1,2 Özlem Kurnaz-Gömleksiz, 3 Bengü Tokat, 3 Ezgi Irmak Aslan, 3 Fatih Yanar, 2,3 Deniz Kanca, 4 Zehra Buğra, 3 Hülya Yılmaz Aydoğan 1 Haliç Üniversitesi Tıp Fakültesi, Temel Tıp Bilimleri, Istanbul, Türkiye 2Haliç Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Istanbul 3İstanbul Üniversitesi, Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü, Moleküler Tıp AD, İstanbul, 4 İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi, Kardiyoloji Anabilim Dalı, Istanbul, Kongresi 3-6 Kasım 2015
Proteoglikanlar, bir kor proteine kovalent olarak bağlanmış, lineer, sülfatlanmış polisakkaritler ve glikozaminoglikanlardan (GAG) oluşan proteoglikan makromoleküllerinin heterojen bir süperailesidir.
Heparan sülfat proteoglikanları (HSPGs) bir çekirdek protein ve bir veya daha fazla heparan sülfat (HS) glikozaminoglikan (GAG) zincirleri, değişken N-asetillenmiş ya da N-sülfatlanmış glikozamin birimleri (GlcNAc/GlcNS) ve üronik asit (GlcA or IdoA) içeren bir lineer polisakkaritten oluşmaktadır.
HSPGlerin 3 alt ailesi vardır: Membranı kateden proteoglikanlar (sindekan, betaglikan ve CD44v3) GPI-bağlı proteoglikanlar (glypican) Salgılanan ekstraselüler matriks proteoglikanları (agrin, kollajen XVIII ve perlekan)
Bazı HSPGları kondroitin sülfat/ dermatan sülfat, şeker komponentlerindeki (GalNAc and GlcA/IdoA) HSları ve modifikasyon paternleri farklı olan GAG zincirleri ve diğer glikan tiplerini (N-bağlı ve O-bağlı müsin tipi zincirler) içerebilir. Yüksek negatif yükleri nedeniyle, HS zincirleri FGF aile üyelerinin çoğunu, onların tirozin kinaz reseptörlerini, TGF, BMP, Wnt proteinleri, kemokinler, interlökinler, enzimler, enzim inhibitörleri, lipazlar, apolipoproteinler, ECM ve plazma proteinlerini içeren çok sayıda protein bağlar.
Heparan sülfat proteoglikanı 2 (HSPG2) ya da perlekan en büyük ekstraselüler matriks-ilişkili HSPG dir ve bazal membranın integral komponentidir. Perlekan 400-470 kda luk bir kor proteindir. Perlekan çekirdek proteini, heparan sülfat zincirini oluşturan N- ve O- bağlı oligosakkaritlerin eklenmesiyle posttranskripsiyonel olarak modifiye olur. Diğer bazal membran komponentleriyle (Laminin, Prolargin, Kollajen tip IV) etkileşim halindedir.
Ekstraselüler matriksteki (ECM) proteoglikanlar aterojenezde hem hücresel hem de moleküler süreci etkilemektedir. Heparan sülfat proteoglikanları anti-aterojenik olarak öngörülmektedir. Çünkü farklı türlerde azalmış HS artmış aterosklerozla ilişkilendirilmiştir. Perlekan, arteryal ECM'de en etkili HS proteoglikandır. endotel tabakasının altında bazal membranda ve medial düz kas hücrelerinin etrafında bulunur.
Perlekan domen I'de HS glikozaminoglikan (GAG) yan zinciri için üç ek bölge ve domen V'te ek bir bölge daha içeren çekirdek bir protein içermektedir. Perlekanın insan karotid aterosklerozunda down regüle edildiği, diğer taraftan perlekanın biglikan ile birlikte farelerde aterosklerotik lezyonlarda en etkili proteoglikan olduğu gösterilmiştir. HS'ın antiaterojenik özelliği çeşitli mekanizmalardan kaynaklanabilir: HS'ın enzimatik yıkımı, endotelyal matrikse LDL bağlanmasının in vitro olarak artışını göstermiştir. Bu durum HS'ın lipid birikimini engelleyebileceğine işaret etmektedir.
