MTB Real-TM EL KİTABI. Mycobacterium tuberculosis complex tespiti için Real Time PCR kiti. Sadece in Vitro Diagnostic Kullanım için

Transkript

1 Sadece in Vitro Diagnostic Kullanım için MTB Real-TM EL KİTABI Mycobacterium tuberculosis complex tespiti için Real Time PCR kiti REF B15-50FRT REF TB15-50FRT 50

2 İSİM MTB Real-TM AÇIKLAMA Tuberculosis (tubercle bacillus basili için TB olarak kısaltılır), mycobacteria 'nın, özellikle Mycobacterium tuberculosis'in neden olduğu yaygın ve ölümcül bulaşıcı bir hastalıktır. Tüberküloz en sık (pulmoner TB gibi) akciğerlere saldırır ama aynı zamanda merkezi sinir sistemi, lenf sistemi, dolaşım sistemi, genitoüriner sistem, kemikler, eklemler ve hatta cilti de etkileyebilir. Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum ve Mycobacterium microti gibi diğer mikobakteriler de tüberküloza neden olabilir. Dünya nüfusunun üçte birinden fazlası TBC bakterisi tarafından enfekte edilmiştir ve yeni bir enfeksiyon, saniyede bir oranında meydana gelmektedir. Enfekte olmuş kişilerin hepsinde olmasa da full-blown hastalık gelişir ; asemptomik gizli TB enfeksiyonu en yaygın olanıdır. Ancak tedavi edilmediği takdirde, hastalıktan muzdarip olanların yarısından fazlasını öldüren, onda bir gizli enfeksiyon, aktif TB hastalığına doğru ilerleyecektir yılında, mortalite ve morbitide istatistikleri, çoğunlukla gelişmekte olan ülkelerde 14.6 milyon kronik aktif TB vak'ası, 8.9 milyon yeni vak'a ve 1.6 milyon ölüm olduğunu göstermektedir. Ayrıca, immündepresif ilaçlar, madde bağımlılığı ya da HIV/AIDS yüzünden bağışıklık sistemlerinin zayıflamış olmasından dolayı, gelişmiş dünyada artan sayıda tüberküloza yakalanma vardır. Tüberkülozun erken tanısı, etkin işlemler ile mümkündür ve oldukça etkili antitüberküloz tedavisine bağlı klinik tedavi sonuçlarını arttırır, ancak tüberküloz tanısında bazı zorluklar vardır. Uluslararası standartlara göre, tüberküloz tanısı bakteriyolojik ya da histolojik çalışmalarla doğrulanmalıdır, ancak bakteriyolojik yöntemler her zaman akciğer tüberkülozu ve özellikle akciğer dışı tüberkülozdan etkilenen kişilerde Mycobacterium tuberculosis algılamasına olanak vermez. Moleküler biyoloji yöntem uygulamaları, Mycobacterium tuberculosis tanısında zorlukların üstesinden gelinmesine olanak sağlar, ancak bu organizmanın biyolojik özellikleri ve insan ormanizmasının immun yanıtı nedeniyle, Tüberküloz sadece tek bir metod ile teşhis edilemez. Direkt ve indirekt tanı yöntemleri phthisiology'de uygulanır. Ziehl Neelsen boyama tekniği ile Smear bacterioscopy, hızlı ve ucuz bir yöntemdir, ancak hassasiyeti düşük ve yüksek özgünlükte değildir ve tüberküloz dışı mycobacteria'dan olan TB'yi ayırt edemez. Yöntemin tanısal hassasiyeti, %20-40'tan fazla değildir. Smear floresan mikroskopisi daha hassas bir yöntemdir, çalışma esnasında mikroskopun daha az yayılmasını gerektirir ve bu nedenle, %17 ile saptama oranını arttıran immersion sistemli standart mikroskoplarla kıyaslanırsa daha büyük bir alanın gözlemlenmesine imkan verir. Kültür oldukça hassas ve spesifiktir, yavaş gelişme eğilimi nedeniyle, sonuç almak 2-12 hafta sürer. X-ray tanımlama, CAT, tüberkülin tanımlama, tüberküloz antikorlarının teşhisi gibi indirekt yöntemler,direkt TB'yi tespit etmez, ancak organlarda mevcut değişikliklerin anlanmasını sağlarlar.

