak ml başına düşen hücre sayısı hesaplandı. 3.3.2. CD4 + T Hücrelerin İzolasyonu Periferik Kandan Mononükleer Hücre İzolasyonu: Sağlıklı bireylerden toplanan kan 1:1 oranında RPMI 1640 ile seyreltildi. İçerisinde 3 ml fikol (1.077 g/ml) bulunan 15 ml lik falkon tüpüne sabit hızda ve dikkatlice seyreltilmiş kan eklendi, fikol ile karışmaması sağlandı. Daha sonra, 20 o C, 400G de 25 dakika santrifüj yapıldı. Santrifüjden sonra fikol ile plazma arasında kalan mononükleer hücreler pastör pipeti yardımıyla dikkatlice yeni bir tüp içerisine toplandı. PBS eklenerek 12 ml ye tamamlandı. Daha sonra, 1800 rpm de, 5 dakika santrifüj yapıldı. Süpernatan atıldı ve çöken hücrelerin 1 ml PBS içinde homojen olarak dağılması sağlandı. 20 μl FITC/PE-işaretli anti-cd4/cd8, ve 20μl PE-işaretli anti-cd13 monoklonal antikorları eklendi. Vortex ile kısaca karıştırıldı ve 15-20 dakika oda ısısında karanlıkta bekletildi. FACS (Fluorescence-activated cell sorting) ile CD4 + T hücrelerin ayırımı: İşaretlenen mononükleer hücreler tam RPMI 1640 hücre kültürü ortamı ile yaklaşık 3 ml hacme tamamlandı. Ayrılacak olan CD4 + T hücreler için 15 ml lik tüpe tam RPMI 1640 hücre kültürü ortamı eklendi. Accudrop işlemi yapıldıktan sonra CD13/CD8-negatif, CD4-pozitif hücreler seçilerek Fluorescence-activated cell sorting (FACS) (FACS Aria II, BD Biosciences, ABD) yöntemiyle CD4 + T hücrelerin ayırımı yapıldı (Şekil3.1). Ayrılan CD4 + T hücrelerin üzerine istenilen konsantrasyona göre tam RPMI 1640 hücre kültürü ortamı eklendi. İzole edilen T lenfositler kontrol edildiğinde %98 in üzerinde saflıkla başarılı kabul edildi.

33 Şekil 3.1. A. CD4 + T hücrelerin FACS yöntemiyle izole edilmesi. Granülaritelerine ve büyüklüklerine göre lenfoid hücreler seçildi, o hücreler arasında da CD13/CD8-negatif, CD4-pozitif T lenfositler toplandı B. Sort başarısı analizi. 3.3.3 Ko-kültür Deneyleri T Hücrelerin Ön-uyarımı ve Geri Saflaştırılması: KG-1 AML hücrelerinin sayımı yapıldı. FACS yöntemi ile ayrılmış olan CD4 + T hücreleri ile 0.5:1 (KG-1:CD4 + T) oranında karıştırıldı. Son konsantrasyonu 25 ng/ml olacak şekilde anti-cd3 mab (HIT3a) antikoru eklendi. 15 ml lik tüplere 2 şer ml olacak şekilde dağıtıldı. Tam RPMI 1640 içinde 37 o C de, 20 saat, %5 CO 2 içeren inkübatörde inkübasyona bırakıldı. İnkübasyondan sonra, bütün hücreler tek bir tüpe toplanarak 1800 rpm de 5 dakika santrifüj edildi. Süparnatanı boşaltıdı ve hücreler 1.5 ml PBS ile yeniden süspansiyon haline getirildi. PE-işaretli anti-cd34 antikoru 25 μl eklendi ve karanlıkta 30 dakika inkübe edildi. Daha sonra FACS yöntemi ile T lenfositlerin CD34 + olan miyeloid kökenli KG-1 hücrelerinden ayrımlandı. Geri ayırım başarısı analizi.

34 İzole edilen T lenfositler kontrol edildiğinde %98 in üzerinde saflıkla başarılı kabul edildi (Şekil 3.2). Şekil 3.2. A. CD4 + T hücrelerin geri saflaştırılması. Granülaritelerine ve büyüklüklerine göre lenfoid hücreler seçildi, daha sonra CD34- negatif olan T hücreler ayrımlandı. B. Geri ayırım başarısı analizi. İzole edilen T lenfositler kontrol edildiğinde %98 in üzerinde saflıkla başarılı kabul edildi. Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) ile CD4 + T hücrelerin işaretlenmesi: CD4 + T hücreler izole edildikten sonra, 1800 rpm de 5 dakika santrifüj edildi. Süpernatan atıldı ve konsantrasyonu 1x10 6 hücre/ml olacak şekilde RPMI 1640 eklenerek hücreler süspanse edildi. Kısa bir inkübasyonun (37 o C, 5 dk) ardından, son konsantrasyonu 5 μm olacak şekilde (CFSE) eklendi, çok nazik bir şekilde karıştırıldıktan sonra, 15 dakika 37 o C de su banyosunda inkübasyona bırakıldı. Yıkama için bol miktarda kültür ortamı eklendi. Beş dakika boyunca buz içerisine gömülerek inkübe edildi. Santrifüj (4 o C, 1800 rpm de 5 dakika) yapıldı. Yıkama işlemi bir kez

35 daha tekrarlandı. Süpernatan atıldı ve 2,5x10 5 hücre/ml olacak şekilde tam RPMI 1640 kültür ortamı eklendi. Meme Kanseri ve CD4 + T Lenfosit Ko-kültürleri: Ko-kültürler için 2 lüminal, 2 bazal-benzeri özellikteki meme kanseri hücre hatları (MCF-7, BT- 474, MDA-MB-468 ve MDA-MB-231) kullanıldı. Hücreler sayıldı ve 1x10 6 hücre/ml olacak şekilde tam RPMI 1640 içinde süspanse edildi. 96 kuyucuklu kültür kabına (Şekil 3.3) de gösterildiği gibi sırasıyla 0.25:1, 0.5:1, 1:1, 2:1, 4:1 oranlarında hücre ko-kültürleri için sırasıyla 6.25 μl, 12.5 μl, 25 μl, 50 μl, 100 μl hücre süspansiyonu konuldu, sonra üzerine sırasıyla 93.75 μl, 87.5 μl, 75 μl, 50 μl ve 0 μl tam RPMI hücre kültür ortamı eklendi. Her oran için 2 kuyuya ekim (duplike) yapıldı. Kontrol grubu olarak sadece T hücre ekimi yapıldı Meme Kanseri Hücrelerinin Fiksasyonu: Meme kanseri hücrelerinin Şekil 3.3 de gösterildiği şekilde kültür kabına ekimleri yapıldıktan 20 saat sonra hücrelerin kaba tutunup tutunmadıkları inverted mikroskop altında kontrol edildi. Kültür kabındaki besi ortamı steril gazlı beze boşaltıldı. Her kuyucuğa 50 μl %1 lik gluteraldehit çözeltisi eklendi ve 15 dakika bekletildi. Daha sonra, gluteraldehit çözeltisi steril gazlı beze boşaltıldı ve her kuyucuğa 200 μl PBS eklendi. Karıştırıcı üzerinde (Heidolph, Titramax 1000, Almanya) hızı 750 rpm de 1 dakika karıştırıldı ve PBS steril gazlı beze boşaltıldı. Bu işlem 2 defa tekrarlandı. En son yıkama tam RPMI 1640 kültür ortamı ile yapıldı böylece fiksatifin iyice temizlenmesi sağlandı. Her kuyucuğa 100 μl tam RPMI 1640 eklendi.

36 Şekil 3.3. Meme kanseri hücreleri ile CD4 + T hücrelerin 96 kuyucuklu kültür kabına ekim oranları. (1 = 2.5x10 4 hücre) T lenfositler, meme kanseri hücrelerinin ekiminden 20 saat sonra 2,5x10 4 hücre/100 μl olacak şekilde ko-kültür yapıldı. Meme kanseri hücreleri azalan ve artan oranlarda eklenirken T hücre oranları sabit tutuldu). Son konsantrasyonu 100ng/ml olacak şekilde T hücrelerin kültür ortamına anti- CD3 mab (HIT3a) eklendi. CD4 + T hücrelerin aktivasyonunu analiz etmek için 96 kuyucuklu kültür kabında meme kanseri hücreleri ile ön-uyarımı yapılmış ve ön-uyarımı yapılmamış CD4 + T hücrelerin meme kanseri hücrelerine oranı 1:2 olacak şekilde ko-kültürleri yapıldı. T hücreler üzerindeki aktivasyon belirteçleri 20 saat sonra analiz edildi (Bkz. Bölüm 3.4.). CD4 + T hücrelerin proliferasyonunu analiz etmek için, 96 kuyucuklu kültür kabında meme kanseri hücreleri ile 37 o C de 96 saat inkübasyona bırakıldı. Ön-uyarım yapılmış CFSE-işaretli CD4 + T (Bkz. Bölüm 3.3.3) hücreler ve ön-uyarım yapılmamış CFSE-işaretli CD4 + T hücreler ile iki farklı ko-kültür koşulu gerçekleştirildi. Daha sonra, akım sitometride T hücre proliferasyon analizleri yapıldı (Bkz. Bölüm 3.4).

37 Fikse meme kanseri hücreleri ile KG-1 hücreleri varlığında üçlü kokültürler gerçekleştirildi. CFSE-işaretli CD4 + T hücreler KG-1 hücreleri ile 1:0.125 oranında karıştırıldı. Son konsantrasyonu 100 ng/ml olacak şekilde anti-cd3 mab (HIT3a) eklendi. T hücre ve KG-1 karışımı fikse edilmiş meme kanseri hücreleri üzerine bir önceki bölümde anlatıldığı şekilde eklenerek kokültürleri yapıldı. Ayrıca, fikse edilmemiş meme kanseri hücreleri ile de üçlü ko-kültürler yapıldı. İnkübatöre kaldırılan ko-kültürler, 96 saat 37 o C de %5 CO2 li koşulda inkübe edildi. CD4 + T hücrelerin proliferasyon analizleri akım sitometri ile yapıldı. 3.4. Akım Sitometri Analizleri İmmünfenotip Analizi: MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 ve BT- 474, HCC38, ZR-75-1, T-47D, MCF-12A ve SK-BR-3 hücre hatlarında anti- B7-H1, anti-b7-h2 ve anti-b7-dc yüzey belirteçleri; FITC-işaretli B7-H1, PEişaretli B7-H2, PE-işaretli B7-DC ve izotipik kontrol antikorları kullanılarak analiz edildi. Deneylerde kullanılan antikorlar, Tablo 3.2 de belirtildiği şekildedir. Akım sitometri analizinden 2 gün önce meme kanseri hücreleri tripsin-edta çözeltisiyle hücre kaplarından söküldü (Bkz. Bölüm 3.3.1) ve 4x10 5 hücre/7 ml olacak şekilde 3 ayrı T25 hücre kabına yeniden ekildi. Ertesi gün kaplardan bir tanesi kontrol grubu olarak ayrıldı. İkinci kaba konsantrasyonu 1 ug/ml olacak şekilde LPS ekledi, üçüncü kaba ise son konsantrasyonu 200 U/ml olacak şekilde rekombinant IFN-γ eklendi. İnkübasyonun ardından (20 saat, 37 o C) akım sitometri analizi için hücreler, hücre kazıyıcı (cell scraper) kullanılarak kültür yüzeylerinden toplandı. Böylelikle, tripsin enziminin yüzey moleküllerine zarar vermemesi sağlandı. Sökülen hücreler 40 μm açıklığa sahip süzgeçten geçirilerek tek hücre süspansiyonları elde edildi. Hücreler santrifüj (5 dk, 1800 rpm, 4 o C) edildi, sonra 400 μl 1xPBS içerisinde süspanse edildi. Akım sitometri tüplerine 100 er μl dağıtılarak anti-b7-h1, anti-b7-h2, anti-b7-dc ve izotipik kontrol antikorları ile işaretlendi. 30 dakika boyunca 4 o C de inkübe edildi.

38 Tablo 3.2. Akım sitometride kullanılan antikorlar Meme kanseri hücreleriyle ko-kültürü yapılan CD4 + T hücreleri 20 saat inkübasyondan sonra ko-kültür kabından toplandı. 400 μl 1xPBS içinde süspanse edildi ve 4 adet flow tüpüne 100 μl şeklinde dağıtıldı. Hücreler izotipik kontrol, anti-cd154, anti-cd25 ve anti-cd69 antikorları ile işaretlendi. 30 dakika 4 o C de inkübe edildi. İnkübasyon süresinin sonunda bağlanmayan antikorlar cell wash (BD Biosciences, ABD) çözeltisi ile yıkandı. Santrifüj sonrasında tüplere 200 μl cell wash eklendi ve FACS Aria II akım sitometri cihazında değerlendirildi. Akım Sitometrik Proliferasyon Analizi: Meme kanseri hücreleriyle ko-kültürü yapılan CFSE ile işaretlenmiş CD4 + T hücreleri 96 saat inkübasyondan sonra ko-kültür kabından toplanarak, CFSE boyasının floresan yoğunluğundaki değişiklik FACS Aria II akım sitometri cihazında değerlendirildi.

39 3.5. Moleküler Teknikler 3.5.1. RNA İzolasyonu RNA izolasyonu QIAmp RNA Blood Mini Kit (QIAGEN, Maryland, MD, ABD) ile yapıldı. Kullanılacak malzeme dietilpirokarbonat (DEPC) ile önceden muamele edilerek RNaz aktivitesi engellendi. Hücreler kültür kabında 1xPBS ile yıkandı. 400 μl merkaptoetanol eklenmiş RLT tamponu konuldu. Vortex ile hücrelerin tamamen parçalanması sağlandı. 400 μl %70 lik etanol eklendi ve bütün kap içine yayıldı, pipetlendi ve beyaz kolon içine aktarıldı. 4 o C, 10000 rpm de 20 saniye santrifüj yapıldı. Kolon üzerine 350 μl Tampon RW1 eklendi, 4 o C, 10000 rpm de 20 saniye santrifüj yapıldı. Bu sırada, genomik DNA nın RNA içerisindeki varlığını temizlemek amacıyla 70 μl Tampon RDD, 10 μl DNazI ile karıştırıldı. Toplam 80 μl karışım kolon membranı üzerine dikkatlice bırakıldı ve oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edildi. 350 μl Tampon RW1 eklendi ve 4 o C, 10000 rpm de 20 saniye santrifüj yapıldı. Kolonun bulunduğu toplama tüpü değiştirildi. 500 μl Tampon RPE eklendi. 4 o C, 10000 rpm de 20 saniye santrifüj yapıldı. Toplama tüpleri boşaltıldı. Tekrar 500 μl Tampon RPE eklendi. 4 o C, 13000 rpm de 4 dakika santrifüj yapıldı. Kolon yeni biriktirme tüpüne takıldı ve membranın kurutulması için 4 o C, 13000 rpm de 1 dakika santrifüj yapıldı. Kolon, 1.5 ml lik yeni tüplere takıldı, 30 μl RNaz içermeyen distile su membran üzerine dikkatlice eklendi. 4 o C, 10000 rpm de 1 dakika santrifüj yapıldı ve kolon atıldı. Total RNA -80 o C de kullanılıncaya kadar saklandı. 3.5.2. İzole Edilen RNA nın Saflık ve Kalite Analizi İzole edilen RNA lardaki genomik DNA ların temizlenmesi amacıyla, total RNA doğrudan kalıp olarak kullanıldı ve β-aktin geni PCR ile çoğaltılmaya çalışıldı PCR sonucunda bant gözlenen (DNA varlığı saptanan) örnekler; RNaz içermeyen DNaz enzimiyle muamele edildi (DNA-free TM Kit, Ambion, ABD) ve genomik DNA örneklerden uzaklaştırıldı. Kısaca, 20 μl RNA üzerine 2 μl 10x DNaseI tamponu ve 2.2 μl rekombinant DNaseI (2 μ/μl) eklenerek 37 o C de 45 dakika inkübe edildi. Daha sonra, 0.2 hacim DNaz

40 inaktivasyon reaktifi eklenip 2 dakika oda sıcaklığında tutuldu ve DNaz inaktivasyonu sağlandı. 1.5 dakika, 4 o C, 13000 rpm de santrifüj sonrasında RNA yı barındırmakta olan süpernatan fraksyonu temiz bir tüpe aktarıldı ve - 80 o C de saklandı. RNA Miktarının Spektrofotometrik Ölçümü: İzole edilen RNA nın konsantrasyonu ve kalitesi spektrofotometrik (Nanodrop, ABD) olarak 260 nm ve 280 nm dalga boylarının kullanıldığı, optik yoğunluk (OD) ölçümleri sonucunda belirlendi. RNA kalitesi, A 260 /A 280 ve A 260 /A 230 oranlarına göre değerlendirildi. Her iki absorbans oranı için normal sınırlar 1,8 2,0 olarak kabul edildi. 3.5.3. cdna Sentezi Total RNA dan Tablo 3.3. de son konsantrasyonları verilmiş bileşenleri içeren ve ters (reverse) transkriptaz enzimince katalizlenen tepkime sonucunda mrna kaynaklı tek iplikçikli, komplementer DNA (cdna) molekülü sentezlendi. Standart cdna sentez tepkimesinin yanı sıra, örnek RNA içermeyen, yerine su eklenmiş, negatif kontrol tepkimesi de hazırlandı. cdna sentezi, Fermentas RevertAid First Strand cdna Synthesis Kit (MBI Fermentas, Litvanya) kullanılarak, üretici firmanın kullanım talimatlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. cdna -20 o C de saklanmıştır.

41 Tablo 3.3. cdna sentez reaksiyonu bileşenleri ve koşullar 3.5.4. Polimeraz Zincir Reaksyonu (Polymerase Chain Reaction, PCR) Genel olarak kullanılan PCR koşulları Tablo 3.4. de verilmiştir. 10mM stok dntp mix çözeltisi, 2 mm konsantrasyonuna seyreltilerek kullanıldı. Özgül genlerin amplifikasyonunu dağlayacak tepkimelerin yanında, kalıp DNA içermeyen yerine su eklenmiş negatif kontrol tepkimesi de hazırlandı. Öncelikle su, primerler, tampon, dntp mix, magnezyum klorür (MgCl 2 ) çozeltisi ve Taq DNA polimeraz enzimi 1.5 ml lik mikrofüj tüplerine koyuldu, iyice pioetlenerek karışması sağlandı. Tepkimenin gerçekleştirileceği 200 μl lik mikrofüj tüplerine dağıtılan karışıma kalıp DNA eklendi.

42 Tablo 3.4. Standart PCR bileşen miktarları ve son konsantrasyonları. Tüpler, kapak ısısı önceden 94 o C ye çıkarılmış, thermal cycler üzerine yerleştirildi ve toplam 35 döngülük tepkime (Tablo 3.5.) gerçekleştirildi. Reaksyonun tamamlanmasıyla ürünler 4 o C ye alındı. B7-1 molekülünün optimizasyonu için primer hot-start uygulandı. Hazırlanan PCR tüpleri önceden 94 o C de, 1 dakika boyunca inkübe edildikten sonra Taq DNA polimeraz enzimi eklendi ve standart PCR koşulları ile devam edildi. Tablo 3.5. Standart PCR thermal cycler koşulları.

43 İlgili DNA dizisini çoğaltmak amacıyla tasarlanan primer dizileri, ürün boyutları ve gen bankası (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) erişim numaraları Tablo 3.6 da verilmiştir. Tablo 3.6. Gen ekspresyon analizlerinde kullanılan primer dizileri. (bp: baz çifti) 3.5.6. Agaroz Jel Elektroforezi Agaroz tartılarak bir erlen içerisinde üzerine 1xTBE tampon çözeltisi %2 lik (w/v) agaroz jel hazırlandı. Mikrodalga fırında 200 ml TBE içerisinde 4g agaroz eritildi. Yaklaşık 55 o C ye soğuması beklendikten sonra içerisine son konsantrasyonu 60 μl/ml olacak şekilde etidyum bromür (10 mg/ml) eklenerek karıştırıldı ve jel kalıbına döküldü. Donmasının ardından tarak çıkartılıp elektroforez tankına alınan jel, üzerini örtecek hacimde 1xTBE tamponu eklendi. 20 μl hacimdeki PCR ürünleri 6x DNA yükleme tamponu (4μl) ile karıştırılarak (son konsantrasyon 1x) kuyucuklara yüklendi. DNA boyutunu belirleyen marker den (DNA ladder) kuyucukların başına 2μl koyuldu. Şekil 3.4 de kullanılan DNA marker ına ait bantların baz çifti (bp) olarak büyüklükleri gösterimiştir. Ürünler sabit 120 V elektrik akımı altında yürütüldü.

44 Şekil 3.4. 50 bp DNA ladder (MBI Fermentas, Litvanya) Elektroforez işlemi sonucunda DNA ürünleri UV ışığı altında Kodak Gel Logic 1500 görüntüleme sistemi (Carestream Health, Rochester, NY, ABD) ile görüntülendi. 3.6. İstatistiksel Analiz Verilerin eldesi için en az 3 bağımsız deney yapılmıştır. Elde edilen verilerin istatistiksel analizinde, Student s t-testi kullanılmıştır. Analiz sonucunda P 0.05 olarak hesaplanan sonuçlar, istatistiksel anlamlı kabul edilmiştir.

45 4.BULGULAR 4.1. Meme Kanseri Hücre Hatlarında B7 Ligand Gen Ekspresyonunun Araştırılması B7-1, B7-2, B7-H1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6 ve B7-DC moleküllerinin gen ekspresyon analizinde, optimizasyon için genellikle LPS ile uyarılmış periferik kandan ve akut miyeliod lösemi (AML) hücre hatları olan K562, HL-60 dan elde edilmiş cdna örnekleri pozitif kontrol olarak kullanıldı. Pozitif kontrol örneklerine ait, optimize edilmiş RT-PCR sonuçları Şekil 4.1 de görülebilir. Şekil 4.1. Optimize edilen RT-PCR koşulları ile elde edilmiş ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonucu. İlk ve son sırada 50 bp DNA ladder yüklenmiştir. (bp; baz çifti) LPS ve IFN-γ ile 20 saat boyunca uyarılan meme kanseri hücrelerinin (MCF-12A, MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-468, MDA-MB-231, BT-474, T-47D, ZR-75-1, HCC38) yanı sıra, kontrol hücrelerin de cdna örneklerinde B7

46 ligandlarına ait gen ekspresyonu araştırıldı. Dahili (internal) kontrol olarak β- aktin (house keeping) geni kullanıldı (Şekil4.2). β-aktin geninin, house keeping gen olarak bütün hücrelerde ekspresyonunun belirgin ve eşit seviyede olduğu gözlemlendi. Şekil 4.2. Meme kanseri hücre hatlarında B7 ligandlarının gen ekspresyon RT-PCR analizi sonuçları. Her B7 ligand geni için üstte kontrol, altta LPS ve IFN-γ ile uyarılmış örnekler ile elde edilen sonuçlar görülmektedir. C(-); negatif kontrol, C(+); pozitif kontrolü göstermektedir.* ile işaretlenen hücre hatları bazal-benzeri, diğerleri lüminal alt-tiptedir.

47 B7-1 ve B7-2 moleküllerinin meme kanseri hücre hatlarında ekspresyonu belirlenmedi. Ancak, pozitif kontrol örnekleri ile elde edilen sonuçlar ile PCR deneylerinin çalıştığı anlaşıldı. LPS ve IFN-γ uyarımlarıyla beraber bu iki molekülün ekspresyonlarında bir faklılık gözlenmedi. Sadece HCC38 hücrelerinde IFN-γ, B7-1 ekspresyonu biraz belirginleştirdi. B7-H1 molekülünün ekspresyonunun bazal-benzeri özelliklere sahip MCF-12A, MDA-MB-468, MDA-MB-231 ve HCC38 hücrelerinde daha belirgin olduğu dikkat çekti. Ayrıca lüminal özellikteki SK-BR-3 hücrelerinde de ekspresyon belirlendi. LPS ile uyarım bir fark oluşturmadı ancak IFN-γ ile uyarım BT-474 hücreleri dışında B7-H1 ekspresyonunu artış yönünde değiştirdiği gözlendi. B7-H2 molekülünün ekspresyonu MCF-12A dışındaki hücrelerde gözlenirken özellikle lüminal alt-tip özelliğine sahip olan MCF-7, SK-BR-3, BT-474, T-47D ve ZR-75-1 hücrelerinde daha belirgin olduğu saptandı. LPS ve IFN-γ ile uyarım B7-H2 molekülünün mrna düzeyindeki ekspresyonuna bir etki etmediği belirlendi. B7-H3 molekülünün MDA-MB-468 dışındaki bütün hücrelerde eksprese olduğu gözlendi. LPS ile uyarımda MCF-7, BT-474 ve ZR-75-1 hücrelerinde ekspresyonun azalma yönünde değiştiği gözlemlendi. IFN-γ ile uyarımda ise MCF-12A dışında bütün hücrelerde ekpresyonun artış yönünde değiştiği belirlendi. B7-H4 molekülünün ekspresyonu SK-BR-3, MDA-MB-468, BT-474, T- 47D, ZR-75-1 ve HCC38 hücrelerinde tespit edildi ancak LPS ile uyarımda BT-474 ve HCC38 hücrelerinde ekspresyonun azalma yönünde değiştiği belirlendi. IFN-γ ile uyarımda ise SK-BR-3 ve HCC38 hücrelerinde ekpresyonun azalma yönünde değiştiği gözlendi. B7-DC molekülünün en çok bazal-benzeri özellikteki MCF-12A, MDA- MB-468, MDA-MB-231 ve HCC38 hücrelerinde eksprese olduğu gözlendi, lüminal özellikteki SK-BR-3 hücrelerinde de hafif ekspresyon vardı. LPS ile uyarımın bu molekülün ekspresyonunda değişikliğe yol açmadığı tespit edildi. Ancak IFN-γ ile uyarımda aynı hücrelerde ekpresyonun artış yönünde değiştiği belirlendi.

48 B7-H6 molekülünün ekspresyonu bütün hücrelerde gözlendi. LPS ile uyarımda ise MCF-12A, ZR-75-1 ve HCC38 hücrelerindeki B7-H6 ekspresyonu azalma yönünde değişiklik gösterdi. IFN-γ ile uyarımda ise T-47D hücrelerinde ekspresyonun azalma yönünde değiştiği gözlendi. Bu bilgiler ışığında, özellikle lüminal hücrelerde ekspresyonunu gözlemlediğimiz B7-H2 molekülünün ve bazal-benzeri hücrelerde ekspresyonları belirgin olan B7-H1 ve B7-DC moleküllerinin yüzey protein ekspresyonu düzeyinde araştırılmasına karar verildi. 4.2. Meme Kanseri Hücre Hatlarında B7-H2, B7-H1 ve B7-DC Moleküllerinin Yüzey Proteini Düzeyinde Araştırılması LPS veya IFN-γ ile uyarılan ve kontrol grubu meme kanseri hücre hatlarında, yüzey molekülleri B7-H2, B7-H1 ve B7-DC nin hücre yüzeyindeki varlığı 20 saatlik inkübasyonun ardından akım sitometri ile analiz edildi. Lüminal alt-tipteki hücre hatlarında B7-H2 ekspresyonu daha belirgin olarak bulundu. B7-H2 molekülünün ekspresyonu lüminal meme kanseri hücre hatları olan MCF-7 (kontrol %46.6±6, LPS %57.3±8.7, IFN-γ %62.5±5.8), SK-BR-3 (kontrol %44.4±7.9, LPS %20.1±3.6, IFN-γ %28.4±3.2), BT-474 (kontrol %39.05±6.1, LPS %38.63±12.5, IFN-γ %38.35±8.7), T-47D (kontrol %13.77±4.3, LPS %6.69±3, IFN-γ %9.8±6.7) ve ZR-75-1 (kontrol %38.83±6.4, LPS %29.66±7.7, IFN-γ %46.3±11.4) de daha yüksek olduğu gözlendi. Bazal-benzeri özellik gösteren hücre hatları MDA-MB-468, MDA-MB-231, HCC38 ve MCF-12A da ise ekspresyon yüzdeleri (%2.1-5.1 arasında) çok düşük olarak belirlendi (Şekil 4.3 ve 4.4). IFN-γ ile uyarımın kontrol grubun yüzdelerine göre belirgin bir fark oluşturmadığı saptandı. Lüminal alt-tipteki hücreler olan SK-BR-3, T-47D ve ZR-75-1 hücrelerinde genel olarak LPS ile uyarıldıklarında azalma yönünde değişim gözlendi fakat, sadece SK-BR-3 hücrelerindeki ekspresyon azalması anlamlı düzeydedir. MCF-7 ve BT-474 hücrelerindeki B7-H2 ekspresyonunda LPS ile uyarımla bir fark oluşmamıştır.

49 Şekil 4.3. B7-H2 molekülünün temsili akım sitometri histogramları. Şeffaf histogramlar izotipik kontrolü, gri histogramlar B7-H2 boyamasını göstermektedir.

50 Şekil 4.4. B7-H2 pozitifliği gösteren meme kanseri hücrelerinin yüzdeleri. Beyaz barlar kontrol grubunu, gri barlar LPS ile uyarılmış grubu ve siyah barlar ise IFN-γ ile uyarılmış grupları temsil etmektedir (**P<0.01). Bazal-benzeri alt-tipteki hücre hatlarında B7-H1 ekspresyonu daha belirgin olarak bulundu. B7-H1 molekülünün ekspresyonu lüminal alt-tipteki hücreler; MCF-7, SK-BR-3, BT-474, T-47D ve ZR-75-1 de düşük düzeyde (%4.2-10.4 aralığında), bazal-benzeri alt-tipteki hücrelerde ise MDA-MB-468 (kontrol %15.1±1.8, LPS %16.3±3.5, IFN-γ %28.8±2.7), MDA-MB-231 (kontrol %79.6±4.6, LPS %75.6±6.2, IFN-γ %91.7±4.3), HCC38 (kontrol %33.2±2, LPS %36.7±6.9, IFN-γ %55.06±4.6) ve MCF-12A (kontrol %69.4±10.2, LPS %70.2±8.8, IFN-γ %97.4±1.5) daha yüksek düzeyde olduğu gözlendi. Bazal-benzeri hücrelerde en düşük B7-H1 ekspresyonu MDA-MB-468 hücrelerinde saptandı. LPS ile uyarımın ekpresyonda bir fark oluşturmadığı ancak IFN-γ ile uyarımın B7-H1 ekspresyonunda özellikle bazal-benzeri hücreler (MDA-MB-468, MDA-MB-231, HCC38 ve MCF-12A) üzerinde artışa yol açtığı tespit edildi (Şekil 4.5 ve 4.6).

51 Şekil 4.5. B7-H1 molekülünün temsili akım sitometri histogramları. Şeffaf histogramlar izotipik kontrolü, gri histogramlar B7-H1 boyamasını göstermektedir.

52 Şekil 4.6. B7-H1 pozitifliği gösteren hücrelerin yüzdeleri. Beyaz barlar kontrol grubunu, gri barlar LPS ile uyarılmış grubu ve siyah barlar IFN-γ ile uyarılmış grupları temsil etmektedir (*P<0.05). B7-DC molekülünün ekspresyonu lüminal alt-tipteki; MCF-7, BT-474, T-47D ve ZR-75-1 hücrelerinde düşük (%1.5-6.9 aralığında) düzeyde bulundu. Fakat SK-BR-3 hücrelerinde B7-DC ekspresyonu daha yüksekti (kontrol %8.5±9.6, LPS %10.0±7.3, IFN-γ %7.5±4.6). Bazal-benzeri alt-tip özelliği gösteren MDA-MB-468 (kontrol %7.6±0.6, LPS %7.7±3.4, IFN-γ %5.5±1.8), MDA-MB-231 (kontrol %11.2±1, LPS %9.4±2.5, IFN-γ %54.8±10.6), HCC38 (kontrol %37.6±1.8, LPS %36±10.1, IFN-γ %53.9±2.4) ve MCF-12A (kontrol %55.6±10.3, LPS %69.5±3, IFN-γ %96.2±2.2) hücrelerinde ise daha yüksek düzeyde olduğu gözlendi. LPS ile uyarımın ekpresyonda bir fark oluşturmadığı ancak IFN-γ ile uyarımın B7-DC ekspresyonunu bazal-benzeri hücre hatlarında anlamlı derecede artışa yol açtığı tespit edildi (Şekil 4.7 ve 4.8). B7-DC ekspresyonu, bazal-benzeri hücreler arasında MDA-MB-468 ve MDA-MB-231 hücrelerinde düşük düzeydeydi ancak IFN-γ ile uyarım sonucunda MDA-MB-231 hücrelerinde belirgin bir artış tespit edildi (Şekil 4.7).

53 Şekil 4.7. B7-DC molekülünün temsili akım sitometri histogramları. Şeffaf histogramlar izotipik kontrolü, gri histogramlar B7-DC boyamasını göstermektedir.

54 Şekil 4.8. B7-DC pozitifliği gösteren meme kanseri hücrelerinin yüzdeleri. Beyaz barlar kontrol grubunu, gri barlar LPS ile uyarılmış grubu ve siyah barlar IFN-γ ile uyarılmış grupları temsil etmektedir (*P<0.05). Sonuç olarak B7-H2 molekülünün ekspresyonunun lüminal hücrelerde, B7-H1 ve B7-DC moleküllerinin ise bazal-benzeri hücre tiplerinde yaygın olduğu belirlendi. LPS ile uyarımın bu moleküllerin ekspresyonunda belirgin bir etkisi yokken IFN-γ ile uyarımın B7-H1 ve B7-DC moleküllerinin ekspresyonlarını bazal-benzeri hücre tiplerinde artırdığı tespit edildi. 4.3. Lüminal ve Bazal-benzeri Meme Kanseri Hücre Hatlarının CD4 + T Hücre Proliferasyonu Üzerine Etkisi 4.3.1 Miyeloid Kökenli KG-1 Hücreleri ile T Hücre Proliferasyonunun Uyarımı Meme kanseri hücrelerinin T hücre proliferasyonu üzerine etkisini belirleyebilmek için, daha önceden uyarıcı etkisi olduğu bilinen miyeloid

55 kökenli KG-1 hücre hattı ile CD4 + T hücrelerin anti-cd3 mab varlığında kokültür yapıldı. Ön-uyarım için KG-1 hücreleri ile CD4 + T hücreleri 0.5:1 oranında karıştırıldı. Son konsantrasyonu 25 ng/ml olacak şekilde anti-cd3 mab (HIT3a) antikoru eklendi. 20 saatlik inkübasyondan sonra T hücreler, KG-1 hücrelerinden geri saflaştılrıldı ve CFSE ile işaretlendi. 96 saat boyunca 100 ng/ml anti-cd3 mab varlığında inkübe edilen ön-uyarılmış T hücrelerin kontrol hücrelere göre proliferasyonun daha fazla olduğu gözlendi. Önuyarımı yapılmamış T hücrelerin proliferasyon yüzdesi %2.4 iken ön-uyarım yapıldığı zaman proliferasyon yüzdesi iki katına çıkarak %4.87 olarak belirlendi (Şekil 4.9). Yapılan ko-kültürlerde KG-1 hücreleri ile beraber CD4 + T hücrelerin 96 saat boyunca ko-kültürü devam ettirildiğinde ise, T hücre proliferasyonunun çok daha yüksek oranda arttığı tespit edildi. Bu deneyler için iki farklı kokültür oranı kullanıldı. İlk koşulda KG-1: CD4 + T hücre oranı 0.125:1 olarak uygulandı. İkinci koşulda ise KG-1:CD4 + T hücre oranı 0.5:1 olarak uygulandı. Birinci koşulda 0.125:1 oranında yapılan ko-kültür sonucunda T hücre proliferasyonu %17.22; 0.5:1 oranında yapılan ko-kültür sonucunda ise T hücre proliferasyonu %76.3 e yükseldiği tespit edildi (Şekil 4.9).

56 A B Şekil 4.9. A. CD4 + T hücrelerin miyeloid kökenli KG-1 hücreleri ile uyarımı gerçekleştirilen CFSE analizine ait temsili akım sitometri grafikleri. B. CD4 + T hücrelerin miyeloid kökenli KG-1 hücreleri ile yapılan ko-kültür ve ön-uyarımda T hücrelerin proliferasyon yüzde değerleri. 4.3.2. Meme Kanseri Hücreleriyle Ko-kültürü Yapılan Naif veya Ön-Uyarımı Yapılmış T Hücrelerin Proliferasyonu Ko-kültürler için 2 lüminal (MCF-7, BT-474) ve 2 bazal-benzeri (MDA- MB-468, MDA-MB-231) özellikteki meme kanseri hücre hattı artan oranlarda (0.25:1, 0.5:1, 1:1, 2:1) ekildi ve anti-cd3 mab varlığında T hücrelerle kokültür yapıldı. Naif T hücrelerle yapılan ko-kültürlerde T hücre proliferasyonunda belirgin bir değişim olmadığı tespit edildi (Şekil 4.10 ve

57 4.12). Meme kanseri hücrelelerinin oranları artmasına rağmen T hücre proliferasyon yüzdeleri MCF-7 ile ko-kültürde %1-1.8 arasında, BT-474 ile ko-kültürde %1.6-2.5 arasında, MDA-MB-468 ile ko-kültürde %1.7-4.4 arasında, MDA-MB-231 ile ko-kültürde %2.9-5.2 arasında olduğu belirlendi (Şekil 4.12). Şekil 4.10. Naif CD4 + T hücreler ile iki lüminal (MCF-7, BT-474) ve iki bazalbenzeri (MDA-MB-468, MDA-MB-231) özellikteki meme kanseri hücrelerinin ko-kültüründen 96 saat sonra, T hücre proliferasyonunun temsili akım sitometri histogramları. Ön-uyarımı yapılmış CD4 + T hücrelerle meme kanseri hücreleriyle yapılan ko-kültürlerde ise lüminal benzeri hücrelerin T hücre proliferasyonu üzerinde bir etkisi olmadığı tespit edildi. T hücre proliferasyon yüzdeleri MCF- 7 ile ko-kültürde %4.03-5.2 arasında, BT-474 ile ko-kültürde %3.2-4.6arasında olduğu belirlendi.

58 Bazal-benzeri hücrelerle yapılan ko-kültürlerde ise T hücre proliferasyonunun belirgin düzeyde arttığı gözlendi. MDA-MB-468 ile kokültürde (0.25:1 oranında, %5.8; 0.5:1 oranında, %7.7; 1:1 oranında, %8.3 ve 2:1 oranında, %10.7), MDA-MB-231 ile ko-kültürde (0.25:1 oranında, %10.4; 0.5:1 oranında, %12.2; 1:1 oranında, %16.8 ve 2:1 oranında, %22.2) (Şekil 4.11 ve 4.12). Meme kanseri hücrelerinin oranı arttıkça T hücre proliferasyon yüzdesinin de arttığı gözlemlendi. En yüksek proliferasyonun 2:1 oranındaki ko-kültürlerde olduğu saptandı (Şekil 4.12). Şekil 4.11. Ön-uyarılmış CD4 + T hücreler ile iki lüminal (MCF-7, BT-474) ve iki bazal-benzeri (MDA-MB-468, MDA-MB-231) özellikteki meme kanseri hücrelerinin ko-kültüründen 96 saat sonra, T hücre proliferasyonunun temsili akım sitometri histogramları.

59 Şekil 4.12. Lüminal ve bazal-benzeri hücreler ile ön-uyarımı yapılmış veya yapılmamış T hücreler anti-cd3 mab varlığında 96 saat boyunca yapılan ko-kültürlerde, T hücre proliferasyonu yüzdeleri. Şekildeki kırmızı kesik çizgiler ön-uyarımı yapılmış kontrol T hücrelerin düzeyini, yeşil kesik çizgiler ise uyarılmamış naif T hücrelerin proliferasyon yüzdelerini göstermektedir. Solda lüminal (MCF-7 ve BT-474) hücrelerle, sağda bazal-benzeri (MDA-MB-468 ve MDA-MB-231) hücrelerle yapılan ko-kültürlerin proliferasyon yüzdeleri gösterilmektedir. Bazal-benzeri alt-tipteki hücreler T hücre proliferasyonunda daha uyarıcıdır ve T hücre proliferasyonu için ön-uyarım gereklidir.

60 4.3.3. CD4 + T Hücrelerin, KG-1 ve Fikse veya Kontrol Meme Kanseri Hücreleri Varlığında Proliferasyonu Bazal-benzeri hücrelerle yapılan ko-külterlerdeki T hücrelerin proliferasyon artışının salgılan faktörlerden mi yoksa yüzey moleküllerinden mi kaynaklı olduğunu belirlemek amacıyla, meme kanseri hücreleri ko-kültür kabına ekildikten 20 saat sonra fikse edildi. Bu hücrelerin üzerine 0.125:1 oranında KG-1 ve T hücreler eklendi. Fikse edilen meme kanseri hücreleriyle yapılan ko-kültürler sonucunda proliferasyonda inhibisyon tespit edildi (Şekil 4.13 ve 4.15). Yalnızca KG-1 ve T hücrelerin ko-kültüründe proliferasyon yüzdesi %2.4 idi (Bkz. Şekil 4.8) Buna göre lüminal hücrelerle (MCF-7 ile kokültürde 0.25:1 oranında, %15.85; 0.5:1 oranında, %6; 1:1 oranında, %4.75 ve 2:1 oranında, %3.5, BT-474 ile ko-kültürde 0.25:1 oranında, %18.85; 0.5:1 oranında, %13.2; 1:1 oranında, %8.1 ve 2:1 oranında, %4.1) ve bazalbenzeri hücrelerle yapılan ko-kültürlerde (MDA-MB-468 ile ko-kültürde, 0.25:1 oranında, %13; 0.5:1 oranında, %8.65; 1:1 oranında, %5.35 ve 2:1 oranında, %3.9, MDA-MB-231 ile ko-kültürde, 0.25:1 oranında, %14.8; 0.5:1 oranında, %13.65; 1:1 oranında, %9.4 ve 2:1 oranında, %5.7) artan meme kanseri hücre oranına bağımlı olarak T hücre proliferasyonunda azalma saptandı (Şekil 4.14).

61 Şekil 4.13. Fikse edilmiş meme kanseri hücreleriyle beraber T ve KG-1 hücrelerinin ko-kültürlerinde T hücre proliferasyonunun temsili akım sitometri grafikleri. Fikse edilmemiş (kontrol) meme kanseri hücreleriyle yapılan kokültürlerde ise özellikle bazal-benzeri hücrelerde belirgin bir proliferasyon artışı gözlemlendi (Şekil 4.14 ve 4.15). Lüminal hücrelerle yapılan üçlü kokültür yüzdeleri MCF-7 ile ko-kültürde 0.25:1 oranında, %13.9; 0.5:1 oranında, %12.7; 1:1 oranında, %10.8 ve 2:1 oranında, %8.2, BT-474 ile ko-kültürde 0.25:1 oranında, %21.4; 0.5:1 oranında, %21.8; 1:1 oranında; %15.06 ve 2:1 oranında, %6.9 olarak saptandı. Bu değerler tek başına KG-1 ve T hücrelerin proliferasyon yüzdesine göre değerlendirildiğinde proliferasyon artışının olmadığı hatta meme kanseri hücrelerinin oran artışına bağlı olarak proliferasyonda azalma olduğu belirlendi (Şekil 4.14).Bazalbenzeri hücrelerle yapılan üçlü ko-kültür yüzdeleri MDA-MB-468 ile kokültürde, 0.25:1 oranında, %15.9; 0.5:1 oranında, %15.9; 1:1 oranında, %27.4 ve 2:1 oranında, %30.4, MDA-MB-231 ile ko-kültürde 0.25:1 oranında, %32.5; 0.5:1 oranında, %45.4, 1:1 oranında, %51.2 ve 2:1 oranında, %33.4 olarak saptandı. Bu değerler tek başına KG-1 ve T

62 hücrelerin proliferasyon yüzdesine göre değerlendirildiğinde T hücre proliferasyonunda belirgin bir artış olduğu belirlendi (Şekil 4.15). Fikse edilmeyen bazal-benzeri MDA-MB-231 kanser hücreleriyle T hücrelerinin kokültüründe 1:1 oranındayken %51.2 olan proliferasyon yüzdesi, 2:1 oranına çıkarıldığında %33.4 olarak saptandı. Şekil 4.14. Fikse edilmemiş (kontrol) meme kanseri hücreleriyle beraber T ve KG-1 hücrelerinin ko-kültürlerinde T hücre proliferasyonunun temsili akım sitometri grafikleri.

63 Şekil 4.15. Fikse edilmiş ve edilmemiş (kontrol) meme kanseri hücreleriyle beraber T hücre ve KG-1 hücrelerinin üçlü ko-kültürlerinde anti- CD3 mab varlığında T hücrelerinin proliferasyon yüzdeleri. Solda fikse edilen ve edilmeyen lüminal tipteki hücrelerle (MCF-7, BT- 474); sağda fikse edilen ve edilmeyen bazal-benzeri tipteki hücrelerle (MDA-MB-468, MDA-MB-231) yapılan ko-kültürlerdeki T hücrelerin proliferasyon yüzdeleri gösterilmektedir. Kesik çizgiler KG-1 ile T hücrelerin ikili ko-kültüründeki proliferasyon yüzdesini vermektedir. Fikse edilmiş meme kanseri hücreleri ile yapılan üçlü ko-kültürlerdeki T hücre proliferasyonundaki inhibisyonun doğrulanması amacıyla, kokültürlerdeki KG-1 hücrelerinin oranı artırıldı. Böylelikle, T hücrelerin proliferasyon düzeyi yükseltildi (KG-1 : T hücre oranı 0.5 :1). Fikse edilmil bazal-benzeri MDA-MB-231 hücreleriyle yapılan ko-kültürlerde, meme kanseri hücrelerinin oran artışına bağımlı olarak inhibisyon etkisinin de arttığı doğrulandı (Şekil 4.15).

64 Şekil 4.16. Kontrol (fikse edilmemiş) MDA-MB-231 hücreleri ile T hücre ve KG-1 hücrelerinin üçlü ko-kültür sonuçlarının temsili akım sitometri histogramları (KG-1 : T oranı ; 0.125 : 1) sol kenardaki histogramlarda gösterilmiştir. Fikse edilmiş MDA-MB-231 hücreleri ile T hücre ve KG-1 hücrelerinin üçlü ko-kültür sonuçlarının temsili akım sitometri histogramları (KG-1: T oranı ; 0.125 : 1 dir) ikinci sütunda gösterilmiştir. Fikse edilmiş MDA-MB- 231 hücreleri ile T hücre + KG-1 hücrelerinin ko-kültür sonuçlarının temsili akım sitometri histogramları (KG-1: T oranı ; 0.5 : 1 dir) sağ kenardaki histogramlarda gösterilmiştir. Üst kısımda T hücre ve KG-1 hücrelerinin ikili ko-kültür sonuçlarının temsili akım sitometri histogramları (KG-1 : T oranı ; 0.125 : 1 iken T hücre proliferasyonu %17.22; KG-1: T oranı ; 0.5 : 1 iken T hücre proliferasyonu %76.3 dür) gösterilmiştir.

65 Gerçekleştirilen T hücre proliferasyon deneyleri sonucunda T hücrelerin uyarımı için 2:1 T hücre : meme kanseri ko-kültür oranının optimum olduğu görüldü. Bu oranda elde edilen lüminal ve bazal benzeri meme kanseri hücreleri ile yapılan ko-kültürlerdeki sonuçlar karşılaştırılmalı olarak Şekil 4.17 de verilmiştir. A B Şekil 4.17 A. Naif ve ön-uyarımı yapılmış T hücrelerle meme kanseri hücrelerinin ikili ko-kültürü ile elde edilen T hücre proliferasyon değerleri B. KG-1, T hücre ve fikse edilen veya fikse edilmeyen (kontrol) meme kanseri hücreleriyle yapılan üçlü ko-kültürlerde (0.125:1:1) T hücre proliferasyon değerleri gösterilmiştir. Bazal-benzeri hücreler tarafından salgilanan faktörlerin T hücre proliferasyonunda etkisi olabilir. Meme kanseri hücreleri tarafından salgılanan faktörlerin yokluğunda yüzey moleküllerinin inhibe edici etkisi vardır.

66 4.4. Meme Kanseri Hücreleri ile Ko-Kültürü Yapılan CD4 + T Hücrelerde Aktivasyon Belirteçlerinin Analizi MCF-7, BT-474, MDA-MB-468 ve MDA-MB-231 ile naif veya önuyarımı yapılmış T hücreleri anti-cd3 mab varlığında 20 saat boyunca 2:1 oranında ko-kültür yapıldı. CD25, CD69 ve CD154 aktivasyon belirteçlerinin T hücreler yüzeyindeki varlığı akım sitometri ile analiz edildi. Naif T hücrelerle yapılan ko-külterlerde: MCF-7 ile yapılan ko-kültür sonucunda T hücreler üzerindeki CD154 %2.8, CD25 %7.2, CD69 %27.5; BT-474 ile yapılan ko-kültür sonucunda T hücreler üzerindeki CD154 %2.2, CD25 %5.6, CD69 %31.4; MDA-MB-468 ile yapılan ko-kültür sonucunda T hücreler üzerindeki CD154 %2.8, CD25 %9.4, CD69 %39.5; MDA-MB-231 ile yapılan ko-kültür sonucunda T hücreler üzerindeki CD154 %1.5, CD25 %14.2, CD69 %43.4 olarak tespit edildi. Ko-kültür sonuçları, kontrol T hücre ile yapılan analizlerle (CD154 %1.8, CD25 %11.2, CD69 %24.05) karşılaştırıldığında CD25 te lüminal hücrelerde azalma yönünde değişiklik olduğu, CD154 ekspresyonlarında bir fark olmadığı ancak CD69 ekspresyonun bazal-benzeri hücreler olan MDA-MB-468 ve MDA-MB-231 de daha yüksek olduğu saptandı (Şekil 4.18 ve 4.20).

67 Şekil 4.18 Naif T hücreler ile meme kanseri hücrelerinin (MCF-7, BT-474, MDA-MB-468 ve MDA-MB-231) 20 saat ko-kültüründen sonra T hücre aktivasyon belirteçleri CD25, CD69 ve CD154 ekpresyonlarının temsili akım sitometri histogramları. Ön-uyarımı yapılmış T hücreler ile yapılan ko-külterlerde: MCF-7 ile yapılan ko-kültür sonucunda T hücreler üzerindeki CD154 %4.6, CD25 %49.9, CD69 %85.6; BT-474 ile yapılan ko-kültür sonucunda T hücreler üzerindeki CD154 %5.3, CD25 %48.3, CD69 %86.6; MDA-MB-468 ile yapılan ko-kültür sonucunda T hücreler üzerindeki CD154 %4.3, CD25 %41.3, CD69 %81.6; MDA-MB-231 ile yapılan ko-kültür sonucunda T hücreler üzerindeki CD154 %1.9, CD25 %52.6, CD69 %82.1 olarak tespit edildi. Ko-kültür sonuçları, kontrol ön-uyarımı yapılmış T hücre ile yapılan analizlerle (CD154 %1.9, CD25 %55.4, CD69 %83.9) karşılaştırıldığında üç molekülün de ekspresyonunda bir fark olmadığı tespit edildi.

68 Şekil 4.19 Ön-uyarımı yapılmış T hücreler ile meme kanseri hücrelerinin (MCF-7, BT-474, MDA-MB-468 ve MDA-MB-231) 20 saat kokültüründen sonra T hücre aktivasyon belirteçleri CD25, CD69 ve CD154 ekpresyonlarının temsili akım sitometri histogramları.

69 Şekil 4.20 Naif ve Ön-uyarımı yapılmış T hücreler ile meme kanseri hücrelerinin (MCF-7, BT-474, MDA-MB-468 ve MDA-MB-231) 20 saat ko-kültüründen sonra aktivasyon belirteçleri CD25, CD69 ve CD154 ekpresyonlarının karşılaştırmalı grafikleri (*P<0.05).