HS ayrıca LDL'nin endotel geçirgenliğini azaltmaktadır HS'nın yıkımı monosit bağlanmasının arttığını göstermektedir. Heparin ve HS düz kas hücrelerinin plak stabilitesini ve büyüklüğünü etkileyebilecek güçlü bir inhibitörüdür. Ancak HSPG LDL'ye bağlandığı in vitro olarak gösterilmiştir Bu pro-aterojenik rolü olabileceğine dikkat çekmektedir.
Lipid metabolizması Lipoprotein lipaz enzimi VLDL lerin ve şilomikronların triaçilgliserol komponentini serbest yağ asitleri ve gliserole hidroliz eder. İntravenöz heparinin antilipidemik özellikleri üzerindeki erken gözlemler, ve ilişkilendirilmiş artmış serum lipoprotein lipazlar, bu enzimin kan damarlarının interior hattında yerleşik olduğunu ve belki de heparin-benzeri bir moleküle bağlı olduğunu önermektedir. Heparan sülfat ve heparin deneysel koşullarda lipoprotein lipaza bağlanmaktadır.
Kültüre edilmiş endotel hücreler heparan sülfat sentez ederler ve glikozaminoglikan zincirleri endotelyal yüzeyde lipoprotein lipaz bağlanma bölgesinin önemli bir komponentidir. Periferik kandan elde edilen bir heparan sülfat fraksiyonu lipoprotein lipaz aktivitesini stimüle etmektedir. Ama endotelyal hücreye bağlı enzim benzer olarak aktif formda mıdır?? Proteoglikan enzimi lipoproteinler için hücre yüzey reseptörlerine yakın temasa getirerek lipid metabolizmasını kolaylaştırabilir.
Karaciğerde TLR klirensini etkileyecek Diabet ile indüklenmiş değişiklikler Normal karaciğerde trigliseridden zengin lipoprotein (TRL) klirensi dişse aralığına girmesiyle başlar ve çoklu salgılanmış ve membrana bağlı HSPGlere (mavi noktalı zincir) bağlanır. İnsülin eksikliği, hepatosit proteoglikanlarındaki değişiklikleri indükler. HSPGlerin TRL lere bağlanma yetisi değişir ve bu durum Yüksek serum trigliserid düzeyleriyle sonuçlanır.
HSPG2 geni kromozom 1p36.1->p35 de lokalize Polimorfik BamHl restriksiyon bölgesi I. Domende, intron 6da haritalanmıştır. I. Domen amino terminal uca yakındır ve proteoglikanlar için eşsizdir, diğer proteinlerle homoloji göstermez. Domain I HS yan zinciri için varsayılan bir eklenme bölgesi içerir. Polimorfik BamHl restriksiyon bölgesi (rs3767140) T- G transversiyonu.
Amaç Heparan sülfat proteoglikan (HSPG) düzeylerindeki azalma artmış aterosklerozla ilişkilendirilmekte ve anti-aterojenik olarak öngörülmektedir. HS nın enzimatik yıkımı LDL'nin endotelyal matrikse bağlanmasını in vitro olarak arttığından, HS lipid birikimini engelleyebileceği düşünülmektedir. HS yıkımının monosit bağlanmasını da arttığını gösterilmiş ve HS nın LDL'nin endotel geçirgenliğini de azalttığı bildirilmiştir. Son çalışmalarda özellikle aterosklerozlu diyabetik hastalarda daha fazla olmak üzere ateroskleroz ve diabet varlığında HS nın azaldığı rapor edilmiş ancak mekanizma ve HS daki azalışın önemi henüz kesin açıklanamamıştır.
Gereç ve Yöntem Araştırmamızda 161 koroner kalp hastasında 60 diabetik ve 101 diabetik-olmayan 109 sağlıklı kontrol
HSPG2 Geni BamH1 (rs3767140) polimorfizmi PCR RFLP yöntemiyle çalışılmıştır. Genotip ve allel frekansları ki-kare testi ile karşılaştırılmıştır. Klinik, klinik olmayan parametreler ve alleller Kruskal Wallis testi ile karşılaştırılmıştır. Genotipler ve Klinik, klinik olmayan parametreler Student s t test ile karşılaştırılmıştır.
Çalışmamıza dahil edilen KKH hastaları ve sağlıklı kontrol grubuna ait özelliklere bakıldığında; koroner kalp hasta grubunda kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, sigara kullanımı (p=0.004, kikare=8.214), sistolik ve diyastolik kan basınçları (p=0.001), açlık kan şekeri (p=0.001) ve serum LDL-K düzeyleri (p=0.03) istatistiksel olarak anlamlı seviyede yüksek gözlenmiştir (Tablo-1).
Tablo 1 : Çalışma Gruplarının Karakteristik Özellikleri Gruplar Kontrol KKH Total KKH T2DM (-) KKH T2DM (+) Hasta (n=109) Hasta (n=161) Hasta (n=101) (n=60) Yaş (yıl) 56.47±10.70 56.66±11.81 55.39±11.38 58.63±12.29 Cinsiyet (Kadın/Erkek) (n) 42/67 57/99 22/74 35/25 VKİ (kg/m 2 ) 25.85±3.73 26.02±3.62 25.76±3.55 26.73±3.73 Total-K (mmol/l) 5.04±1.17 5.38±1.12 5.42±1.09 5.31±1.18 TG (mmol/l) 2.09±1.43 1.81±0.91 1.78±0.93 1.89±0.86 HDL-K(mmol/L) 1.08±0.27 1.07±0.24 1.09±0.24 1.02±0.23 LDL-K(mmol/L) 3.01±1.07 3.45±1.02 3.48±1.05 3.38±0.95 VLDL-K(mmol/L) 0.71±0.31 0.78±0.32 0.74±0.30 0.85±0.35 P=0,001 SKB (mmhg) 119.10±10.06 135.0±29.43 131.49±29.65 141.50±28.22 DKB (mmhg) 71.52±8.34 82.89±17.34 81.76±17.27 85.00±17.50 P=0,001 Açlık kan şekeri (mg/dl) 112.40±16.02 174.73±120.21 122.29±72.28 239.88±136.26 Sigara Kullanımı (%) 30.3 58.3 P=0,004 73.8 27.9 Aile KAH hikayesi varlığı 44.4 35.6 36.6 31.6 (%) Hipertansiyon varlığı (%) - 49.6 43.2 60.0 SVH varlığı (%) - 29.4 28.2 35.7 Tablodaki yaş, serum lipid, VKİ ve kan basınçları değerleri X+SD olarak verilmiştir. Gruplar arası önemlilik derecesi student s t testi ile incelenmiştir. KKH: Koroner kalp hastalığı, VKİ : Vücut kitle indeksi, Total-K: total-kolesterol, TG: Trigliserid, HDL-K: HDL-kolesterol, LDL-K:LDL-kolesterol, VLDL-K:VLDL-kolesterol, SVH: sol ventrikül hipertrofisi, n : örnek sayısı.
Tablo 1 : Çalışma Gruplarının Karakteristik Özellikleri Gruplar Kontrol KKH Total KKH T2DM (-) KKH T2DM (+) Hasta (n=109) Hasta (n=161) Hasta (n=101) (n=60) Yaş (yıl) 56.47±10.70 56.66±11.81 55.39±11.38 58.63±12.29 Cinsiyet (Kadın/Erkek) (n) 42/67 57/99 22/74 35/25 VKİ (kg/m 2 ) 25.85±3.73 26.02±3.62 25.76±3.55 26.73±3.73 Total-K (mmol/l) 5.04±1.17 5.38±1.12 5.42±1.09 5.31±1.18 TG (mmol/l) 2.09±1.43 1.81±0.91 1.78±0.93 1.89±0.86 HDL-K(mmol/L) 1.08±0.27 1.07±0.24 1.09±0.24 1.02±0.23 LDL-K(mmol/L) 3.01±1.07 3.45±1.02 3.48±1.05 P=0,031 3.38±0.95 VLDL-K(mmol/L) 0.71±0.31 0.78±0.32 0.74±0.30 0.85±0.35 SKB (mmhg) 119.10±10.06 135.0±29.43 131.49±29.65 141.50±28.22 DKB (mmhg) 71.52±8.34 82.89±17.34 P=0,001 81.76±17.27 85.00±17.50 Açlık kan şekeri (mg/dl) 112.40±16.02 174.73±120.21 122.29±72.28 239.88±136.26 Sigara Kullanımı (%) 30.3 58.3 73.8 P=0,001 27.9 Aile KAH hikayesi varlığı 44.4 35.6 36.6 31.6 (%) Hipertansiyon varlığı (%) - 49.6 43.2 60.0 SVH varlığı (%) - 29.4 28.2 35.7 Tablodaki yaş, serum lipid, VKİ ve kan basınçları değerleri X+SD olarak verilmiştir. Gruplar arası önemlilik derecesi student s t testi ile incelenmiştir. KKH: Koroner kalp hastalığı, VKİ : Vücut kitle indeksi, Total-K: total-kolesterol, TG: Trigliserid, HDL-K: HDL-kolesterol, LDL-K:LDL-kolesterol, VLDL-K:VLDL-kolesterol, SVH: sol ventrikül hipertrofisi, n : örnek sayısı. P=0,001 P=0,001
Diabetik-olmayan hastalarda, kontrol grubuyla kıyaslandığında sigara kullanımı (p=0.001), LDL-K (p=0.031), SKB ve DKB (p=0.001) yüksektir. Diabetik-olmayan hastalarda diabetik olanlara göre sigara kullanımı (p=0.001) yüksek ve AKŞ (p=0.001) düşüktür. Diabetik hastalarda ise AKŞ'nin (p=0.001), SKB ve DKB'nin (p=0.001) yüksek olduğu bulunmuştur.
Tablo 2. Çalışma Gruplarında HspG2 rs3767140 G>T SNP Dağılımları HspG2 SNP Kontrol (n=109) Total KKH Hasta (n=161) Gruplar T2DM (-) KKH Hasta (n=101) T2DM (+) KKH Hasta (n=60) Genotipler GG 76 (%69.7) 111 (%68.9) 70 (%69.3) 41 (%68.3) TT 2 (%1.8) 7 (%4.3) 4 (%4.0) 3 (%5.0) GT 31 (%28.4) 43 (%26.7) 27 (%26.7) 16 (%26.7) HWE p=0.565 p=0.290 p=501 p=0.396 Alleller G 183 (%83.94) 265 (%82.30) 167 (%82.67) 98 (%81.67) T 35 (%16.06) 57 (17.70) 35 (%17.33) 22 (%18.33) n : örnek sayısı, HWE: Hardy-Weinberg Eşitliği. Kontrol ve koroner kalp hasta gruplarında HSPG2 geninde incelenen rs3767140 G>T SNP e ait genotip, allel dağılımları ve Hardy-Weinberg Eşitliği (HWE) ne uyumları HSPG2 rs3767140 G>T genotip dağılımları hem kontrol hem de KKH hasta grubunda HWE ye uyumlu bulunmuştur (p>0,05). HspG2 rs3767140 SNP nin hem Total KKH Hasta hem de Tip2 diyabet varlığına göre yapılan alt gruplardaki dağılımı ile kontrol grubu dağılımı benzer bulunmuştur (p>0.05).
Çalışma gruplarında HspG2 rs3767140 G>T polimorfizminin, total kolesterol, trigliserid, HDL-K, LDL-K, VLDL-K, vücut kitle indeksi, sistolik kan basıncı, diastolik kan basıncı ve açlık kan şekeri gibi metabolik parametreler üzerindeki etkisine bakıldığında; kontrol grubunda T alleli taşımayan (GG genotipli) bireylerde diyastolik kan basıncı T alleli taşıyanlara (TT+GT) göre yüksek bulunmuştur (p=0,048).
Tablo 3. HspG2 rs3767140 G>T SNP nin Çalışma gruplarında metabolik parametreler üzerindeki etkisi HspG2 rs3767140 G>T Genotipleri Grup GG TT+GT p değeri Kontrol TK (mmol/l) 5.18±1.21 4.47±0.86 0.151 TG (mmol/l) 2.26±1.54 1.48±0.65 0.204 HDL-K (mmol/l) 1.06±0.29 1.14±0.19 0.484 LDL-K (mmol/l) 3.05±1.11 2.83±0.95 0.625 VLDL-K (mmol/l) 0.75±0.32 0.57±0.20 0.191 VKİ (kg/m 2 ) 26.19±3.76 25.03±3.60 0.243 SKB (mmhg) 120.1±11.08 116.5.16 0.268 DKB (mmhg) 72.97±8.37 67.00±6.75 0.048 Açlık kan şekeri (mg/dl) 111.50±18.36 116.00±11.42 0.841 DM (-) KKH Hasta TK (mmol/l) 5.44±1.07 5.38±1.12 0.803 TG (mmol/l) 1.63±0.72 2.09±1.23 0.032 HDL-K (mmol/l) 1.08±0.24 1.10±0.24 0.702 LDL-K (mmol/l) 3.54±1.05 3.34±1.08 0.446 VLDL-K (mmol/l) 0.71±0.31 0.81±0.28 0.189 VKİ (kg/m 2 ) 25.97±3.63 25.27±3.40 0.437 SKB (mmhg) 133.04±32.11 128.04±23.58 0.506 DKB (mmhg) 82.45±19.25 80.22±12.01 0.610 Açlık kan şekeri (mg/dl) 141.29±89.26 95.47±17.30 0.021 DM (+) KKH Hasta TK (mmol/l) 5.39±1.23 5.07±1.06 0.448 TG (mmol/l) 1.84±0.90 2.02±0.70 0.581 HDL-K (mmol/l) 0.99±0.22 1.11±0.25 0.132 LDL-K (mmol/l) 3.54±0.93 2.89±0.91 0.060 VLDL-K (mmol/l) 0.82±0.36 0.92±0.32 0.431 VKİ (kg/m 2 ) 26.67±4.05 26.88±3.20 0.897 SKB (mmhg) 135.74±25.22 153.46±31.32 0.062 DKB (mmhg) 82.41±15.53 90.38±20.66 0.180 Açlık kan şekeri (mg/dl) 268.00±139.21 175.20±109.40 0.071 Diyabeti olmayan koroner kalp hastalarında GG genotipli hastaların açlık kan şekeri seviyeleri GT+TT genotipli hastalara göre istatistiksel anlamlı olarak yüksek (p=0,021) gözlenirken, trigliserid düzeyleri daha düşük gözlenmiştir (p=0,032). Diyabeti olan hasta grubunda ise GG genotipli bireylerde TT+GT genotipine göre açlık kan şekerinin ve LDL-K seviyelerinin daha yüksek, sistolik kan basıncının ise daha düşük olduğu bulunmuştur. Ancak bu sonuçlar istatistiksel anlamlılık göstermemektedir(sırasıyla p=0.071, p=0.060, p=0.062).
Diabetik-olmayan hasta grubunda HSPG2-rs3767140 normal-gg genotipi nadir-gt+tt genotiplilere göre yüksek AKŞ seviyeleri ile ilişkilidir (p=0,021). Diabetik hasta grubunda da GG genotipli bireylerde TT+GT genotipine göre AKŞ (p=0.071) ve LDL-K (p=0.060) seviyelerinin daha yüksek olduğu gözlenmiştir.
Sonuç Bulgularımız, HSPG2-rs3767140 varyasyonunun diabetik ve diabetik-olmayan koroner kalp hastalarında açlık kan şekeri ve LDL-K düzeylerinde azalma ile ilişkili olabileceği ve bu nedenle bu varyasyonun diabetik ve diabetik olmayan KKH hastalarında koruyucu yönde etkili olduğuna işaret etmektedir.