3 KULLANIM AMACI MTB Real-TM kiti, balgam,idrar, bronşiyal lavaj, doku ve diğer biyolojik malzemelerde Mycobacterium tuberculosis complex 'in (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG, M. microti) Real Time kalitatif tespiti için bir testtir. TAHLİL PRENSİBİ MTB Real-TM kiti, biyolojik malzemelerde Mycobacterium tuberculosis complex 'in kalitatif tespiti için, bir Real Time Amplifikasyon testidir. Mycobacterium tuberculosis DNA, Real Time Amplifikasyon kullanılarak amplifiye örneklerden ekstrakte edilir ve M. tuberculosis vem. tuberculosis IC. için spesifik floresan reporter boya probları kullanılarak tespit edilir. M. tuberculosis IC,bakteriyofajda klonlanan ve modifiye edilen Mycobacterium tuberculosis'in BS 6110 ekleme DNA fragmanıdır, kitte primerler için matriks olarak kullanılan DNA fragmanları içerir. Internal (iç) Kontrol, olası inhibasyon reaksiyonunu tanılamak için ve her biri tek tek işlenen numuneler için bir amplifikasyon kontrolü olarak hizmet vermektedir. IC, M. tuberculosis DNA'dan farklı bir kanalda tespit edilir. MTB Real-TM kiti, reaksiyon karışımına eklenen UDG-Enzyme içerir. Deoxyuridine triphosphate (dutp), sadece aplikonda mevcut olduğundan, deoxythymidine triphosphate (dttp), UDG enzim kullanımı,amplikon kontaminasyonu olasılığını kaçınarak önceki çalışmada oluşturulan tek amplikonları indirgeyen MTB DNA'da mevcuttur. UGD, doğru ve istenilen aplikon deneyinin etkilenmediği aplifikasyonun inaktive olduğu zamanda iken Mastermix hazırlama esnasında oda sıcaklığında aktiftir.

4 SAĞLANAN MALZEMELER Modül No.1: Real Time PCR kit (B15-50FRT) Part N 2 Kontroller C MTB & IC, 0,1 ml; Negative Control C-, 1,2 ml;* MTB IC, 1,0 ml;** DNA-buffer, 0,5 ml; Part N 3 MTB Real-TM : Real Time Amplifikasyon PCR-mix-1, 2 x 0,28 ml; PCR Buffer Flu, 0,28 ml; TaqF Polymerase, 0,03 ml; UDG-Enzyme, 0,03 ml. 55 test için reaktifler içerir Modül No.2: DNA purifikasyon kiti (TB15-50FRT) ile Komple Real Time PCR testi Part N 1 DNA/RNA Prep : Numune Hazırlama Lysis Sol, 15 ml; Prec Sol, 20 ml; Washing Sol 3, 25,0 ml; Washing Sol 4, 10,0 ml RE-buffer, 4 x 1,2 ml; 50 test için reaktifler içerir Part N 2 Controls C MTB & IC, 0,1 ml; Negative Control C-, 1,2 ml;* MTB IC, 1,0 ml;** DNA-buffer, 0,5 ml; Part N 3 MTB Real-TM : Real Time Amplifikasyon PCR-mix-1, 2 x 0,28 ml; PCR Buffer Flu, 0,28 ml; TaqF Polymerase, 0,03 ml; UDG-Enzyme, 0,03 ml. 55 test için reaktifler içerir *izolasyon prosedürü esnasında Ekstraksiyon Negatif Kontrolü olarak kullanılmalıdır. 10 µl Internal (iç) Kontrol 'ü DNA izolasyon prosedürü esnasında doğrudan numune/lysis karışımına ekleyin.

