Rubella Real-TM Qual El Kitabı

Transkript

1 Rubella Real-TM Qual El Kitabı Rubella Virus Kalitatif Tespiti için Real-Time PCR test REF TV24-50FRT 50

2 İSİM RUBELLA Real-TM Qual KULLANIM AMACI RUBELLA Real-TM Qual, plazma, serum, göbek kordon kanı, mukozal swablar (nazal,oral), lavajlar, amniyotik sıvı ve dokuda Rubella (Rosolia) Virus RNA nın kalitaif tespiti için bir Real- Time testtir. RUBELLA RNA, Rubella veya Rubella IC ye özel floresan reporter kullanılarak tespit edilen ve RT amplifikasyon kullanılarak amplifiye edilen örneklerden ekstrakte edilir. TAHLİL PRENSİBİ Polimeraz zincir reaksiyonuyla (PCR) Rubella virus tespiti, spesifik primerler kullanılarak patojen genom spesifik bir bölgesinin amplifikasyonu esasına dayanır. Real- Time PCR 'da, amplifiye ürün floresan boyalar kullanılarak tespit edilir. Bu boyalar, amplifiye ürüne spesifik olarak bağlanan oligonükleotid problar ile bağlantılıdır. Real-Time PCR esnasında floresan yoğunluğunun real-time izlenmesi, PCR çalıştırıldıktan sonra reaksiyon tüplerinin yeniden açılmadan, ürün birikiminin tespitine olanak sağlar. RUBELLA Real-TM Qual PCR kit, her bir numunenin ekstraksiyon işlemini kontrol etmek ve olası inhibasyon reaksiyonunu belirlemek için ekstraksiyon prosedüründe kullanılması gereken bir Internal (iç) kontrol içeren kalitatif bir testtir. RUBELLA Real-TM Qual PCR kiti, spesifik olmayan primed reaksiyonların sıklığını büyük ölçüde azaltan, "hot-start" (sıcak başlangıç) kullanır. Hotstart, 95 C'de 15 dk. ısıtmayla aktive edilen kimyasal olarak modifiye edilmiş polimeraz (TaqF) kullanarak, Taq-polimeraz ve nükleotidlerin ayrılması yoluyla garanti edilmektedir.

3 SAĞLANAN MALZEMELER Ribo-Sorb-50 : klinik örneklerden RNA İzolasyonu Lysis Solution, 22,5 ml; Washing Solution, 20 ml; Sorbent, 1,25 ml. RNA-buffer, 5 x 0,5ml; 50 test için reaktifleri içerir. RUBELLA Real-TM Qual : RT Real Time kit RT-G-mix-2, 0,015ml. RT-PCR-mix-1-FRT Rubella, 0,6 ml. RT-PCR-mix-2-FEP/FRT, 0,3 ml. Polymerase (TaqF), 0,03 ml TM Revertase (M-MLV), 0,015 ml; Positive Control cdna Rubella / STI (C+), 0,1 ml RNA-buffer, 0,6 ml Negative Control (C )*, 0,5 ml x 2; Positive Control Rubella -rec**, 0,1 ml x 2; Internal Control STI-87-rec (IC)***, 0,5 ml * izolasyon prosedüründe Ekstraksiyon Negatif Kontrol olarak kullanılmalıdır ** izolasyon prosedüründe Ekstraksiyon Pozitif Kontrol olarak (10 µl RNA C+ Rec ve 90 µl Negative Control, PCE etiketli tüpe eklenir )kullanılmalıdır. *** 10 µl Internal Control her numuneye, RNA purifikasyon prosedürü esnasında örnek/lysis karışımına doğrudan eklenir.

4 SAĞLANMAYAN GEREKLİ MALZEMELER Alan 1: numune hazırlama: Biyolojik kabin eppendorf tipli tüpler için masa üstü santrifüj (RCF max. 16,000 x g); Eppendorf 5415D veya eşdeğeri 60 C ± 2 C kuru hava bloğu Vortex mixer Aerosol bariyerli pipetörler 1,5 ml lik polipropilen steri tüpler (Sarstedt, QSP, Eppendorf) Atılabilir, tek kullanımlık eldivenler, pudrasız Tüp rakları %70 lik Etanol ( %96 lık etanol ve distile su ile yeni hazırlanmış reaktif karışımı) Aseton Buzdolabı Dondurucu Alan 2: RT ve amplifikasyon: Real Time Thermal cycler Reaksiyon Tüpleri Çalışma istasyonu Pipetler (ayarlanabilir) Filtreli steril pipet uçlerı 1,5/2,0 ml tüpler için rotorlu masa üstü santrifüj Vortex mixer Dondurucu, buzdolabı

5 UYARILAR VE ÖNLEMLER Kullanıcı her zaman aşağıdaki dikkat etmelidir: Lysis Solüsyonu,guanidine thiocyanate* içerir. Guanidin tiyosiyanat solunduğunda veya yutulduğunda veya deri ile temas halinde zararlıdır. Asit ile temasında toksik gaz oluşturur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). Aeresol bariyerli steril pipet ucu kullanın ve her prosedür için yeni pipet ucu kulanın. Ekstrakte pozitif malzemeleri (numuneler, kontroller ve amplikonlar) diğer reaktiflerden uzak tutun/mufaza edin ve reaksiyon karışımına ayrı bir alanda ekleyin. Bütün bileşenleri tahilile başlamadan once oda sıcaklığında iyice çözün. Bileşenler çözündüğünde karıştırın ve kısa bir sure santrifüjleyin. Reaktif ve örnekler ile çalışırken, atılabilir eldiven, laboratuar önlüğü ve göz koruyucu kullanın.işlem sonrası ellerinizi iyice yıkayın. Reaktif ve örnekler ile çalışırken, atılabilir eldiven, laboratuar önlüğü ve göz koruyucu kullanın.işlem sonrası ellerinizi iyice yıkayın. Son kullanım tarihlerinden sonra kitleri kullanmayın. Tüm numuneleri ve kullanılmayan reaktifleri,yerel yönetim kurallara uygun olarak imha edin. Örnekler potansiyel enfeksiyöz olabilir, işlemleri uygun biyogüvenlik uygulamaları ile bir güvenlik kabini içerisinde gerçekleştirn. Dökülen/ saçılan tüm numune veya reaktifleri temizleyin ve %0.5 lik sodyum hipoklorit veya diğer uygun dezenfektanlarla dezenfekte edin. Örnekler veya reaktiflerin deri, göz ve mukoza zarları ile temasından kaçının, temas olması halinde su ile yıkayınız ve hemen tıbbi yardım alın. Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) istek üzerine verilebilir. Bu ürünün kullanımı, DNA amplifikasyonu teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. Laboratuvar süreci tek yönlü olmalı; Ekstraksiyon alanında başlamalı ve sonra Amplifikasyon ve Tespit alanlarına gidilmeli/ yönlenmelidir. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri önceki adımın yapıldığı bölgeye/alana geri döndürmeyin. B u k i t t e k i b a z ı b i l e ş e n l e r k o r u y u c u o l a r a k s o d i u m a z i d i ç e r i r. Reaktif transferi için metal tüp kullanmayınız.

6 ÜRÜN KULLANIM LİMİTLERİ T ü m r e a k t i f l e r s a d e c e i n v i t r o d i a g n o s t i c i ç i n k u l l a n ı l a b i l i r. Bu ürünün kullanımı, DNA amplifikasyonu teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır (UNI EN ISO :2012). Kullanım kılavuzu ile tam uyum, optimum PCR sonuçları için gereklidir. Kutu üzerinde ve tüm bileşenlerin etiketlerinde yazılı olan son kullanma tarihlerine dikkat edilmelidir. Kiti, son kullanım tarihinden sonra kullanmayın. KALİTE KONTROL Her lot, tutarlı ürün kalitesini sağlamak için; SACACE, ISO Sertifikalı Kalite Yönetim Sistemine uygun olarak, önceden belirlenmiş özelliklere karşı test edilmektedir. MUHAFAZA KOŞULLARI RUBELLA Real-TM Qual PCR kitinin bütün bileşenleri ( RT-G-mix-2, RT- PCR-mix-1-FRT Rubella virus, RT-PCR-mix-2-FEP/FRT, polymerase (TaqF) ve TM- Revertase (MMlv) hariç), 2 8 ºC.'de muhafaza edilmelidir. RUBELLA Real-TM Qual PCR kitinin tüm bileşenleri, etiketlerindeki son kullanım tarihine kadar stabidir. Aksi belirtilmedikçe, reaktiflerin raf ömrü ilk kullanım öncesi ve sonrası aynıdır. RT-G-mix-2, RT-PCR-mix-1-FRT Rubella virus, RT-PCR-mix-2-FEP/FRT, polymerase (TaqF) ve TM-Revertase (MMlv) 16 C de muhafaza edilmelidir. RT-PCR-mix-1-FRT Rubella virus ü ışıktan uzak tutun Ribo-Sorb 2-25 C de muhafaza edilmelidir. RUBELLA Real-TM Qual PCR kiti ve Ribo-Sorb, 5 günden fazla olmamak koşuluyla 2 8 C de nakliye edilebilir ancak alındığında hemen önerilen sıcaklıkta muhafaza edilmelidir. STABİLİTE RUBELLA Real-TM Qual etiketinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Ürün etiketinde basılı kontrol tarihine kadar performansını koruyacaktır.işık, ısı veya neme maruz kalma, kitin bazı bileşenlerini etkileyebilir, bunlardan kaçınılmalıdır. Hassasiyet azalabileceğinden, reaktiflerin tekrarlanan çözülme ve dondurma işlemlerinden kaçınılmalıdır. Bileşenler, etiketlerde belirtilenler dışındaki koşullarda muhafaza edildiğinde düzgün çalışmayabilir ve tahlil sonuçlarını olumsuz etkileyebilir.

7 ÖRNEK ALINMASI, MUHAFAZA VE TAŞINMASI RUBELLA Real-TM Qual, aşağıdakilerden RNA ektraktı yapabilir: Peripheral veya umbilical cord (göbek kordonu) kan plazma. Kan Vacuett tüpe alınır. (açık mor kapaklı, 6% EDTA) Hasta gece boyunca veya en az 3 saat yemek yememiş olmalı. Antikoagülanlı kanın düzgün karışmasını sağlamak için tüpü bir kaç kez ters çevirin.kan tüpünü g da oda sıcaklığında 20 dk santrifüjleyin. Plazmadan 1.0 ml alın ve 2.0ml lik steril Eppendorf tüpe aktarın. Tükürük ml tükürük 1.5-ml lik Eppendorf tüpe alınır. Örnek tükürük alınmadan önce hasta ağzını 3 kez su ile çalkalamış(durulamış) olmalıdır. Oropharyngeal swablar, Posterior oropharyngeal yüzey, damak kavisi ve tonsiller bölgeden kuru bir pamuklu prob ile elde edilir. Sürüntü alınmadan önce hasta ağzını su ile çalkalamış (durulamış) olmalıdır. Örnekleme sonrasında, probun pamuk ucu 500 µl transport medium içeren steril tüpe yerleştirilir. Ardından prob çizgili/çentikli yerinden kırılmalı ve tüp sıkıca kapatılmalıdır Amniotic fluid,standart prosedürle amniyosentez sırasında elde edilmeli ve steril bir Eppendorf tüpüne alınmalıdır. Elde edilen örnek iyice resüspanse edilir ve 1 ml'si yeni steril tüpe aktarılır.tüp 8,000 9,000 g da 10 dk santrifüjlenir. P e l l e t ü z e r i n d e s ı v ı μ l b ı r a k a r a k s ü p e r n a t a n t ı a y ı r ı n. A e r e s o l b a r i y e r l i p i p e t u c u k u l l a n ı n. P e l l e t i r e s ü s p a n s e e d i n. Bronchial lavaj, burun yıkama: 2000 g/dk da 10-15dk santrifüjleyin. Eğer pellet görünmezse 10 ml likit ekleyin ve yeniden santrifüjleyin. Süpernatantı ayırın ve kaldırın. Pelleti 100 µl tuzlu suda resüspanse edin. Doku mekanik homojenizer ile homojen hale getirin ve steril PBS de çözün. Specimens can be stored at Örnek 12 saatten fazla olmamak koşuluyla +2-8 C de muhafaza edilebilir veya -20 C - 80 C de dondurulabilir. Klinik örneklerin taşınması, etiyolojik ajanların taşınmasına yönelik ülke, federal, eyalet ya da yerel yönetmeliklere, uymak zorundadır.

8 RNA İZOLASYON Aşağıdaki izolasyon kitleri tavsiye edilir: Ribo-Sorb (Sacace, REF K-2-1) Ribo-Virus (Sacace, REF K-2/C) DNA/RNA-Prep (Sacace, REF K-2-9); SaMag Viral Nucleic Acids Extraction kit (Sacace, REF SM003) plazma için. Lütfen, RNA izolasyonunu üreticinin talimatlatına göre gerçekleştirin. Ekstraksiyon esnasında aşağıdaki kontrolleri kullanın: Positive Control Rubella virus-rec (Ekstraksiyon Pozitif Kontrol, PCE): 90 µl Negative Control (C ) ve 10 µl RUBELLA RNA C+ Rec, PCEetiketli tüpe eklenir; Negative Control (C ): 100 µl Negative Control (C ) C-etiketli tüpe eklenir; Internal Control STI-87-rec (IC): 10 µl Internal Control RNA, RNA izolasyon prosedürü esnasında direkt olarak numune /lysis karışımına eklenir. NUMUNE VE REAKTİF HAZIRLAMA 1. Lysis Solution ve Washing Solution b u z kristalleri yok olana kadar о С ye kadar ısıtılmalıdır. 2. Bir tane Ekstraksiyon Negative Kontrolü ve bir tane Ekstraksiyon RNA Pozitif Kontrolü için olmak üzere gereken miktarda 1.5 ml lik polipropilen tüpleri hazırlayın 3. Her tüpe 10 µl Internal Control ve 450 µl Lysis Solution ekleyin. 4. Uygun tüplere 100 µl numunelerden ekkleyin 5. PKontrolleri aşağıdaki gibi hazırlayın: Iki control tüplerinin herbirine 100 µl Negative Control ekleyin. Cpos etiketli tüpe 10 µl RUBELLA RNA C+ Rec ekleyin. 6. Tüpleri vorteksleyi ve 3-5 sn santrifüjleyin 7. Sorbent i kuvvetlice vorteksleyin ve her tüpe 25 µl ekleyin sn vorteksleyin ve tüm tüpleri oda sıcaklığında 10 dk inkübe edin.periyodik olarak vorteksleyin. 9. Bütün tüpleri 45 sn 10000g de santrifüjleyin ve tıkaçlı aerosol bariyer uçlu miktopipet kullanarak, her tüpten pellet i dağ ıtmadan, süpernatantı dikkatlice ayırın ve kaldırın. Tüpler arası pipet ucunu değ iştirin. 10. Her tüpe 400 µl Washing Solution ekleyin. Kuvvetlice vorteksleyin ve 45 sn 10000g de santrifüjleyin ve tık açlı aerosol bariyer uçlu miktopipet kullanarak, her tüpten pellet dağ ıtmadan, süpernatantı dikkatlice ayırın ve kaldırın. 11. Her tüpe 500 µl %70 Etanol ekleyin. Kuvvetlice vorteksleyin ve 45 sn 10000g de santrifüjleyin ve tıkaçlı aerosol bariyer uçlu miktopipet kullanarak, her tüpten pellet dağ ıtmadan, süpernatantı dikkatlice ayırın ve kaldırın adımı tekrarlayın 13. Her tüpe 400 µl Acetone ekleyin. Kuvvetlice vorteksleyin ve 45 sn 10000g de

9 santrifüjleyin ve tıkaçlı aerosol bariyer uçlu miktopipet kullanarak, her tüpten pellet dağ ıtmadan, süpernatantı dikkatlice ayırın ve kaldırın. 14. Bütün tüpleri kapakları açık halde 60 C.de 10 dk inkübe edin. 15. Pelleti 50 µl RNA-buffer da resüspanse edin. 60 C d e 5 d a k i k a i n k ü b e e d i n v e p e r i y o d i k o l a r a k v o r t e k s l e y i n. 16. Tüpleri maksimum ( g) hızda 1 dk santrifüjleyin. S ü p e r n a t a t n t k u l l a n ı m a h a z ı r R N A / D N A i ç e r i r. Amplifikasyon, ekstraksiyon ile aynı gün gerçekleştirilebilir. Eğer bu mümkün değilse, RNA preparasyonu 1 aya kadar -80 C de muhafaza edilebilir. hemen kullanılmalıdır. Hazırlanmış karışımı depolamayın! Reaktif hacmi x 1 reaksiyon (µl) 10,0 5,00 0,25 0,50 0,25 N RT-PCR- RT-PCR- RT-G- TaqF M-MLV reaksiyonlar 2 mix-1 mix-2 mix-2 Polymerase Revertase N RNA numuneler 1 REAKTİFLERİN HAZIRLANMASI (REAKSİYON HACMİ 25 µl): 1. Gereken sayıda reaksiyon tüplerini hazırlayın. 2. H e r n u m u n e i ç i n y e n i s t e r i l t ü p t e Reaction Mix h a z ı r l a y ı n : 10 μl RT- PCR-mix-1, 5 µl RT-PCR-mix-2, 0,25 µl RT-G-mix-2, 0,50 µl TaqF Polymerase ve 0,25 µl M-MLV Revertase ekleyin. Kuvvetlice vorteksleyin ve 5 sn santrifüjleyin. Bu karışım ,5 3,0 1, ,0 4,0 2, ,5 5,0 2, ,0 6,0 3, ,5 7,0 3, ,0 30,0 15,0 1 numuneler artı 2 ekstraksiyon kontrolü (N+2) 2 numuneler artı ekstraksiyon ve amplifikasyon kontrolleri (N+2+2) 3. Her tüpe 15 µl Reaction Mix ekleyin µl ektrakte RNA numunesini, Reaction Mix li uygun tüplere ekleyin ve pipetlemeyle iyice karıştırın. (Extrakte RNA lı büt ün tüpler i 2 dk maximum ( g) h ı z d a y e n i d e n s a n t r i f ü j l e y i n v e s ü p e r n a t a n t ı d i k k a t l i c e a l ı n. N.B. pelleti dağıtmayın sorbent reaksiyonu inhibe eder!) 5. Her panel için 2 kontrol hazırlayın: 10 µl RNA-buffer, Negative Control etiketli tüpe eklenir; 10 µl RUBELLA cdna Pos & IC Pos Positive Control etiketli tüpe eklenir; Sonuçlar eşik çizgisi ile floresan eğrinin geçiş varlığı sayesinde yorumlanır. Rubella cdna JOE(Yellow)/HEX/Cy3 kanalda, IC DNA FAM (Green) kanalda tespit edilir.

10 AMPLİFİKASYON Real-Time enstrümanınızı üreticinin klavuzuna göre programlayın. rotor-tip enstrümanla r 1 için amplifikasyon programı : Adım Sıcaklık, Floresan Süre С Tespiti Tekrarlar Hold dk 1 Hold dk sn Cycling sn sn 95 5 sn Cycling sn FAM/Green, JOE/Yellow sn 1 Örneğin; Rotor-Gene 3000/6000/Q (Corbett Research, Qiagen) Floresan, FAM/Green ve JOE/Yellow floresan kanallarında Cyling 2 evrenin (60 C) 2. basamağında tespit edilir. plate- ve modular tip enstrümanlar için 2 amlifikasyon programı Adım Sıcaklık, Floresa Süre С n Tekrarlar 1 50 С 15 dk Tespiti С 15 dk 1 95 С 5 sn 3 60 С 20 sn 5 72 С 15 sn 95 С 5 sn 4 60 С 30 sn FAM, HEX/Cy3/Joe С 15 sn 2 Örneğin;, SaCycler-96 (Sacace), CFX/iQ5 (BioRad); Mx3005P (Agilent), ABI 7300/7500/StepOne Real Time PCR (Applied Biosystems), SmartCycler (Cepheid), LineGeneK (Bioer) Floresan FAM ve HEX floresan kanallarda evre 4 (60 C) te tespit edilir. Kanal AYARLAR Rotor-tip enstrümanlar Kalibrasyon/Gain Optimisation Eşik Çizgisi Diğer Ayarlar/ Outlier Remova l % % FAM/Green 3 Fl ila 8 Fl JOE/Yellow 3 Fl ila 8 Fl Slope Correct Açık Açık Açık Açık Dynamic tube Plate-tip enstrümanlar Kanal Eşik çizgisi FAM Eşik çizgisi, sadece pozitif örneklerin sinyal birikiminin sigmoid eğrilerini geçmelidir ve taban çizgisini geçmemelidir; aksi takdirde, eşik seviyesi yükseltilmelidir. Eşik çizgisini, HEX/Joe/Cy3 floresan eğrilerinin linear ve negatif numune eğrilerini geçmediği yerde ayarlayın.

11 VERİ ANALİZLERİ Rubella virus cdna amplifikasyon ürününün birikimi JOE/Yellow/HEX kanalda, Internal Control amplifikasyon ürünü FAM/Green kanalda tespit edilir. Sonuçlar, eşik çizgisi ile floresan eğrisinin geçişleri (veya geçme olmaması) kullanılarak PCR yazılımı tarafından yorumlanır. Analizlerin sonuçları, sadece Amplifikasyon Pozitif ve Negatif kontrolleri için elde edilmiş sonuçlar ise güvenilir olarak kabul edilir bunun yanısıra Ekstraksiyon Negatif Kontrolü için doğrudur. Kontrol Sonuçları Kontrol Kontrol evresi Kanaldaki Ct FAM/Green JOE/Yellow/HEX Yorumlama NCE RNA extraction 35 Neg OK PCE RNA extraction OK NCA RT-PCR Neg Neg OK C+ RT-PCR OK 1. JOE/Yellow/HEX kanalda tespit edilen Ct değeri Ct sınır değerini aşmamışsa (klinik numuneler için < 40) ve FAM/Green kanalda tespit edilen Ct değeri Internal Kontrol (Ct<35) için belirtilen değeri aşmamışsa, numune pozitif kabul edilir. Floresan eğri tipik bir sigmoid şekle sahip olmalı ve önemli floresan artış alanında bir kez eşik çizgisini geçmelidir. 2. Ct, JOE/Yellow/HEX kanalda tespit edilmemişse (floresan eğrisi eşik çizgisini geçmez) ve FAM/Green kanalda tespit edilen Ct değeri Internal Kontrol için belirtilen sınır değerini ( Ct<35) aşmamışsa, numune negatif olarak kabul edilir. KALİTE KONTROL PROSEDÜRÜ Internal Kontrolün (IC) belirtilen miktarı,olası inhibasyon reaksiyonunu belirlemek ve herbir numunenin ekstraksiyon prosesini kontrol etmek amacıyla, numune hazırlama prosedürü başlangıcındaki her numune ve kontrol içine sokulur. Ekstraksiyon negatif kontrolü (NCE), ekstraksiyon pozitif kontrolü(pce), negatif amplifikasyon kontrol (NCA), pozitif amplifikasyon kontrol (C+), numune hazırlama, amplifikasyon ve tespit adımlarının doğru gerçekleştirildiğini doğrulamak için her çalışmada gereklidir. Eğer kontroller beklenilen aralıkların dışındaysa ( Kontrol Sonuçları tablosuna bakınız), bu çalışmadaki numuneler ve kontroller, numune hazırlama adımından itibaren yeniden işlenmelidir.

12 PERFORMANS KARAKTERİSTİKLERİ Analitik Özgünlük RUBELLA Real-TM Qual PCR kitinin analitik özgünlüğü, sıkı reaksiyon koşullarıyla birlikte spesifik primerler ve probların seçimiyle sağlanır. Primerler ve problar, sekans karşılaştırma analizi ile gen bankalarında yayınlanan tüm sekanslara mümkün olan homolojiler açısından kontrol edilmiştir. RUBELLA Real-TM Qual PCR kitinin özgünlüğü, laboratuar klinik testlerde doğrulanmıştır. Analitik Hassasiyet RUBELLA Real-TM Qual kiti 400 kopya / ml den az olmayan hassasiyetli testlerin %100 ünde, RUBELLA RNA tespitine olanak sağlar. RUBELLA Real-TM Qual PCR kitinin iddia edilen analitik özellikleri, yalnızca ilave reaktif kiti (DNA/RNA-prep veya RIBO-sorb veya Ribo-Virus) kullanıldığında garanti edilir. Hedef Alan : p150 gen REFERANSLAR Comparison of four methods using throat swabs to confirm rubella virus infection. Zhu Z, Xu W, Abernathy ES, Chen MH, Zheng Q, Wang T, Zhang Z, Li C, Wang C, He W, Zhou S, Icenogle J. J Clin Microbiol Sep;45(9): Epub 2007 Jun 27 Application of molecular and serological assays to case based investigations of rubella and congenital rubella syndrome. Jin L, Thomas B. J Med Virol Jul;79(7): Improved RT-PCR for diagnosis and epidemiological surveillance of rubella. Cooray S, Warrener L, Jin L. J Clin Virol Jan;35(1): Epub 2005 Jul 12. PCR for detection of rubella virus RNA in clinical samples. TJ Bosma, KM Corbett, S O'Shea - Am Soc Microbiol JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 1995, p An RT-PCR assay using oral fluid samples to detect rubella virus genome for epidemiological surveillance. A.J. Vyse, L. Jin. Molecular and Cellular Probes Volume 16, Issue 2, April 2002, Pages 93-97

13 SORUN GİDERME Analiz sonuçları aşağıdaki durumlarda dikkate alınmaz: 1. Eğer JOE/Yellow/HEX kanalda tespit edilen klinik numunenin Ct değeri Ct sınır değerinden (>37) fazlaysa, sonuçlar şüpheli olarak kabul edilir. Bu analizin iki kez tekrarı gereklidir. Tekrarlanabilir bir pozitif Ct değeri tespit edilirse, numune pozitif olarak kabul edilir. 2. Her iki kanalda Amplifikasyon Negatif kontrol için herhangi bir Ct değeri tespit edililirse veya JOE/Yellow/HEX kanalda Ekstraksiyon Negatif Kontrol (C-) için Ct değeri tespit edilmişse, bunlar reaktiflerin veya nununelerin kontaminasyonunu gösterir. Bu gibi durumlarda, tüm numunelerin analiz sonuçları geçersiz kabul edilir. Kontaminasyon sebeplerini tespit edip ortadan kaldırmak için tedbirler alınarak, tüm testlerin analizinin tekrarlanması gereklidir. 3. Ct değerinin, Ekstraksiyon Pozitif Kontrol (PCE) için olmaması,ekstraksiyon işleminin hatalı yapılığını gösterir.rna ekstraksiyon tüm numuneler için yeniden tekrarlanmalıdır. 4. Ct değerinin RT-PCR (C+) pozitif kontrolü için olmaması, PCR da hatalı uygulama yapıldığını veya yalnış bir amplifikasyon program oladuğunu gösterir. RT-PCR tüm numuneler için yeniden tekrarlanmalıdır. 5. Eğer klinik numunenin Ct değeri JOE/Yellow/HEX için Ct sınır değerinden (>37) daha büyükse veya yoksa ve FAM/Green kanaldaki Ct değeri Internal Kontrol (>37) için belirtilen Ct değerlerinden daha büyükse, sonuçlar geçersizdir. Bu gibi numunelerin analizi, RNA ekstraksiyon aşamasından başlanılarak tekrarlanmalıdır.

14 KULLANILAN SEMBOLLERİN ANLAMLARI Liste numarası Dikkat! Lot Numarası <n> testleri içn yeterli içerik Son kullanım tarihi Versiyon.. de muhafaza NCA Amplifikasyon Negatif Kontrol Üretici C Ekstraksiyon Negatif Kontrol Kullanım Talimatlarına bakınız C+ Amplifikasyon Pozitif Kontrol IC Internal (iç) Kontrol * SaCycler Sacace Biotechnologies tescilli markasıdır * CFX and iq5 Bio-Rad Laboratories tescilli markasıdır * Rotor-Gene of Qiagen tescilli markasıdır * MX3005P Agilent Technologies tescilli markasıdır * ABI Applied Biosystems tescilli markasıdır * LineGeneK Bioer tescilli markasıdır * SmartCycler Cepheid tescilli markasıdır Sacace Biotechnologies Srl via Scalabrini, Como Italy Tel Fax mail: info@sacace.com web: