INNO-LiPA HLA-A Update 100

Transkript

1 Anahtar Kod: FRI INNO-LiPA HLA-A Update v0 P 1/12 Türkçe INNO-LiPA HLA-A Update Üretici: Fujirebio Europe N.V. Technologiepark Gent Belçika BTW BE RPR Gent Distribütör: Fujirebio Almanya GmbH Hans-Böckler-Allee Hannover Almanya Fujirebio İtalya S.r.l. Via Vaccareccia 39/A Pomezia (Roma) Italya Fujirebio Iberya S.L. Calle Tarragona 161, Planta Barselona İspanya Fujirebio Europe N.V. Technologiepark Gent Belçika Fujirebio Fransa SARL Les Conquérants, Bât. Le Kilimandjaro 8/10, avenue des Tropiques Les Ulis Fransa Diğer diller için / Autres langues voir / Andere Sprachen siehe / Altre lingue vedere / Ver otros idiomas / Outras línguas ver: EUROPE GR IS LT RO SK TR LI MT non-europe US CA AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU :00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Europe N.V.

2 İÇİNDEKİLER Kullanılan semboller... 2 Kullanım amacı... 3 Test prensibi... 3 Reaktifler... 5 Açıklama, kullanım için hazırlık ve önerilen saklama koşulları... 5 Gerekli ama sağlanmayan materyaller... 6 Güvenlik ve çevre... 6 Numuneler... 7 Manipülasyon prosedürü... 7 Striplerin işlenmesi... 7 Manuel inkübasyon için talimatlar... 7 Küvet içindeki likitlerin manuel değiştirilmesi için talimatlar... 8 Açıklama ve uyarılar... 8 Manual test procedürü... 8 Örnekler... 8 Denatürasyon ve hibridizasyon... 9 Sıkı yıkama... 9 Renk gelişimi... 9 Otomatikleştirilmiş test prosedürü: Auto-LiPA ve Auto-LiPA Sonuçlar...10 Okuma Geçerlilik Sonuçların yorumlanması...11 Yorumlama yazılımı: LiRAS...11 Prosedürün kısıtlamaları...11 Test performansı...11 Doğruluk...11 Çözünürlük...12 Probe reaktivitesi...12 Hassasiyeti...12 Kesinlik...12 Ticari markalar...12 Kullanılan Semboller Üretici In Vitro Tanısal Medikal Yöntem Batch Kodu Katalog Numarası Kullanıcı Kullanım Talimatı

3 Sıcaklık Kısıtlamaları Konjugat 100x Konjugat Diluent Denatürasyon Çözeltisi Hibridizasyon Çözeltisi Durulama Çözeltisi 5x Sıkı Yıkama Çözeltisi Stripler 1 Stripler 2 Substrat BCIP/NBT 100x Substrat Tamponu Kullanım amacı INNO-LiPA HLA-A Update,in vitro kullanım için, insan lökosit antijen (HLA) allellerinin, allel grup seviyesinde, moleküler tiplemesini yapmak için tasarlanmıştır. Test prensibi INNO-LiPA HLA tipleme testi, şekil 1 de özetlenen ters hibridizasyon temeline dayanmaktadır. Amplifiye biotinlenmiş DNA materyali kimyasal olarak denatüre edilir ve ayrılan iplikler, membran temelli stripler üzerine paralel şekilde sabitlenmiş spesifik oligonükleotidler ile hibridize olur. Bu işlemi, yanlış eşleşmiş amplifiye materyalleri uzaklaştırmak için yapılan sıkı yıkama basamağı izler. Sıkı yıkamadan sonra alkalin fostatazlı streptavidin konjugat eklenir ve önceden şekillenmiş herhangi bir biotinlenmiş hibrite bağlanır. Kromojen içeren substrat çözeltisi ile inkübasyon mor/kahve rengi çökelti ile sonuçlanır. Reaksiyon yıkama basamağı ile durdurulur ve probların reaktivite örüntüsü kaydedilir. INNO-LiPA HLA-A Update ile biyotinlenmiş amplifiye materyalin standardize edilmiş hazırlığı için bir amplifikasyon kiti (INNO-LiPA HLA-A Multiplex) bulunmaktadır. Amplifikasyon kiti polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanmaktadır. Amplifikasyon ürünleri sonradan 43 sekans-spesifik probe çizgisi ve 2 kontrol çizgisi bulunan 2 tipleme stripi kullanılarak hibridize edilir (şekil 2).

4 Şekil 1: INNO-LiPA HLA tipleme test prosedürü. INNO-LiPA HLA-DQA1: basamakları Basamak 1 HLA-A lokusunun 1,2,3 ve 4. ekzonlarının multiplex amplifikasyonu. Basamak 2 İki INNO-LiPA HLA-A Update stribi üzerindeki 44 probun hibridizasyonu ve sıkı yıkanması (56 C). Basamak 3 Renk geliştirilmesi. Basamak 4 Prob reaktivite örüntüsünün yorumlanması. INNO-LiPA HLA-A Update, allellik seviyede (standart HLA isimlendirmesi izlendiğinde, bir allelin isminde yıldızdan sonraki ilk dört basamak demektir. Ör: HLA-A*26) ters hibridizasyon formatını kullanarak mümkün olan en iyi çözünürlüğü sağlamak için tasarlanmıştır. Allel gruplarının yorumlanmasına ek olarak, yazılım bütün olası allel kombinasyonlarını verecektir fakat bu bilgi ekstra sayılmalı ve karar aşamasında kullanılmamalıdır.

5 Reaktifler Açıklama, kullanıma hazırlık, önerilen saklama koşulları C de, açılmamış reaktifler ve kaplamalı test stripleri kitin son kullanma tarihine kadar kararlıdır. Reaktifleri dondurmayın. - Bütün reaktifler ve test striplerini içeren plastik tüp kullanılmadan yaklaşık 60 dakika önce oda sıcaklığına getirilmelidir (20-25 C) ve kullanıldıktan sonra derhal buz dolabına kaldırılmalıdır. - Kit bileşenlerinin fiziksel görünümündeki değişiklikler kararsızlık veya bozulma belirtisi olabilir. - Kit herhangi bir kontamine edici DNA kaynağından özellikle amplifiye DNA ürünlerinden ayrı saklanmalıdır. - Striplerin kullanımdan önce kıvrılmasını önlenmesi için plastik tüplerin yatay olarak saklanması önerilir. Her bir paket içeriği: İçerik Miktar Ref. Açıklama Stripler 1 5 x INNO-LiPA HLA-A Update için, koyu lacivert marker çizgili 100 strip 1 içerir. Stripler 2 5 x INNO-LiPA HLA-A Update için, turkuaz marker çizgili 100 strip 2 içerir. Denatürasyon Çözeltisi Hibridizasyon Çözeltisi Sıkı Yıkama Çözeltisi Konjugat Diluenti Konjugat 100x Substrat Tamp. Substrat BCIP/NBT 100x Durulama Çöz. 5x Okuma Kartı x 1 ml EDTA içeren alkalin çözeltisi. Kullanıldıktan sonra vialin kapağı derhal kapatılmalıdır, çözeltinin havaya uzun süre maruz kalması denatürasyon gücünde hızlı bir gerilemeye sebep olur. 2 x 355 ml % 0.5 lik sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren salin sodyum fosfat EDTA (SSPE) tamponu. Hibridizasyon Çözeltisi kullanılmadan önce en az 37 C ye getirilmelidir ve 56 C yi aşmamalıdır ( kullanımdan önce bütün kristaller çözünmüş olmalıdır). 4 x 470 ml % 0.1 SDS içeren SSPE tamponu. Sıkı Yıkama Çözeltisi kullanılmadan önce en az 37 C ye getirilmelidir ve 56 C yi aşmamalıdır ( kullanımdan önce bütün kristaller çözünmüş olmalıdır). 2 x 355 ml NaCl, Triton, protein stabilizörü ve koruyucu olarak %0.01 MIT/<% 0.1 CAA içeren fosfat tamponu. 2 x 3.5 ml Kullanmadan önce konjugat dilüentinde 1/100 oranında seyreltilecek, protein stabilizörleri ve koruyucular içeren tampon içinde alkalin fosfataz ile işaretlenmiş streptavidin. Manuel testte, her test küveti için 2 ml konjugat çalışma çözeltisi + 2 ml fazladan hazırlayın(konjugat Çalışma Çözeltisi, Sıkı Yıkama inkübsayonu sırasında hazırlanabilir). Auto-LİPA için fazlalık 10 ml olmalıdır. Konjugat çalışma tamponu oda sıcaklığında (20-25 C) karanlıkta korunduğu sürece 24 saat kararlıdır. 3 x 400 ml NaCl, MgCl2 ve korucuyu olarak %0.01 MIT/<% 0.1CAA içeren Tris tamponu. 2 x 3.5 ml Dimetilformamit (DMF) içinde 5-Bromo-4-kloro-3-indolil fosfat p-toluidin tuzu (BCIP) ve nitroblue tetrazolium (NBT), kullanımdan önce Substrat Tamponu içinde 1/100 seyreltilir. Manuel testte her test küveti için 2 ml Substrat Çalışma Çözeltisi hazırlanır + 2 ml fazladan( Substrat Çalışma Çözeltisi konjugat inkübasyonu sırasında hazırlanabilir). Auto-LİPA için fazladan 10 ml hazırlanır. Oda sıcaklığında (20-25 C) karanlıkta korunduğu sürece 24 saat kararlıdır. 2 x 355ml NaCl, Triton ve koruyucu olarak %0.05 MIT/%0.48 CAA içeren fosfat tamponu, kullanmadan önce distile veya deiyonize suda 1/5 (1 kısım + 4 kısım) oranında seyreltilir. Her test küveti için 8 ml Durulama Çalışma Çözeltisi hazırlanır + 10 ml fazladan. Auto-LiPA için her test küveti başına 12 ml hazırlanır ve +20 ml fazladan. Durulama Çalışma Çözeltisi 2-8 C de iki hafta kararlıdır. Pozitif probların belirlenmesi için.

6 Gereken ama sağlanmayan materyaller - INNO-LiPA HLA-A Multiplex - Çalkalayıcı platformlu su banyosu (80 rpm; eğimli kapaklı; sıcaklığı 56 C ± 0.5 C de ayarlanabilen). - Aspirasyon aparatları. - Kalibre edilmiş termometre. - Orbital, karşılıklı veya sallanan bir platform çalkalayıcı. Orbital çalkalayıcı için Öneriler: Dairesel hareket çapı 13 mm'ye eşit ya da daha üstün olması gerekmektedir. 13 mm dairesel hareket için tavsiye edilen hız 160 rpm dir. Karşılıklı çalkalayıcı için Öneriler: İleri geri hareket için önerilen hız dakikada 80 harekettir Sallanan bir platform çalkalayıcı için Öneriler: Sallama açısı sıvı dökülmemesi için 13 'yi geçmemelidir Önerilen hız 50 rpmdir. - Vorteks karıştırıcı veya eşdeğeri. - Dereceli silindir (10, 25, 50, ve 100 ml). - Distile veya deiyonize su. - Tek kullanımlık eldivenler. - Tek kullanımlık steril pipet uçları (tercihen pamuk filtreli). - Strip işleme için Forseps. - Ayarlanabilir pipetler 1-20 ul, ul ve ul. - Dağıtım multipipet (Eppendorf, isteğe bağlı). - Zamanlayıcı, 2 saat (± 1 dakika). Güvenlik ve çevre Tehlikeli olması muhtemel içerikler hakkında bilgi edinmek için lütfen Safety Data Sheet (SDS) e ve ürün etiketlerine başvurunuz. Son SDS versiyonu sitesinden bulunabilir. Tehlike, Denatürasyon Çözeltisi H314 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P310 P363 Uyarı, 2-Chloroacetamide içerir: Durulama Çözeltisi 5x H317 P261 P280 P333+P313 P363 P302+P352 Tehlike, N,N-Dimethylformamide ve 5,5'-diphenyl-3,3'-bis(4 nitrophenyl)-2,2'-(3,3'-dimethoxybiphenyl-4,4'-ylene)ditetrazolium dichloride içerir: Substrat BCIP/NBT 100x H312 H319 H332 H360D P201 P261 P280 P281 P305+P351+P338 P308+P313 Tehlike ifadeleri H312 H314 H317 H319 H332 H360D Önlem ifadeleri P201 P260 P261 P280 P281 P302+P352 P303+P361+P353 Cilde değmesi zararlıdır. Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına sebep olur. Alerjik deri reaksiyonuna neden olabilir. Ciddi göz tahrişine neden olur. Solunması halinde zararlıdır. Anne karnındaki bebeğe zarar verebilir. Kullanmadan önce özel talimatları edininiz. Duman / buhar / sprey teneffüs etmeyiniz. Duman / buhar / sprey solumaktan kaçınınız. Uygun koruyucu eldivenler/ koruyucu giysi/ göz koruyucu / yüz koruyucusu kullanın. Gerektiği gibi kişisel koruyucu ekipman kullanın. CİLDE DEĞMESİ HALİNDE: Sabun ve bol su ile yıkayın. CİLDE GELMESİ HALİNDE (ya da saça): Atın/ kirlenmiş olan giysilerinizi hemen çıkarınız. Su/duş ile cildi durulayın.

7 P305+P351+P338 P308+P313 P310 P333+P313 P363 GÖZE GELMESİ HALİNDE: Birkaç dakika iyice suyla durulayınız. Mevcut ve kolay ise kontak lensleri çıkarın. Durulamaya devam edin. Maruz kalmış veya ilgili ise: Tıbbi tavsiye / yardım alın. Hemen ZEHİR MERKEZİ veya doktora / hekime başvurun. Ciltte tahriş veya kızarıklık olursa: Tıbbi tavsiye / yardım alın. Tekrar kullanmadan önce kirlenmiş giysileri yıkayın. - Numuneler her zaman potansiyel bulaşıcı olarak ele alınmalıdır. Bu nedenle, tüm kan bileşenleri ve biyolojik maddeler potansiyel bulaşıcı olduğu kabul edilerek ele alınmalıdır. Sadece yeterince eğitimli personele test prosedürünü gerçekleştirmesi için izin verilmelidir- Bütün kan bileşenleri ve biyolojik materyaller, belirlenen güvenlik prosedürlerine uygun olarak imha edilmelidir. 121 C de en az 15 dakika otoklavlanmalıdır. Tek kullanımlık malzemeleri yakın. Nihai konsantrasyon ±% 1 sodyum hipoklorit olacak şekilde sodyum hipoklorit ile sıvı atık karıştırılır. Atmadan önce bir gecede bekletin. Dikkat: Sodyum hipoklorit eklemeden önce asit içeren sıvı atıkların nötralize edilmesi gerekir. - Kişisel koruyucu ekipman kullanımı gereklidir: tehlikeli veya bulaşıcı ajanlar işlenirken eldiven ve koruyucu gözlük - Atık kurumun atık kurallarına göre ele alınmalıdır. Tüm federal, eyalet ve yerel çevre düzenlemeleri de dikkate alınmalıdır. Numuneler INNO-LiPA HLA-A testi biotinlenmiş amplifiye DNA materyalini kullandığından kit INNO-LiPA HLA-A Multiplex amplifikasyon kiti beraberinde kullanılabilir. Manipülasyon Prosedürü Strip kullanımı - Stripler tek kullanımlıktır! - Striplere çıplak elle dokunmayın, temiz forcep kullanın. - Test striplerinin tanımlaması için kurşun kalem kullanın. Tükenmez kalem vs kullanmayın. Kimliği striplerin üzerindeki marker çizgisinin yukarısına yazın. - Farklı inkübasyon aşaması boyunca, test şeritleri hep aynı çukur içinde kalmalıdır. - Kullanılmayan veya gelişmiş şeritler yoğun ışık ve ısı kaynaklarından uzak tutulmalıdır. - Geliştirilen şeritlerin sarılmadan, depolanmadan ve yorumlanmadan önce tamamen kurumasını bekleyin. - Renklendirilen kuru şeritler C'de tercihen karanlıkta saklanmalıdır. - Tekneleri tekrar kullanmayın. Manuel inkübasyon için talimatlar - Hibridizasyon ve sıkı yıkama basamakları esnasında 56 C ± 0.5 C'de inkübasyon, yalancı (sıcaklık çok düşük) pozitif veya yalancı negatif / çok zayıf sinyallerden (sıcaklık çok yüksek) kaçınmak için en kritik basamaktır. Eğimli kapaklı bir çalkalamalı su banyosu sıcaklık değişimleri üzerinde iyi bir kontrol sağlar. Kalibrasyonlu bir termometre ile sıkı bir sıcaklık kontrolü gereklidir. - Yalancı pozitif sinyalleri önlemek için inkübasyonlar sırasında su banyosunun kapağını her zaman kapalı tutun. - Hibridizasyon ve sıkı yıkama için sıcak hava çalkalayıcısı kullanmayın. - Hibridizasyon ve sıkı yıkama için, tüp kabı su banyosunda çalkalayıcı platformun üzerine konulmalıdır. Su seviyesini küvetlerin üçte birine veya yarısına gelecek şekilde ayarlayın. Küvetin su üzerinde yüzdüğünden emin olun. Su küvetler ile doğrudan temas halinde olmalıdır. - Renk gelişimi için inkübasyon basamakları 20 ila 25 C arasında olmalıdır. Sıcaklık 20 C altında ise, zayıf sonuçlar elde edilebilir. Sıcaklık 25 C'nin üzerinde olursa yüksek bir arka plan ve / ya da yalancı pozitif sinyaller elde edilebilir. - Her zaman prosedürde belirtilen süre kadar inkübasyon yapın

8 - Çalkalamalı su banyosu (hibridizasyon ve sıkı yıkama prosedürü) ve çalkalayıcı (renk geliştirme prosedürü) tarafından üretilen hareket genliği maksimum hassasiyet ve homojen boyama için kritiktir. Strip yüzeyi tamamen daldırılmış olmalıdır. Genlik mümkün olduğu kadar yüksek olmalıdır. Bununla birlikte, çukurların kenarları boyunca sıvı dökülmesinden kaçınılmalıdır! Bu çapraz kontaminasyon ve geçersiz sonuca yol açabilir. - Striplerin inkübasyonu sırasında çalkalanması, sıvı çukurların kenarlarından dökülmeden, hem test striplerinin hem sıvının küvet içinde ileri ve geri hareket etmesi şekilde yapılmalıdır. - Tepsileri örtmeyin. Sıkı yıkama ve hibridizasyon inkübasyonu sırasında, küvetler su banyosu içinde sarılmadan bırakılabilir. Mikroplate kapağı ile küvetlerin kaplanması çapraz kontaminasyona neden olabilir. Küvetlerdeki sıvıyı manuel olarak değiştirmek için talimatlar - Sıvı tercihen bir vakum aspiratörüne bağlı bir pipet ile küvetlerden aspire edilir. Tepsi tüm sıvının küvetin bir ucuna akmasına izin veren bir açıya getirilir. - Her küvete uygun çözeltiden 2 ml ekleyin ve protokol izleyin. Bir multipipet (Eppendorf) bu amaç için yararlıdır. - Bu basamakları test prosedüründe belirtildiği kadar tekrarlayın. - Striplerin iki basamak arasında kurumasına izin vermeyin. - Sıvıları aspire ederken striplerin yüzeyine zarar vermemeye dikkat edin. - Sıvıyı, stripin üst kısmından marker hattına kadar aspire edin. - Tüm sıvı aspire olduğundan emin olun. - Bütün stribin sıvının içine iyice batarak yıkandığından emin olun. - Gerektiğinde çalkalayıcının hızını uyarlayın. Açıklama ve önlemler - Sadece in vitro kullanım için. - Sadece profesyonel kullanım için. - DNA kontaminasyonundan kaçınmak için pre ve post amplifikasyon basamakları arasında maksimum fiziksel ayırım önerilmektedir; ayrı odalar, ayrı pipetler ve diğer laboratuvar malzemeleri, ayrı laboratuvar önlükleri ve eldivenler (ve stokları) iyi laboratuvar uygulamaları için alınabilecek minumum tedbirlerdir. - Post amplifikasyon odasından pre amplifikasyon odasına herhangi bir dönüşten kaçının. - Otoklavlanmış tek kullanımlık laboratuar malzemesi kullanılması tavsiye edilir. - Tek kullanımlık laboratuar malzemelerini tekrar kullanmayın. - Her porsiyonlanmış numune için yeni bir steril pipet ucu kullanın - Son kullanma tarihinden sonra reaktifleri kullanmayın. - Bileşenleri aynı lot numarasına sahip olmadığı sürece, farklı kitlerin reaktiflerini karıştırmayın. - Reaktiflerin mikrobiyal kirlenmesinden kaçının. Manuel test prosedürü - Farklı inkübasyon basamakları boyunca stripler hep aynı küvet içinde kalmalıdır. İnkübasyon öncesinde kalibre edilmiş bir termometre kullanarak su banyosunun sıcaklığını kontrol edin ve gerekliyse sıcaklığı tepsiyi su banyosuna yerleştirmeden önce ayarlayın. Kapağı her zaman kapalı tutun. Örnekler 1. HLA-A amplifiye ürünleri (10 µl kullanın). Örnek hazırlığı için: INNO-LiPA HLA-A Multiplex kullanım talimatlarına bakın. Tam olarak 10 µl amplifiye örnek eklendiğinden emin olun. Gereğinden fazla veya az örnek yanlış tiplemeye sebep olabilir. 2. Boş amplifiye kontrol örneği (Negatif Kotrol; 10 µl su kullanın).

9 Denatürasyon ve hibridizasyon 1. Çalkalayıcılı su banyosunu 56 C ± 0.5 C ye ısıtın. Sıcaklığı kalibre edilmiş bir termometre ile kontrol edin ve eğer gerekirse ayarlayın. Belirtilen sıcaklığı aşmayın. Hibridizasyon Çözeltisi ve Sıkı Yıkama Çözeltisini kullanmadan önce en az 37 C ye ayarlanmış su banyosunda ısıtın, su banyosu sıcaklığı 56 C yi geçmemelidir. Kullanmadan önce karıştırın. Bütün kristaller çözünmüş olmalıdır. 2. Forsep kullanarak tüpten gerekli miktarda INNO-LiPA HLA-A Stribi alın (bir test örneği için bir strip1 ve bir strip) Kör amplifiye kontrol örneği içinde bir strip ekleyin. Stribe Prusya mavisi / turkuaz marker çizgisinin üzerinde kalan bölgeye kurşun kalem ile bir kimlik numarası yazın. 3. Gerekli sayıda test küveti alın ve tepsiye yerleştirin ( her strip için bir küvet). 4. Her küvetin üst köşesinden 10 µl Denatürasyon Çözeltisi ekleyin. Kullandıktan sonra viallerin kapağını derhal kapatın µl örnek (Örneklere bakın; INNO-LiPA HLA-A Multiplex in kullanma talimatına bakın) ekleyin ve pipet ile dikkatlice çekip bırakarak karıştırın. Her zaman steril pipet ucu kullanın. Denatürasyonun gerçekleşmesi için C de 5 dakika bekletin. 6. Önceden ısıtılmış Hibridizasyon Çözeltisini çalkalayın ve her küvetteki denatüre olmuş amplifiye ürüne 2 ml ekleyin, yavaşça çalkalayın. Pipetleme sırasında komu küvetleri kontamine etmemeye özen gösterin. 7. Stripleri derhal kuyulara yerleştirin. Stripler çözeltiye tamamen batmalıdır. Tek kullanımlık eldiven giyin, forsep kullanın. 8. Tepsiyi 56 C ± 0.5 C deki çalkalayıcılı su banyosuna yerleştirin (80 rpm; Manuel inkübasyon için talimatlara bakın), kapağını kapatın 30 dakika inkübasyona bırakın. Su banyosundan küvetlere su sıçramasından kaçının. Su seviyesini küvetlerin üçte birine veya yarısına gelecek şekilde ayarlayın. Tepsinin kaymasını engellemek için iki ağırlık arasında sabitleyin. Sıkı yıkama 1. Hibridizasyonun ardından tepsiyi su banyosundan kaldırın. 2. Tepsiyi düşük bir açı ile tutun ve küvetlerdeki sıvıyı tercihen vakum aspiratörüne bağlı bir pipet ile aspire edin. Her küvete 2 ml önceden ısıtılmış Sıkı Yıkama Çözeltisi ekleyin ve tepsiyi 56 C± 0.5 C deki çalkalayıcılı su banyosuna yerleştirin, kapağı kapatın ve 3 dakika boyunca inkübe edin. 3. İnkübasyondan sonra tepsiyi su banyosundan çıkarın ve küvetlerdeki sıvıyı aspire edin dakikalık inkübasyon ve aspirasyon basamağını bir kere daha tekrarlayın. 5. Her küvete en az 2 ml önceden ısıtılmış Sıkı Yıkama Çözeltisi ekleyin ve tepsiyi 56 C± 0.5 C deki çalkalayıcılı su banyosuna yerleştirin, kapağı kapatın ve 4 dakika boyunca inkübe edin. Konsantre haldeki Durulama Çözeltisi 5x ve Konjugat 100x i sıkı yıkama basamağı sırasında dilüe edin. Reaktiflere bakın. Renk gelişimi Sonraki bütün inkübasyonlar çalkalayıcıda C de gerçekleştirilir. İnkübasyonlar sırasında küvetlerdeki sıvı ve stripler homojen bir boyama için ileri geri hareket etmelidir. 1. Her bir stribi iki kez 2 ml Durulama Çalışma Çözeltisi ekleyerek 1 dakika boyunca yıkayın.( Küvetlerdeki sıvıların manuel boşaltılması için talimatlara bakın). 2. Her küvete 2 ml Konjügat Çalışma Çözeltisi ekleyin ve tepsiyi çalkalayıcının üzerine yerleştirip 30 dakika boyunca inkübe edin. Konjugat inkübasyonunun bitmesine yaklaşık on dakika kala Substrat BCIP/NBT 100x Çözeltisini dilüe edin. Reaktiflere bakın. 3. Bütün stripleri Durulama Çalışma Çözeltisi kullanarak iki defa 1 dakika boyunca yıkayın ve 2 ml Substrat Tamponu kullanarak bir kez daha yıkayın. 4. Bütün küvetlere 2 ml Substrat Çalışma Çözeltisi ekleyin, tepsiyi çalkalayıcıya yerleştirin ve 30 dakika boyunca inkübasyona bırakın.

10 DİKKAT: Eldiven ve koruyucu gözlük giyin. 5. Renk gelişimini stripleri distile su ile iki defa yıkayarak durdurun. Yıkama sırasında tepsiyi en az 3 dakika boyunca çalkalayıcıya yerleştirin. 6. Forsep kullanarak, stripleri küvetlerden çıkarın ve absorban kâğıt üzerine koyun. Sonuçları okumadan önce stripleri tamamen kurutun. Renklenmiş stripleri karanlıkta saklayın. Otomatikleştirilmiş test prosedürü: Auto-LiPA LİPA test prosedürü otomasyon için son derece uygundur. Bu sebeple, Auto-LiPA, hibridizasyon, sıkı yıkama ve renk gelişimi basamaklarını tamamen ele almak için tasarlanmıştır. Auto-LiPA otomatik ısıtma ve soğutma ve otomatik aspirasyon ve pipetleme ile öne çıkan bir walk-away sistemdir. Standart Auto-LiPA 48 protokolü her küvet için bir strip kullanıldığında 24 örneğe kadar çıkıldığını açıklar. Bununla birlikte bu sayı maksimum 48 e kadar arttırılabilir. Çalışılacak örnek sayısı, diğer bütün protokol parametreleri aynı tutulurken, aynı lokustan iki stribin aynı küvet içerisinde tutulması ile arttırılır. Nadiren de olsa zayıf prob reaktiviteleri gözlenebilir. Çalışılacak örneği bu yöntemle arttırmak isteyen kullanıcıya, yöntemi kendi laboratuarlarında doğrulamaları önerilir. Auto-LiPA için daha fazla bilgi ve spesifik protokoller için lütfen Fujirebio Europe N.V. veya yerel distribitörünüzle temasa geçin. Sonuçlar Okuma Şekil 1, INNO- LiPA HLA-A striplerindeki farklı oligonükleotid problarının pozisyonlarını göstermektedir. Bir çizgi, test prosedürünün sonunda net bir mor/kahverengi bant belirdiğinde Pozitif kabul edilir. Şekil 2: Marker çizgilerinin yerleşimi (Strip 1 de koyu lacivert çizgi Strip 2 de turkuaz çizgi), Konjugat Kontrol çizgisi (conj. control), HLA-A Update Kontrol çizgisi (HLA-A kontrol), INNO-LiPA HLA-A Update Stripleri üzerindeki 44 probe çizgisi. Geçerlilik - Her amplifikasyon çalışmasına bir negatif kontrol eklenmelidir. Herhangi bir yeni laboratuar prosedüründe test prosedürünün doğru bir şekilde uygulanabileceğine dair yüksek derecede güven gelişene kadar pozitif ve negatif kontrolün varlığı dikkate alınmalıdır. Test koşullarının uygunluğunun gösterilmesi için referans DNA kullanılması önerilmektedir. - INNO-LiPA HLA-A Update striplerinde (Şekil 2) en üstteki çizgiler marker çizgileridir. (Koyu lacivert ve turkuaz çizgiler). Bu çizgiler stribin doğru yönlendirilmesini sağlar.

11 - Sonraki çizgi tespit prosedürü sırasında konjügat ve substrat reaktiftiflerinin eklenip eklenmediğini kontrol eder. Bu çizgi plastik okuma kartındaki Konjugat Kontrol çizgisi ile yanyana gelmelidir ( aksi durumda yorumlama yapılmamalıdır!). Bu, hat her zaman pozitif olmalı ve yaklaşık olarak aynı test çalışmasında her bir strip üzerinde aynı yoğunluğa sahip olmalıdır. - Bir sonraki çizgi, hibridizasyon için uygun miktarda HLA-A amplifiye materyalin eklenip eklenmediğini kontrol eden HLA-A Update iç Hibridizasyon Kontrol çizgisidir (HLA-A Kontrol, okuma kartında). Bu çizgi, Negatif Kontrol hariç, her zaman pozitif olmalıdır ama yoğunluk örnekler arasında farklılık gösterebilir. - Hiç bir Negatif Kontrol tahlil sonucu konjugat kontrol hattı dışında, strip çizgilerinden herhangi biri için belirgin bir sinyal vermemelidir. - Bir stripte probların renklerindeki yoğunluk bir çizgiden diğerine değişiklik gösterebilir. Sonuçların yorumlanması - Stribin üzerindeki Konjugat Kontrol çizgisi ile plastik kartın üzerindeki Konjugat Kontrol çizgisi yanyana gelmelidir. - Her bir özgün stribin geçerlliğini göstermek için (Geçerliliğe bakın) öncelikle kontrol çizgilerinin pozitifliğini kontrol edin ( ilk üç çizgi: Konjugat Kontrol, HLA-DQA1 Kontrol ve 2). - Tipleme sonuçları, kitteki probların reaktivitesine dayanır. Prob özgüllükleri listesi mevcuttur. - INNO-LiPA HLA-A Update stribindeki bütün pozitif prob numaralarını belirleyin ve INNO-LiPA HLA-A Update tipleme tablosunu kullanarak veya LİPA yorumlama yazılımına verileri girerek HLA-DQA1 tiplerini sonuçlandırın (Yorumlama yazılımı: LiRAS bakın). Test bu allelleri, allelik seviyede spesifik olarak tiplemek üzerine tasarlanmadığından, bu bilgiler ekstra sayılmalı ve karar aşamasında kullanılmamalıdır. Yorumlama yazılımı: LiRAS INNO-LiPA HLA için LiRAS yazılımı LİPA sonuçlarının yorumlanmasını desteklemek için tasarlanmıştır. Son yükseltilmiş versiyon için lütfen yerel distribütörünüzle temasa geçiniz. Prosedürün kısıtlamaları - Bu ürünün kullanımı hibridizasyon teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. - Sadece iyi laboratuvar uygulamaları ve belirtilen prosedürlerin dikkatli uygulanması spesifik hibridizasyon ve hedef DNA'nın doğru tiplenmesini sağlar. - INNO-LiPA HLA-A Update stripleri allel grup seviyesinde çözünürlük vermek üzere tasarlanmıştır. Yine de, belirli allel grupları kombinasyonu benzersiz olmayan probe kombinasyonlarına yol açabilmektedir ve bu yüzden iki ya da daha fazla olası allelik grup kombinasyonlarının belirsiz bir cevaba sebep verir. - Yeni allellerin prob bölgeleri dışında polimorfizmleri olabilir, sonuçları yorumlarken bu dikkate alınmalıdır. - HLA-A Update Kontrol çizgileri sadece HLA-A için spesifik değildir, ayrıca HLA-B ve HLA-C alelleri için onuç verebilir. Bu nedenle HLA-A Kontrol çizgileri HLA-B ve HLA-C amplifiye ürünleri ile de reaksiyona girebilir. Test performansı INNO-LiPA HLA-A Multiplex testinin performansı 4 Avrupa doku tipleme bankasının rutin tipleme örnekleri ile değerlendirilmiştir. Toplamda 346 örnek analiz edilmiştir. DNA, taze veya EDTA lı veya sitrat lı kandan ekstrakte edilmiştir. DNA ekstraksiyon yöntemleri salting out, QIAamp 96 DNA blood kit (Qiagen), Genomic DNA Purification kit (Promega) ve Puregene (Gentra Systems) dir. Taze veya dondurulmuş DNA GeneAmp PCR Sistem PE-9600 veya PE-9700 termal cycler kullanılarak amplifiye edilmiştir. Amplikonlar striplere eklenmeden önce 2-8 C veya -25/-15 C de saklanmıştır. 1 örnek için tekrar testine gerek duyulsa da amplikasyonlarda başarısızlığa rastlanmamıştır. Örnekler Auto-LiPA cihazlar kullanılarak ve the LiRAS yorumlama yazılımının klinik deneme sürümü kullanılarak yorumlanmıştır. Doğruluk 346 örnekten 345 i için HLA-A tipleme sonucu elde edilmiştir. Bir merkezde 18 örnek için tekrar testi gerekmiştir. Bir örnek 'no typing deducible' ile sonlanmıştır fakat araştırmacıya göre bu DNA kontaminasyonu sebebiyledir. Allel grubu düzeyinde doğruluk alternatif DNA testleri ile gözlenen uyum yüzdesi olarak hesaplanmıştır (Biotest ELPHA HLA-AB LowRes Typing kit, Dynal SSP, LiPA HLA-A, sequencing, Micro SSP, OLERUP SSP, Biotest HLA-A SSP). INNO-LiPA HLA-A Update sonuçları referans test sonuçları ile uyumlu kabul edilebilirdi eğer, iki sonuç aynı olsaydı, eğer INNO-LiPA HLA-A Update sonuçları referans yöntemden daha spesifik olsaydı veya eğer INNO- LiPA HLA-A Update sonuçları karşılaştıram yöntemine nazaran daha düşük bir çözünürlük fakat doğru sonuçları verseydi. İç doğruluk %99.1(342/345) idi.

12 Çelişki testi % 99.7 (344/345) bir doğruluk ile sonuçlandı. Çalışma sırasında bir örnekte oluşan yanlış tiplemenin gelecekte görülmemesi için gereken önlemler alındı. Çözünürlük (tipleme tablosu sürüm v1.0/ ) INNO-LiPA HLA-A Update HLA-A allellerini allellik grup seviyesinde aydınlatmak için tasarlanmıştır, örneğin: serolojik eşdeğeri düzeyinde. Allel grubu standart HLA isimlendirmesinde (örneğin HLA A * 32) yıldız işaretini takip eden ilk iki basamaktır. Ayrıca kit, şu sessiz allelleri tespit etmek için de tasarlanmıştır; A*0232N (ekzon 3), A*0303N (ekzon 3), A*2409N (ekzon 4), A*2611N (ekzon 3) ve A*6811N (ekzon 1). Düşük bir ifade seviyesine sahip olan A* L alleli de tespit edilebilir (intron2). Allel grup seviyesindeki teorik çözünürlük ( 2 basamak) % 99.5 olarak hesaplanmıştır. Bu çalışma sırasında gözlenen allel grubu düzeyinde çözünürlük, tutarsızlık analizleri sonucunda, % 99.4 (343/345) idi. Başlangıçta, bir belirsizlik gözlenmiştir (A*02 x A*66 or A*02 x A*26). Sonuçların tipleme tablosuna adaptasyonunda ikinci bir belirsizlik gözlenmiştir (A*3201 x A*3201 or A*3201 x A*7403). Referans yöntemi ile gözlenen 5 belirsizlik (14 Örnek'in) INNO-Lipa HLA-A Update testi kullanılarak tek bir kesin sonucu düşürüldü. Bu klinik değerlendirme boyunca iki sessiz allel gözlendi: A*0303N ve A*6811N. Prob reaktivitesi Klinik deneme boyunca bir veya daha fazla durumda on prob yalancı pozitif ve altı prob zayıf yalancı negatif sonuç vermiştir. Bu bilgi, henüz mevcut değil ise, gelecek tiplemelere yardımcı olmak için yazılıma ve/veya rehbere eklenmiştir. Biri hariç bütün yalancı reaktivitelerin, allel grup seviyesinde uyumlu tiplenmesi LiRAS yorumlama yazılımı kullanılarak başarılmıştır. Yalancı negatif reaksiyonunun sebep olduğu yanlış tipleme riski tipleme tablosuyla adapte edilerek ele alınmıştır. Probe reaktivitesi üzerine spesifik bilgi için rehbere başvurun. Prob ve primer özgüllükleri tam bir listesi mevcuttur. Tüm problar liste içinde, aksi belirtilmedikçe, bir uyumsuzluk seviyesinde tamamlayıcı sekansı ile spesifik olarak melezleşmesi şekilde tasarlanmıştır. Hassasiyet 3 DNA örneğinin 0.01 µg/µl ile 2 µg/µl arasında değişen dilüe serisinin iç değerlendirmesi göstermiştir ki, bütün örnekler agaroz jelde görünürdür ve doğru tiplenmiştir. Harici performans, konsantrasyonları 20 ve 1500 ng/µl arasında, saflığı (A260nm/A280nm) 1.5 olan 346 DNA örneği kullanılarak değerlendirilmiştir. DNA, amplifikasyon öncesi 20 ng/µl ve 250 ng/µl konsantrasyonları arasında dilüe edilmiştir. Bir merkezde bir örneğin tekrar testine ihtiyaç duymasına rağmen, amplifikasyonda başarısızlığa rastlanmamıştır. Kesinlik İç veri: 3 örnek 3 kere olmak üzere 2 farklı kullanıcı tarafından manuel yöntem kullanılarak veya bir kullanıcı ve iki farklı Auto-LİPA cihazı kullanılarak test edilmiştir. 2 örnek 3 farklı lotta 2 farklı çalışmada analiz edilmiştir. Sonuçların yorumlanması bütün örnekler için aynıdır. Prob reaktivitesi bütün durumlarda karşılaştırılabilirdir. Dış veri: - Lotlar arası değişkenlik ürünün iki farklı grubun yeterlilik paneli (bilinen reaktivite ve yorumlanması ile 5 numune) analizi ile değerlendirildi. Her bir numune için kullanılan gruptan bağımsız olarak aynı tipleme sonucu elde edildi. - Laboratuarlar arası değişkenlik aynı yeterlilik paneli kullanılarak dört farklı merkezde değerlendirildi. Her merkez beş örnek için aynı tiplemeyi elde etti. Ticari markalar - INNO-LiPA ABD de olduğu gibi dünya çapında bir markadır. - LiPA Benelüks'te tescilli markadır ve dünyanın geri kalanında markadır (ABD dahil). - LİRAS Avrupa da tescilli markadır ve dünyanın geri kalanında markadır (ABD dahil). - Auto-LiPA ABD de olduğu gibi dünya çapında bir markadır. - GeneAmp Roche Diagnostics GmbH ın tescilli markasıdır ve GeneAmp Applera Corp U.S. de tescilli markadır. - QIAMP ve Purigene QIAGEN Grubun tescilli markalarıdır.