5 SAĞLANMAYAN, GEREKLİ MALZEMELER Alan 1 : Numune Hazırlama DNA ekstraksiyon kiti (Modül No. 1) Biyolojik kabin Vorteks 65 C ± 2 C kuru ısı bloğu eppendorf tip tüpler için (RCF max. 16,000 x g) masaüstü mikrosantrifüj, Tüp rakları Mikrosantrifüj tüpleri, 1,5-2,0 ml Steril, RNase içermeyen filtre uçlu pipetler Biyolojik atıklar için atık kabı, Tekk kullanımlık-atılabilir eldivenler (pudrasız), Buzdolabı, Dondurucu Alan 2: Real Time Amplifikasyon Real Time Thermalcycler tüpler veya PCR plate Çalışma istasyonu Steril, RNase içermeyen filtre uçlu pipetler Tüp rakları MUHAFAZA KOŞULLARI Kiti 2-8 C.'de muhafaza edin. Part N 3 MTB Real-TM -20 C'de muhafaza edilmelidir. Kit, 2-8 C de nakliye edilebilir ancak alındıklarında hemen 2-8 C ve -20 C ye getirilmelidirler. DNA/RNA Prep kiti, 2-25 C'de muhafaza edilir. STABİLİTE MTB Real-TM, etiketinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Ürün etiketinde basılı kontrol tarihine kadar performansını koruyacaktır. Işık, ısı veya neme maruz kalma kitin bazı bileşenlerinin raf ömrünü etkileyebilir, bunlardan kaçınılmalıdır. Hassasiyet azalabileceğinden, reaktiflerin tekrarlanan çözülme ve dondurma işlemlerinden kaçınılmalıdır. Bileşenlerin etiketlerde belirtilen koşulların dışında muhafazası, hatalı çalışmaya neden olabilir ve tahlil sonuçlarını olumsuz yönde etkileyebilir. KALİTE KONTROL Her lot, tutarlı ürün kalitesini sağlamak için; Sacace ISO Sertifikalı Kalite Yönetim Sistemine uygun olarak, önceden belirlenmiş özelliklere karşı test edilmektedir.

6 UYARILAR VE ÖNLEMLER In Vitro Diagnostic Medikal Cihaz Sadece In Vitro Diagnostic Kullanım için Kullanıcı her zaman aşağıdakilere dikkat etmelidir: Lysis Solution,guanidine thiocyanate* içerir. Guanidin tiyosiyanat solunduğunda veya yutulduğunda veya deri ile temas halinde zararlıdır. Asit ile temasında toksik gaz oluşturur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). Prec Sol bileşeni 2-propanol içerir: flamyanıcı ve tahriş edicidir. (R , S /25-26), S26:Cilt ve mukoza ile temasından kaçının, S26: Gözle temas halinde, hemen bol su ile yıkayınız ve tıbbi yardım alınız; Aeresol bariyerli steril pipet ucuları kullanın ve her prosedür için yeni pipet ucu kulanın. Ekstrakte pozitif malzemeleri (numuneler, controller ve amplikonlar) diğer reaktiflerden uzak tutun/mufaza edin ve bunları reaksiyon karışımına ayrı bir alanda ekleyin. Bütün bileşenleri tahilile başlamadan önce oda sıcaklığında iyice çözün. Bileşenler çözündüğünde karıştırın ve kısa bir süre santrifüjleyin. Reaktif ve örnekler kullanın. İşlem sonrası ellerinizi iyice yıkayın. ile çalışırken, atılabilir eldiven, laboratuar önlüğü ve göz koruyucu Laboratuar çalışma alanlarında, sigara içmeyin, herhangi birşey yemeyin- içmeyin, kozmetik uygulamayın veya kontakt lenslere elle dokunmayın. Son kullanım tarihlerinden sonra kitleri kullanmayın. Tüm numuneleri ve kullanılmayan reaktifleri,yerel yönetim kurallarına uygun olarak imha edin. Örnekler potansiyel enfeksiyöz olabilir, işlemleri uygun biyogüvenlik uygulamaları ile bir güvenlik kabini içerisinde gerçekleştirin. Dökülen/ saçılan tüm numune veya reaktifleri temizleyin ve %0.5 lik sodyum hipoklorit veya diğer uygun dezenfektanlarla dezenfekte edin. Numune veya reaktiflerin deri, göz veya mukoza zarları ile temasından kaçının. Deri, göz veya mukoza zarları ile temas olması halinde, hemen su ile yıkayın ve acilen tıbbi yardım alın. Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) istek üzerine verilebilir. Bu ürünün kullanımı, DNA amplifikasyonu teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. Laboratuvar süreci tek yönlü olmalı; Ekstraksiyon Alanında başlamalı ve sonra Amplifikasyon ve Tespit alanlarına gidilmeli/ yönlenmelidir. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri önceki adımın yapıldığı bölgeye/alana geri döndürmeyin. * Sadece Modül No.2 Bu kitteki bazı bileşenler koruyucu olarak sodyum azid içerir. Reaktif transferi için metal tüp kullanmayın.

7 ÜRÜN KULLANIM SINIRLARI Tüm reaktifler sadece in vitro diagnostic kullanılabilir. Bu ürünün kullanımı, DNA amplifikasyonu (UNI EN ISO :2012).teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. Kullanım kılavuzu ile sıkı uyum optimum PCR sonuçları için gereklidir. Kutu ve tüm bileşenlerin etiketleri üzerinde yazılı olan son kullanım tarihlerine dikkat edilmelidir. Son kullanım tarihlerinden sonra kitleri kullanmayın. NUMUNE TOPLAMA, MUHAFAZA VE TAŞIMA MTB Real-TM aşağıdakilerden ekstrakte DNA analizi yapabilir: Sputum, bronchial veya tracheal lavage aşağıdaki prosedüre göre işlenmelidir: o Balgam, 50 ml tek kullanımlık, vida kapaklı PP tüplerde toplanır. o Biyolojk kabinde, % 4 NaOH çözeltisi eşit hacimde karıştırıldıktan sonra numune homojen hale getirilir. (gerekirse örnek başına mg miktar, N-asetil-L-sistein ilave edilebilir) dakika (numune yoğunluğuna bağlı olarak) bir tüp rotator ile yoğun bir şekilde karıştırılır. o Numuneler 3000 rpm ( g) de 15 dk. santrifüjlenir ve süpernatantı tüpte µl bırakarak dikkatlice ayırın. Sedimenti resüspanse edin ve 1,5 ml'lik tüpe aktarın. O Numuneleri 12000rpm de 5-10 dk. santrifüjleyin, süpernatantı ayırın ve numune sedimentinden DNA izolasyonu için aynı 1,5 ml'lik numune tüpünü kullanın. doku (~1,0 gr) neşter, cam çubuklar, teflon havan tokmakları veya mekanik homojiner ile homojenize edin ve 1,0 ml tuzlu suda yada PBS sterilde ( 1hacim doku-1hacim tuzlu su) çözün. Kuvvetlice vorteksleyin ve oda sıcaklığında 30 dk. inkübe edin. Süpernatantı yeni bir 1,5 ml'lik tüpe aktarın. tam kan ACD veya ETDA'lı tüplerde toplanır. salgı, Eppendorf tüpte muhafaza edilir. sinovial sıvı, Eppendorf tüpte muhafaza edilir. urine sediment (akışın orta kısmı kullanılır); pleuric versament Eppendorf tüpte muhafaza edilir; mycobacterium liquid culture Trilon-B'de muhafaza edilir; Örnekler 48 saatten fazla olmamak koşulu ile 2-8 C 'de muhafaza edilir ya da -20 C to - 80 C'de dondurulur. Klinik örneklerin taşınması, etiyolojik ajanların taşınmasına yönelik ülke, federal, eyalet ya da yerel yönetmeliklere, uymak zorundadır.

8 DNA İZOLASYON Herhangi bir ticari RNA / DNA izolasyon kiti, burada belirtilen IVD-CE "NUMUNE TOPLAMA, MUHAFAZA VE TAŞIMA" paragrafındaki örnek türleri için valide ise, kullanılabilir. Sacace Biotechnologies aşağıdaki kitleri kullanmanızı önerir: DNA/RNA Prep (Sacace, REF K-2-9); SaMag TB DNA Extraction kit (Sacace, REF SM008). Lütfen, DNA ekstraksiyonunu, üreticinin talimatlarına uygun olarak gerçekleştirin. 10 μl Internal (iç) Kontrol 'ü DNA izolasyon prosedürü esnasında doğrudan numune/lysis karışımına ekleyin. NUMUNE VE REAKTİF HAZIRLAMA 1. Bir tüp te Ekstraksiyon Negatif Kontrolü (Negative Control, C-) için olmak üzere, gereken miktarda 1,5 ml'lik tek kullanımlık polipropilen mikro tüpleri hazırlayın. N.B. Numune balgam ise, balgam hazırlama prosedüründen elde edilen aynı 1,5 ml'lik numune tüpünü kullanın (NUMUNE TOPLAMA, MUHAFAZA VE TAŞIMA kısmına bakınız) 2. Her tüpe 10 µl MTB IC (Internal Control) ve 300 µllysis Sol ekleyin. 3. Uygun tüpler aerosol bariyerli pipet uçları kullanarak 100 µl numune ekleyin. 4. Kontrolleri aşağıdaki gibi hazırlayın : o Cneg etiketli tüpe 100 µl of Negative Control C ekleyin 5. Tüpleri vorteksleyin ve 65 C'de 5 dk. inkübe edin sn. santrifüjleyin µl Prec Sol ekleyin ve vorteksleyerek karıştırın. Bütün tüpleri r/dk de. 5dk. santrifüjleyin ve tıkaçlı aerosol bariyer uçlu mikropipet kullanarak, her tüpten pelleti dağıtmadan, süpernatantı dikkatlice ayırın ve kaldırın. Tüpler arasında pipet uçlarını değiştirin. 7. Her tüpe 500 µl Washing Solution 3 ekleyin. Kuvvetlice vorteksleyerek pelletin yıkanmasını sağlayın. Bütün tüpleri r/dk de. 60 sn. santrifüjleyin ve tıkaçlı aerosol bariyer uçlu mikropipet kullanarak, her tüpten pelleti dağıtmadan, süpernatantı dikkatlice ayırın ve kaldırın. Tüpler arasında pipet uçlarını değiştirin. 8. Her tüpe 200 µl Washing Solution 4 ekleyin. Kuvvetlice vorteksleyerek pelletin yıkanmasını sağlayın. Bütün tüpleri r/dk de. 60 sn. santrifüjleyin ve tıkaçlı aerosol bariyer uçlu mikropipet kullanarak, her tüpten pelleti dağıtmadan, süpernatantı dikkatlice ayırın ve kaldırın. Tüpler arasında pipet uçlarını değiştirin. 9. Bütün tüpleri kapakları açık halde 65 C 'de 5 dk. inkübe edin. 10. Pelleti, 50 µl RE-buffer'da (elüsyon hacmi 90 µl'ye kadar arttırılabilir) resüspanse edin 65 C 'de 5 dk. inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin.

9 11. Bütün tüpleri g'de 60 sn. santrifüjleyin. Süpernatant, amplifikasyon için hazır RNA/DNA içerir. Eğer amplifikasyon ekstraksiyon ile aynı gün gerçekleştirilmezse, işlenmiş numuneler 5 günden fazla olmamak koşulu ile 2-8 C'de muhafaza edilebilir veya 20 /-80 C'de dondurulabilir.

10 PROTOKOL 1. Numuneler ve kontroller için gereken miktarda reaksiyon tüplerini (veya PCR plate) hazırlayın. 2. Her numune için yeni bir steril tüpte 10*(N1) µl PCR-mix-1, 5*(N1) µl PCR Buffer Flu, 0,5*(N1) µl TaqF DNA Polymerase ve 0,5*(N1) µl UDG- Enzyme hazırlayın. Vorteksleyin ve kısaca santrifüjleyin. 3. Her tüpe 15 µl Reaction Mix ekleyin. 4. Uygun tüpe 10 µl ekstrakte DNA ekleyin. 5. Her panel için 2 kontrol hazırlayın: Amplifikasyon Negatif Kontrol etiketli tüpe, 10 µl DNA-buffer ekleyin; Amplifikasyon Pozitif Kontrol etiketli tüpe, 10 µl C MTB & IC ekleyin; 6. Tüpleri thermalcycler'a yerleştirin. Amplifikasyon 1. Enstrümanınızda 1 aşağıdaki gibi bir sıcaklık profili oluşturun: Evre Sıcaklık, С Süre Floresan Tespiti Cycle tekrarlar Bekle min - 1 me Cycling 65 sn sn sn sn. FAM(Green), Cycling JOE(Yellow) sn sn. 1 ÖrneğinSaCycler-96 (Sacace), Rotor-Gene 3000/6000/Q (Corbett Research, Qiagen), CFX96 TM /iq5 (BioRad); Mx3005P (Agilent), ABI 7300/7500/StepOne Real Time PCR (Applied Biosystems), SmartCycler (Cepheid), LineGeneK (Bioer) Floresan, 2.Cycling evresinde (60 C), FAM/Green ve JOE/Yellow/Hex/Cy3 floresan kanallarda tespit edilir.

11 ENSTRÜMAN AYARLARI Rotor-tip Enstrümanlar Calibrate/Gain Kanal Optimisation FAM/Green 5 FI ila 10 FI FI JOE/Yellow 4 FI ila 8 FI FI Eşik Çizgisi Diğer Ayarlar/ Outlier Removal Slope Correct 0,03 < %10 Açık 0,05 < %15 Kapalı Plate -tip enstrümanlar Eşik çizgisi, yalnız pozitif örneklerin sinyal birikiminin sigmoid eğrilerini geçmeli ve taban çizgisini geçmemelidir; aksi takdirde eşik çizgi seviyesi yükseltilmelidir. Eşik çizgisini, floresan eğrilerinin linear ve negatif numunelerin eğrilerinin geçmediği yerde ayarlayın. VERİ ANALİZLERİ Floresan sinyal yoğunluğu iki kanalda tespit edilir: Mycobacterium tuberculosis FAM tespit edilir. Sonuçların Yorumlanması (Green) kanalda, IC DNA JOE/Yellow/HEX/Cy3 kanalda Sonuçlar, eşik hattı ile floresan eğrinin geçiş varlığı sayesinde yorumlanır. Kontrol numuneleri için sonuçların analizi Analizin sonuçları, sadece Pozitif ve Negatif için elde edilen sonuçlar ise güvenilir olarak kabul edilir. Ekstraksiyon Negatif kontrolleri için olduğu gibi Amplifikasyon Kontrolleri doğrudur (Tablo 2). Tablo. Kontrol Sonuçları Kontrol Kontrol Evresi Ct kanal FAM/Green Ct kanal JOE/Yellow/HEX/ Cy3 Yorumlama NCE DNA Neg <36 Geçerli sonuç NCA ekstraksiyon Amplifikasyon Neg Neg Geçerli sonuç C Amplifikasyon <36 <34 Geçerli sonuç

12 Klinik numuneler için sonuçların analizi Tablo. Numune sonuçların analizi Ct değeri FAM (Green) Ct değeri JOE (Yellow)/HEX/Cy3 Geçerlilik Yorumlama / >38 Geçerli M.tuberculosis complex tespit edildi - 38 Geçerli M.tuberculosis complex tespit edilmedi / > 38 / > 38 Geçersiz Geçersiz (malzeme örneklemesi tekrarlanır) > Geçersiz Şüpheli-belirsiz (malzeme örneklemesi tekrarlanır) Sonuçlar FAM (Green) kanalda (Ct 38) pozitif ve JOE(Yellow)/HEX/Cy3 kanalda pozitif (Ct 38) veya negatif (Ct>38) ise sonuçlar geçerlidir, Mycobacterium tuberculosis DNA tespit edilmiştir. Sonuç FAM/Green kanalda negatif ve JOE(Yellow)/HEX/Cy3 kanalda (Ct 38) pozitif ise, sonuçlar geçerlidir,mycobacterium tuberculosis DNA tespit edilmemiştir. Sonuç, hem JOE(Yellow)/HEX/Cy3 hem de FAM/Green kanalda negatif ya da Сt>38 ise, sonuç geçersizdir. Amplifikasyonun tekrarlanması gerekir. Eğer sonuç aynı ise, DNA ekstraksiyonu tekrarlayın. Eğer sonuçlar yine aynı ise, geçersiz olarak kabul edilir. Bu gibi durumlarda, malzeme örneklemesinin tekrarlanması önerillir. Sonuç, FAM/Green kanalda Сt>38 ve JOE(Yellow)/HEX/Cy3 kanalda pozitif ise, sonuç geçersizdir. Amplifikasyonun tekrarlanması gerekir. Eğer sonuç aynı ise, DNA ekstraksiyonu tekrarlayın. Eğer sonuçlar yine aynı ise, geçersiz olarak şüpheli-belirsiz olarak kabul edilir. Bu gibi durumlarda, malzeme örneklemesinin tekrarlanması önerillir. Sonuç Örnekleri FAM/Green kanal : numuneler МТB DNA içerir. JOE/Yellow kanal : numuneler Internal Control içerir.

13 ANALİTİK KARAKTERİSTİKLER ANALİTİK ÖZGÜNLÜK Primerler ve probların analitik hassasiyeti, 110 Mycobacterium tuberculosis complex negatif numune ile doğrulanmıştır. Spesifik primerler ve problar ile herhangi bir sinyal oluşturmamışlardır. MTB Real-TM kitinin potansiyel çapraz reaktivitesi, aşağıdaki tabloda listelenen grup kontrollerine karşı test edilmiştir :. Bu ptojenler ile herhangi bir çapraz reaktivite gözlemlenmemiştir. Kontrol grup Sonuçlar Fam kanal Mycobacterium intracellulare - Mycobacterium flei - Mycobacterium scrofulaceum - Mycobacterium kansasii - Mycobacterium paratuberculosis - Mycobacterium fortuitum - Mycobacterium avium - Escherichia coli - Staphylococcus aureus - Streptococcus sp. - Clostridium diphtheriae - Brucella sp. - Сhlamydia trachomatis - Chlamydia pneumonie - Sonuçlar Joe/Hex/Cy3 kanal Analitik özgünlük, ayrıca Mycobacterium tuberculosis complex komtrol evrelerinin DNA amplifikasyonuyla doğrulanmıştır:. Mycobacterium tuberculosis strains 192, 5281, 1443, 328, 330, 932, 350, 1579, 1528, 1532, 352, 1030; Mycobacterium bovis strains 1, 2, 3, 4, 5, 8, BCG, 14, 1414, АN 5; Mycobacterium africanum; Mycobacterium microti,. DNA konsantrasyonu 10 5 genomic eşdeğer/ml. idi. MTB Real-TM kiti test edilirken Mycobacterium tuberculosis complex 'ine ait tüm suşlar ile pozitif sonuçlar vermektedir. ANALİTİK HASSASİYET MTB Real-TM kitinin analitik hassasyeti, Mycobacterium tuberculosis ve QCMD MTB Panellleri(2003, 2009, 2010) nin standart DNA seri dilüsyonu kullanılarak doğrulanmıştır. MTB Real-TM kitinin analitik hassasiyeti 5/CFU numune 'den daha düşük değildi. Hedef bölge: IS 6110

14 SORUN GİDERME 1. Ekstraksiyon Negatif Kontrol için, zayıf (Ct > 36) ya da olmayan IC (Joe/Hex/Cy3 kanal) sinyali. PCR inhibe edilmiştir. Önerilen DNA ekstraksiyon metodunu kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarını izlediğinizden emin olun. Bütün tüpleri ekstrakte DNA pipetlenmesinden önce 2 dk. maksimum ( g) hızda yeniden santrifüjleyin ve süpernatatntı dikkatlice alın. Pelleti dağıtmayın, sorbent reaksiyonu inhibe eder. Reaktif muhafaza koşulları talimatlara uygun değil. Muhafaza koşullarını kontrol edin. PCR koşulları talimatlara uygun değil. Protokolde belirtilen IC tespit floresan kanalını seçin ve PCR koşullarını kontrol edin. IC, reaktif pipetleme esnasında numuneye eklenmemiş. DNA ekstraksiyon prosedürü esnasında dikkatli olun. 2. Zayıf (Ct > 35) ya da olmayan Pozitif Kontrol sinyali. PCR koşulları talimatlara uygun değil. Manuelde belirtilen floresan kanalını seçin ve aplifikasyon prosedürünü kontrol edin. 3. Ekstaksiyon Negatif Kontrolü ile Fam (Green) sinyal. DNA ekstraksiyon prosedürü esnasında kontaminasyon. Tüm sonuçlar geçersizdir. Bütün yüzeyleri ve enstrümanları sodyum hipoklorid ve etanol ile dekontamine edin. Ekstraksiyon prosedürü esnasında sadece filtre pipet uçlarını kullanın. Tüpler arası pipet uçlarını değiştirin.. Yeni reaktif setleriyle DNA ekstraksiyonunu tekrarlayın. 4. PCR Negatif Kontrol (DNA-buffer) ile herhangi bir sinyal yok. PCR hazırlama prosedürü esnasında kontaminasyon. Tüm sonuçlar geçersizdir. Bütün yüzeyleri ve enstrümanları sodyum hipoklorid ve etanol veya özel DNA dekontaminasyon reaktifleri ile dekontamine edin.. Pozitif Kontrolü en son pipetleyin. Yeni reaktif setleriyle PCR hazırlamayı tekrarlayın.

15 KULLANILAN SEMBOLLERİN ANLAMLARI Liste Numarası Dikkat! Lot Numarası <n> testleri için yeterlilik içerir in Vitro Diagnostic için Kullanım Versiyon..'de muhafaza NCA Amplifikasyon Negatif Kontrol Üretici NCE Ekstraksiyon Negatif Kontrol Kullanım için talimatlara bakınız C Pozitif Kontrol Amplifikasyon Son Kullanım Tarihi IC Internal (iç) kontrol * SaCycler Sacace Biotechnologiestescilli markasıdır. * CFX and iq5 Bio-Rad Laboratories tescilli markasıdır. * Rotor-Gene Qiagen tescilli markasıdır. * MX3005P Agilent Technologies tescilli markasıdır. * ABI Applied Biosystems tescilli markasıdır. * LineGeneK Bioer tescilli markasıdır. * SmartCycler Cepheid tescilli markasıdır. Sacace Biotechnologies Srl via Scalabrini, Como Italy Tel Fax mail: info@sacace.com web: mail: info@sacace.com web: