INNO-LiPA HLA-B Update Plus

Transkript

1 INNO-LiPA HLA-B Update Plus KOD: FRI INNO-LiPA HLA-B Update Plus v p 1/17 Türkçe Üretici: Fujirebio Europe N.V. Technologiepark Gent Belgium Tel BTW BE RPR Gent Dağıtıcı: Fujirebio Europe N.V. Tel Fax customer.support@fujirebio-europe.com Fujirebio Germany GmbH Tel Fax germany@fujirebio-europe.com Fujirebio France SARL Tel Fax france@fujirebio-europe.com 0459 Fujirebio Italia S.r.l. Tel Fax italy@fujirebio-europe.com Fujirebio Iberia S.L. Tel Fax spain@fujirebio-europe.com Vurgulanan değişiklikleri not edin. AVRUPA GR IS LT RO SK TR LI MT EE AVRUPA-dışı US CA AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU :00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Europe N.V

2 80634 INNO-LiPA HLA-B Update Plus / v5 / KOD:FRI41618 p 2/17 İÇİNDEKİLER Kullanım amacı... 3 Test prensibi... 3 Reaktifler... 4 Açıklama, kullanıma hazırlık ve önerilen saklama koşulları Gerekli ama sağlanmayan malzemeler... 5 Güvenlik ve Çevre Koşulları... 6 Örnekler... 7 Manipülasyon prosedürleri... 7 Strip kullanımı... 7 Manuel inkübasyon talimatları... 8 Oluklarının içindeki sıvının manuel değişimi için talimatlar... 8 Uyarılar ve önlemler... 9 Manual test prosedürü... 9 Numuneler... 9 Denatürasyon ve hibridizasyon... 9 Stringent wash Renk gelişimi Otomatik test prosedürü: Sonuçlar Okuma Onaylama Sonuçların Yorumlanması Yorumlama yazılımı: LiRAS Prosedür sınırlamaları Test performansı HLA-B Multiplex primer solution ile amplifiye edilen DNA kullanımıyla testin performansı HLA-Bw4 primer solution ile amplifiye edilen DNA kullanılan testin performansı Lisanslar Ticari markalar Kullanılan Semboller Üretici In vitro diagnostik medikal ürün Parti kodu Katalog numarası Tarafından kullanım Kullanım talimatlarına bakın Sıcaklık sınırlaması <n> testleri için yeterli içerik Conjugate 100x Conjugate diluent Denaturation solution

3 80634 INNO-LiPA HLA-B Update Plus / v5 / KOD:FRI41618 p 3/17 Kullanım amacı Hybridization solution Rinse solution 5x Stringent wash solution Strips 1 Strips 2 Substrate BCIP/NBT 100x Substrate buffer Tehlike Uyarı Line Probe Assay INNO-LiPA HLA-B Update Plus, allel grup seviyesinde insan lökosit antijeni (HLA) B allellerinin moleküler tiplendirmesi için tasarlanmış, in vitro kullanım amaçlı bir line probe assay dir. Test prensibi INNO-LiPA HLA tiplendirme testi, ters hibridizasyon temeline dayanmaktadır. Amplifiye biotinlenmiş DNA materyali kimyasal olarak denatüre edilir ve ayrılan iplikçikler, membran bazlı stripler üzerine paralel çizgiler halinde sabitlenmiş spesifik oligonükleotidler ile hibridize olur. Bu işlemi, uyuşmayan amplifiye materyalleri uzaklaştırmak için yapılan stringent wash adımı takip eder. Stringent wash'tan sonra, alkalin fosfataz ile konjüge edilmiş streptavidin eklenir ve daha önceden oluşan herhangi bir biyotinilize hibrid'e bağlanır. Kromojen içeren substrat çözeltisi ile inkübasyon mor/kahverengi renkli bir çökelti ile sonuçlanır. Reaksiyon yıkama adımı ile durdurulur ve probların reaktivite şablonu kaydedilir. INNO-LiPA HLA-B Update Plus ile birlikte ayrıca, biyotinlenmiş amplifiye materyalin standartlaştırılmış preparatı için bir amplifikasyon kiti de (INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus) mevcuttur. Bu amplifikasyon kiti polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) esasına dayanmaktadır. Amplifikasyon ürünleri daha sonra 66 sekans-spesifik prob çizgileriı ve 2 adet sabitlenmiş kontrol çizgisinde, 2 tiplendirme stribi kullanılarak hibridize edilir(şekil 1). INNO-LiPA HLA-B Update Plus: ilgili adımlar 1. adım HLA-B allelerinin 2-4 ekzonlarının multiplex amplifikasyonu. 2. adım İki INNO-LiPA HLA-B Update Plus stribinde imbolize 66 probla hibridizasyon ve stringent yıkama (56 C). 3. adım Renk gelişimi 4. adım Prob reaktivite şablonunun yorumlanması 5. adım Gerekirse, daha ileri amplifikasyon ve hibridizasyon adımı için LiRAS yorumlama yazılımı tavsiye edilir.

4 80634 INNO-LiPA HLA-B Update Plus / v5 / KOD:FRI41618 p 4/17 Bw4 / Bw6 alleli içeren belirsizlikler varsa, INNO-LiPA HLA-B Update Plus kitini kullanarak, (a) ile başlayıp (b) 'ye geçilmesi önerilir. BU, LiRAS Interpretation Software tarafından önerilecektir. (a) INNO-LiPA HLA-B Update Plus stripleri 1 ve 2 ile analiz edilmeden önce, önce HLA-B allellerinin 2, 3 ve 4. Ekzonlarının HLA-B Multiplex primer solüsyonu ile amplifikasyonu (b) -(b) INNO-LiPA HLA-B Update Plus strip 1 ile analiz edilmeden önce,önce HLA- Bw4allelinin 2. ekzonunun HLA- Bw4 primer solüsyonu ile grup-spesifik amplifikasyonu. Sağlanan HLA-Bw4 primer solüsyonu, HLA- Bw4 allellerinin ekzon 2 sini amplifiye eder. B*4411, B*4703 ve B*5708 allelleri hariç diğer HLA-B allellerinin 2. ekzonları amplifiye olmayacaktır IINNO-LiPA HLA-B Update Plus allel grup seviyesinde (standart HLA terminolojisi izlendiğinde allel ismindeki, yıldızdan sonraki ilk iki hane, HLA-B*07) ters hibridizasyon testi formatını kullanarak olası en iyi çözünürlüğü vermek üzere tasarlanmıştır. Allel gruplarının yorumlanmasına ek olarak, yazılım bütün olası allel kombinasyonlarını verecektir. Bu bilgi, belirleyici değildir, ek bilgi olarak kabul edilmelidir. Reaktifler Açıklama, kullanıma hazırlık ve önerilen saklama koşulları /-15 C de ve kendi orijinal şişelerinde tutulduğu sürece ( açılmış veya açılmamış), reaktifler kitin son kullanma tarihine kadar stabildir. Reaktifleri dondurmayın. Reaktifleri, son kullanma tarihlerinden sonra kullanmayın. - Kit herhangi bir kontamine DNA kaynağından, özellikle de amplifiye ürünlerinden ayrı saklanmalıdır. - Tüm reaktifler kullanımdan yaklaşık 60 dakika önce oda sıcaklığına (20-25 C) getirilmeli ve kullanımdan hemen sonra buzdolabına konulmalıdır. - Kit bileşenlerinin fiziksel görünümündeki değişiklikler, kararsızlık veya bozulma belirtisi olabilir. - Striplerin kullanılmadan önce kıvrılma/bükülme olasılığını en aza indirgemek amacıyla, tüpün yatay olarak muhafaza edilmesi önerilir. Sağlanan Reaktifler: Bileşen Miktar Ref. Açıklama Strips 1 1x INNO-LiPA HLA-B Update Plus için, Kahverengi işaret çizgili, 20 strip içerir. Strips 2 1x INNO-LiPA HLA-B Update Plus için, Krom renkli işaret Denaturation solution 1x 1 ml Hybridization solution 2x 80 ml çizgili 20 strip içerir EDTA içeren alkali solüsyon Kullanıldıktan sonra şişe kapağı derhal kapatılmalıdır, çözeltinin havaya uzun süre maruz kalması, denatürasyon gücünde hızlı bir gerilemeye sebep olur %0.5 sodyum dodecyl sulfat (SDS) içeren Salin sodyum fosfat EDTA (SSPE) buffer. Hybridization solution, önceden en az 37 C ye ısıtılmalıdır ve sıcaklık kesinlikle 56 C yi aşmamalıdır (kullanımdan önce bütün kristaller çözünmüş olmalıdır).

5 80634 INNO-LiPA HLA-B Update Plus / v5 / KOD:FRI41618 p 5/17 Bileşen Miktar Ref. Açıklama Stringent wash 2x 200 ml solution % 0.1 SDS içeren SSPE tamponu. Stringent wash solüsyonu önceden en az 37 C ye ısıtılmalı ve sıcaklık kesinlikle 56 C yi aşmamalıdır (kullanımdan önce bütün kristaller çözünmüş olmalıdır). Conjugate diluent 1x 150 ml NaCl, Triton, protein stabilizatörleri ve koruyucu olarak %0.01 MIT/<%0.1 CAA içeren fosfat tamponu. Conjugate 100x 1x 1,5 ml Protein stabilizatörleri ve koruyucular içeren bir tamponda alkalin fosfataz etiketli streptavidin, kullanılmadan önce konjugat dilüent ile 1/100 oranında dilüe edilir. Her test oluğu için 2 ml Konjugat çalışma solüsyonu hazırlayın; manuel test için.+ 2 ml fazla (Konjugat çalışma solüsyonu, stringent wash esnasında hazırlanabillir) Auto-LiPA için 10 ml fazla hazırlayın. Conjugate working solution karanlıkta ve oda sıcaklığında (20-25 C) saklandığında 24 saat stabildir. Substrate buffer 1x 235 ml NaCl, MgCl 2 ve koruyucu olarak %0.01 MIT/<%0.1 CAA içeren Tris tamponu. Substrate BCIP/NBT 100x 1x 1,5 ml Kullanımdan önce Substrat buffer içinde 1/100 oranında dilüe edilecek olan dimethylformamide (DMF) içinde 5- Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt (BCIP) ve 4-nitroblue tetrazolium (NBT). Manuel test için her test oluğu için 2 ml Substrat çalışma çözeltisi hazırlayın + 2 ml fazladan (substrat çalışma çözeltisi konjugat inkübasyonu sırasında hazırlanabilir). Auto-LiPA için 10 ml fazla hazırlayın. Substrat çalışma solüsyonu, karanlıkta ve oda sıcaklığında (20-25 C) saklandığında, 8 saat stabildir. Rinse solution 5x 2x 80 ml NaCl, Triton ve koruyucu olarak %0.05 MIT/%0.48 CAA içeren posfat tamponu; kullanılmadan önce distile ya da deiyonize su içinde 1/5 (1 kısım+4 kısım) dilüe edilir. Her test oluğu için 8 ml rinse working solution hazırlayın (+ 10 ml fazladan). Auto-LiPA için, test oluğu başına 12 ml rinse working solution hazırlayın (+20 ml fazladan olmak üzere) Rinse working solution2-8 C de 2 hafta stabildir. İnkubasyon tepsisi 5 - Her biri 8 oluk içerir. Reading card (okuma kartı) Veri raporlama sayfası 1 - Pozitif probların tanımlanması için. 2 - Geliştirilen striplerin saklanması için. Gerekli ama sağlanmayan malzemeler - Sallanan platformlu su banyosu (80 rpm; eğimli kapaklı; sıcaklığı 56 C ± 0.5 C ye ayarlanabilen). - Aspirasyon aparatları. - Kalibre edilmiş termometre. - Orbital, karşılıklı (çift taraflı) veya sallanan platform çalkalayıcı Öneriler Orbital çalkalayıcı (sallanan platform) için: Dairesel hareket çapı 13 mm 'ye eşit ya da daha fazla olmalıdır 13 mm dairesel hareket için önerilen hız, 160 rpm dir.

6 80634 INNO-LiPA HLA-B Update Plus / v5 / KOD:FRI41618 p 6/17 Karşılıklı çalkalayıcı için: İleri geri hareket için önerilen hız, dakikada 80 harekettir. Sallanan platformlu çalkalayıcı için: Sallama açısı sıvı dökülmesini önlemek için 13 'yi geçmemelidir. Önerilen hız 50 rpm dir. - Vorteks mikser veya eşdeğeri. - Dereceli silindirler (10, 25, 50, ve 100 ml). - Distile veya deiyonize su. - Tek kullanımlık eldivenler - Tek kullanımlık steril pipet uçları (tercihen pamuk filtreli). - Strip çalışması için forseps µl, µl, ve µl dağıtımı için ayarlanabilir pipetler. - Dispensiyon için multipipet (Eppendorf, isteğe bağlı). - Zamanlayıcı, 2 saat (± 1 dakika). Güvenlik ve Çevre Koşulları Potansiyel tehlikeli bileşenler hakkında bilgi edinmek için, Güvenlik Bilgi Formuna (SDS) ve ürünün etiketine bakınız. En yeni SDS versiyonu te mevcuttur. Tehlike Uyarı Tehlike Sodyum hidroksit içerir H314 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P310 P363 2-Kloroasetamid içerir H317 P280 P261 P362+P364 P333+P313 P302+P352 N,N-Dimethylformamide, 5,5'-diphenyl-3,3'-bis (4-nitrophenyl)-2,2'-(3,3'-dimethoxybiphenyl-4,4'-ylene)ditetrazolium dichloride ve metanol içerir H312+H332 H319 H360D P261 P280 P201 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P308+P313 EUH208 EUH210 Tehlike İfadeleri EUH208 EUH210 H312+H332 H314 H317 H319 H360D 2-methyl-2H-isothiazol-3-one içerir. Alerjik reaksiyona neden olabilir. Güvenlik bilgi formu istek üzerine temin edilebilir. Yutulduğunda ya da cilt temasında edildiğinde zararlıdır. Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına neden olur. Allerjik deri reaksiyonuna neden olabilir. Ciddi derecede göz tahrişine neden olur. Fetüse zarar verebilir.

7 80634 INNO-LiPA HLA-B Update Plus / v5 / KOD:FRI41618 p 7/17 Önlem ifadeleri P201 Kullanmadan önce özel talimatları edinin. P260 Duman/buhar/sprey solumayın. P261 Dumanı/buharı/spreyi solumaktan kaçının. P280 Koruyucu eldiven/koruyucu giysi/göz koruyucusu/yüz koruyucusu kullanın. P302+P352 CİLT İLE TEMAS HALİNDE: Bol su ile yıkayın/... P303+P361+P353 Cilt temasında(veya saç): Kontamine olan tüm giysileri derhal çıkarın. Cildi su / duş ile yıkayın. P305+P351+P338 GÖZ TEMASINDA: Birkaç dakika su ile dikkatlice yıkayın. Varsa ve kolayca çıkarılabiliyorsa, kontakt lensleri çıkarın. Yıkamaya devam edin. P308+P313 Maruz kaldığınızda veya endişenlendiğinizde: Tıbbi yardım/destek alın. P310 Hemen bir ZEHİR MERKEZİ/doktor/... a başvurun P333+P313 Ciltte tahriş veya kızarıklık oluşursa: Tıbbi yardım/destek alın. P362+P364 Kontamine giysileri çıkartın ve tekrar kullanmadan önce yıkayın. P363 Tekrar kullanmadan önce kontamine olmuş giysileri yıkayın. - Bu test, sadece eğitimli personel tarafından yapılmalıdır. - Örnekler her zaman potansiyel bulaşıcı olarak ele alınmalıdır. Bu nedenle, tüm kan bileşenlerinin ve biyolojik materyallerin potansiyel olarak bulaşıcı olduğu düşünülmeli ve bu şekilde ele alınmalıdır. Tüm kan bileşenleri ve biyolojik materyaller, belirlenmiş emniyet prosedürlerine uygun olarak atılmalıdır. 121 C de minimum 15 dakika otoklavlanmalıdır. Tek kullanımlık malzemeleri yakın. Sıvı atığı, son konsantrasyon ±% 1 sodyum hipoklorit olacak şekilde, sodyum hipoklorit ile karıştırın. Atmadan önce bir gece bekletin. DİKKAT: Sodyum hipoklorit eklemeden önce asit içeren sıvı atığı nötralize edin. - Kişisel koruyucu ekipmanlar kullanılmalıdır: Tehlikeli veya bulaşıcı ajanlar ile çalışılırken, eldiven ve koruyucu gözlük kullanılmalıdır. - Atık, kurumun atık imha etme esaslarına göre işleme tabii tutulmalıdır. Ayrıca tüm federal, eyalet ve yerel çevresel düzenlemeler de dikkate alınmalıdır. Örnekler LiPA testinde biyotinlenmiş amplifiye DNA materyali kullanıldığından, numuneden ilgili DNA'yı amplifiye etmek için INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus amplifikasyon kiti mevcuttur: asit-sitrat-dekstroz (ACD) - veya etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) - antikoagüle edilmiş tam kan örnekleri. Manipülasyon prosedürleri Strip kullanımı - Stripler, sadece bir kez kullanılmak üzere tasarlanmıştır! - Striplere çıplak elle dokunmayın, temiz forseps kullanın.

8 80634 INNO-LiPA HLA-B Update Plus / v5 / KOD:FRI41618 p 8/17 - Test striplerinin tanımlaması için kurşun kalem kullanın. Tükenmez kalem vs kullanmayın. Kimliği striplerin üzerindeki işaret çizgisinin yukarısına yazın. - Farklı inkübasyon adımları esnasında, test stripleri daima aynı olukta kalmalıdır. - Kullanılmamış veya geliştirilen stripler yoğun ışık ve ısıdan uzak tutulmalıdır. - Yorumlama, kapatma ve saklamadan önce, striplerin tamamen kurumasını bekleyin. - Gelişmiş kuru stripler, tercihen C de karanlıkta saklanmalıdır. - Olukları tekrar kullanmayın. Manuel inkübasyon talimatları - Hibridizasyon ve stringent wash esnasında inkübasyonun 56 C ± 0.5 C'de tutulması, yanlış pozitif (çok düşük sıcaklık) veya yanlış negatif / çok zayıf sinyallerin ( çok yüksek sıcaklık) önlenmesi adına en kritik adımlardır. Eğimli kapaklı bir sallayıcı su banyosu, sıcaklık değişimlerinin iyi kontrol edilmesini sağlar. Sıcaklığın iyi bir şekilde kontrol edilmesi için, kalibre edilmiş termometre kullanılmalıdır. - Yanlış pozitif sinyalleri önlemek için inkübasyonlar sırasında su banyosunun kapağını her zaman kapatın. - Hibridizasyon ve stringent wash için, sıcak hava çalkalayıcısı kullanmayın. - Hibridizasyon ve stringent wash için oluklar, su banyosunun sallanan platformuna yerleştirilmelidir. Su seviyesini oluk yüksekliğin üçte birine veya yarısına gelecek şekilde ayarlayın. Olukların suyun üstünde kalmadığından emin olun. Su oluklar ile doğrudan temas halinde olmalıdır. - Renk gelişimi için inkübasyonlar 20 ile 25 C arasında yapılmalıdır. Sıcaklık 20 C'nin altındaysa, zayıf sonuçlar elde edilebilir. Sıcaklık 25 C'nin üstünde ise, yüksek arka plan ve / veya yanlış pozitif sinyalleri alınabilir. - Her zaman protokolde belirtilmiş olan sürelerde inkübasyon yapın. - Hem sallanan platform (hibridizasyon prosedürü) hem de çalkalayıcı, su banyosu (renk geliştirme prosedürü) tarafından oluştu rulan hareket genliği, maksimum hassasiyet ve homojen boyama sağlamak için kritik önem taşır. Strip yüzeyi tamamen suya batmış olmalıdır. Genlik, mümkün olduğu kadar yüksek olmalıdır. Bununla birlikte, olukların kenarlarından sıvı dökülmesinden kaçınılmalıdır! Bu, çapraz kontaminasyona ve geçersiz sonuca yol açabilir. - Stiplerin inkübasyonu sırasında çalkalama işlemi, hem sıvı hem de test striplerinin, oluk kenarından sıvı dökülmeden, olukta ileri geri hareket edecek şekilde gerçekleştirilmelidir. - Tepsiyi kapatmayın. Hibridizasyon ve stringent wash inkubasyonları esnasında, oluklar su banyosunda açıkta kalabilir. Mikroplak kapağı ile olukların kapatılması, çapraz kontaminasyona neden olabilir. Oluklarının içindeki sıvının manuel değişimi için talimatlar - Sıvı oluktan, tercihen vakum aspiratörüne bağlı bir pipet ile aspire edilmelidir. Tepsi, tüm sıvının oluğun bir ucuna akmasına izin verecek bir açıyla tutulur. - Her oluğa uygun solüsyondan 2 ml ekleyin ve protokolu izleyin. Dağıtma işlemi için bir multipipet (Eppendorf) kullanılması yararlı olacaktır. - Bu adımı, test prosedüründe belirtildiği kadar tekrar edin. NOT: İki adım arasında striplerin kurumasına izin vermeyin.

9 80634 INNO-LiPA HLA-B Update Plus / v5 / KOD:FRI41618 p 9/17 Aspirasyon yaparken striplerin yüzeylerinin zarar görmediğinden emin olun. Sıvıyı, stripin üst kısmından işaret çizgisine kadar aspire edin. Tüm sıvı aspire olduğundan emin olun. Stribin tamamının solüsyonun içine tamamen daldırarak, tamamen yıkanmış olduğundan emin olun. Gerekirse çalkalayıcının hızını ayarlayın. Uyarılar ve önlemler - Sadece profesyonel kullanım içindir. - DNA kontaminasyonunu önlemek için, pre- ve post- amplifikasyon aşamaları arasında maksimum fiziksel ayrım yapılması önerilir: ayrı odalar, ayrı pipetler ve başka laboratuar malzemeleri, ayrı laboratuar giysileri ve eldivenler (ve stokları) iyi laboratuvar uygulaması için gereken minimum önlemlerdir. - Post amplifikasyon odasından, pre amplifikasyon odasına herhangi bir dönüş yapmayın. - Otoklavlanmış tek kullanımlık laboratuar malzemesi kullanılması tavsiye edilir. - Tek kullanımlık laboratuar malzemelerini tekrar kullanmayın. - Her bir porsiyonlanmış örnek için yeni bir pipet ucu kullanın. - Reaktifleri, son kullanma tarihlerinden sonra kullanmayın. - Bileşenleri aynı lot numarasına sahip olmadığı sürece, farklı kitlerin reaktiflerini karıştırmayın. - Reaktiflerin mikrobiyal kontaminasyonundan kaçının. Manual test prosedürü NOT: Farklı inkübasyon adımları boyunca, test stripleri hep aynı oluk içinde kalmalıdır. İnkübasyon öncesinde kalibre edilmiş bir termometre kullanarak su banyosunun sıcaklığını kontrol edin ve gerekliyse sıcaklığı, tepsiyi su banyosuna yerleştirmeden önce ayarlayın. Kapağı her zaman kapalı tutun. Numuneler 1. HLA-B amplifiye ürün (10 μl kullanın). Numune hazırlama için:inno-lipa HLA-B Multiplex Plus kullanım talimatlarına bakın. NOT: Tam olarak 10 μl amplifiye numune eklendiğinden emin olun. Gereğinden fazla veya az örnek yanlış tiplendirmeye sebep olabilir. 2. Kör amplifiye kontrol örneği (negatif kontrol; 10 μl kullanın). Denatürasyon ve hibridizasyon 1. Çalkalayıcılı su banyosunu 56 C ± 0.5 C ye ısıtın. Sıcaklığı kalibre edilmiş bir termometre ile kontrol edin ve gerekirse ayarlayın. Belirtilen sıcaklığı aşmayın. Hybridization solution ve Stringent wash solution en az 37 C lik su banyosunda ön ısıtma yapın ve 56 C yi geçmeyin. Kullanmadan önce karıştırın. Bütün kristaller çözünmüş olmalıdır. 2. Forseps ile tüpten gerekli miktarda INNO-LiPA HLA-B Update Plus strip 1 ve strip 2 alın (INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus için test örneği başına bir strip 1 ve bir strip 2, INNO-LiPA HLA-Bw4 amplikonu için bir strip 1). Kör amplifiye kontrol örneği içinde bir strip ekleyin. Kurşun kalem ile şerit üzerindeki siyah işaretçi çizgisinin üstüne bir kimlik numarası yazın.

10 80634 INNO-LiPA HLA-B Update Plus / v5 / KOD:FRI41618 p 10/17 3. Gerekli sayıda test oluğu alın (HLA-B Multiplex Plus için test örneği başına iki oluk ve HLA-Bw4 için test örneği başına bir oluk) ve tepsiye yerleştirin. 4. Her oluğun üst köşesine 10 µl Denaturation Solution pipetleyin. NOT: Kullandıktan sonra şişenin kapağını derhal kapatın μl numune ( Numuneler e bakın; INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus kullanma talimatına bakın) ekleyin ve pipet ile dikkatlice çekip bırakarak karıştırın. Her zaman steril pipet ucu kullanın. Denatürasyonun gerçekleşmesi için C de, 5 dakika bekletin. 6. Önceden ısıtılmış hybridization solution çalkalayın ve her oluğa denatüre amplifiye üründen yavaşca 2 ml ekleyin. Yavaşça çalkalayarak karıştırın. Pipetleme sırasında komşu olukları kontamine etmemeye özen gösterin. 7. Stripleri derhal işaretli membran tarafı yukarıya bakacak şekilde oluklara yerleştirin. Stripler solüsyona tamamen batırılmış olmalıdır. NOT: Tek kullanımlık eldiven giyin ve forseps kullanın. 8. Tepsiyi 56 C ± 0.5 C deki çalkalayıcılı su banyosuna yerleştirin (80 rpm; Manuel inkübasyon için talimatlara bakın), kapağı kapatın ve 30 dakika inkübasyona bırakın. NOT: Suyun, banyodan oluklara sıçramasını önleyin. Su seviyesini oluk yüksekliğin üçte birine veya yarısına gelecek şekilde ayarlayın. Tepsinin kaymasını engellemek için, tepsiyi iki ağırlık arasında sabitleyin. Stringent wash 1. Hibridizasyonun ardından tepsiyi su banyosundan çıkarın. 2. Tepsiyi düşük açıda tutun ve sıvıyı tercihen vakum aspiratöre bağlı bir pipetle oluktan aspire edin. Her oluğa 2 ml önceden ısıtılmış stringent wash solution ekleyin, tepsiyi 56 C ± 0.5 C deki çalkalayıcılı su banyosuna yerleştirin, kapağı kapatın ve 3 dakika inkübe edin. 3. İnkübasyondan sonra tepsiyi su banyosundan çıkarın ve oluklardaki sıvıyı aspire edin dakikalık inkübasyon aşaması ve aspirasyon aşamasını bir kere tekrarlayın. 5. Sonunda, her oluğa 2 ml önceden ısıtılmış Sıkı Yıkama Çözeltisi ekleyin ve tepsiyi 56 C ± 0.5 C deki çalkalayıcılı su banyosuna yerleştirin, kapağı kapatın ve 4 dakika inkübe edin. İnkübasyondan önce kalibre edilmiş bir termometre kullanarak su banyosunun sıcaklığını kontrol edin, gerekli ise sıcaklığı ayarlayın. Kapağı her zaman kapalı tutun. NOT: Konsantre rinse solution 5x ve conjugate 100x ı, stringent wash esnasında dilüe edin. Bkz. Reaktifler Renk gelişimi Sonraki tüm inkübasyonlar, çalkalayıcıda C de gerçekleştirilir. İnkübasyon sırasında, sıvı ve test stripleri, homojen bir boyama için oluk içinde ileri ve geri hareket ettirmelidir. 1. Her stribi 2 ml Durulama çalışma solüsyonu kullanarak 1 dakika boyunca iki kez yıkayın (oluklardaki sıvı değişimi için Talimatlara bakın). 2. Her oluğa 2 ml Konjugat çalışma çözeltisi ekleyin ve çalkalayıcı üzerinde tepsi çalkalanırken 30 dakika inkübe edin.

11 80634 INNO-LiPA HLA-B Update Plus / v5 / KOD:FRI41618 p 11/17 NOT: Konjugat inkübasyonunun bitmesine yaklaşık on dakika kala Substrat BCIP/NBT 100x Çözeltisini dilüe edin. Bkz. Reaktifler 3. Her bir stribi, 2 ml rinse working solution kullanarak, 1 dakika boyunca iki kez yıkayın ve ardından 2 ml'lik substrat buffer ile bir kez daha yıkayın. 4. Her oluğa 2 ml substrate working solution ekleyin ve çalkalayıcı üzerinde tepsi çalkalanırken 30 dakika inkübe edin. DİKKAT: Eldiven ve koruyucu gözlük kullanın. 5. Stripleri 2 ml distile suda iki kez yıkayarak renk gelişimini durdurun, çalkalayıcı üzerindeki tepsiyi en az 3 dakika çalkalayın. 6. Forseps kullanarak, stripleri oluklardan çıkarın ve kurutma kağıdı üzerine koyun. Sonuçları okumadan önce stripleri tamamen kurutun. Renklenmiş ve kurumuş stripleri karanlıkta saklayın. Otomatik test prosedürü: Dökümanlar ve ilişkili protokoller Fujirebio Avrupa N.V. den edinilebilir (Bkz. Sonuçlar Okuma Şekil 1 INNO-LiPA HLA-B Update Plus striplerindeki farklı oligonükleotid problarının pozisyonunu göstermektedir. Test prosedürünün sonunda net bir mor / kahverengi bant görünüyorsa,bu bant/çizgi pozitif olarak kabul edilir. Şekil 1: İşaret çizgisinin yerleşimi (Strip 1 de kahverengi çizgi ve Strip 2 de krom çizgi), Konjugat Kontrol çizgisi (conj. control), HLA-B Update Plus Kontrol çizgisi (HLA-B control) ve INNO- LiPA HLA-B Update Plus Stripleri üzerinde 66 sekans-spesifik DNA probu. Onaylama - Her test çalışmasına bir negatif kontrol dahil edin. Her yeni test prosedüründe olduğu gibi, test prosedürünü doğru bir şekilde yapıldığından emin olunana kadar, test prosedürüne ilave pozitif ve negatif kontroller dahil edilmesi önerilir. Uygun test koşullarının oluşturulduğunu doğrulamak için referans DNA'nın kullanılması önerilmektedir.

12 80634 INNO-LiPA HLA-B Update Plus / v5 / KOD:FRI41618 p 12/17 - INNO-LiPA HLA-B Update Plus striplerinde (Şekil 1) en üstteki çizgiler işaret çizgileridir (kahverengi ve krom renkli çizgi). Bu çizgiler stribin doğru yönlendirilmesini sağlar. - Sonraki çizgi tespit prosedürü esnasında, reactive conjugate ve substrate working solution eklenip eklenmediğini kontrol eder. Bu çizgi, plastik okuma kartındaki konjugat kontrol çizgisi ile hizalanmalıdır. Bu çizgi daima pozitif olmalıdır (değilse: yorumlama yapılmamalı!) ve aynı test çalışmasında her strip üstünde yaklaşık aynı yoğunluğa sahip olmalıdır. - Sonraki çizgi hibridizasyon için uygun miktarda HLA-B amplifiye materyalin eklenip eklenmediğini gösteren HLA-B Update Plus iç hibridizasyon kontrol çizgisidir (okuma kartında HLA-B kontrol). Bu çizgi, HLA-B multiplex ampifikasyonunun negatif kontrolü hariç, her zaman pozitif olmalıdır ama yoğunluğu numuneler arasında farklılık gösterebilir. - Her bir negatif kontrolün tahlil sonucu, dahili hibridizasyon kontrol çizgisinde (HLA-B Control) pozitif olacağı HLA-Bw4 amplifikasyonu haricinde, strip üzerindeki herhangi bir hat için belirgin bir sinyal vermemelidir. - Bir stripteki probların renk yoğunlukları, bir çizgiden diğerine değişiklik gösterebilir. Sonuçların Yorumlanması - Stripteki konjugat kontrol çizgisi, plastik okuma kartındaki konjugat kontrol çizgisi ile hizalanmalıdır. - Her bir stribi doğrulamak için öncelikle kontrol çizgilerinin pozitifliğini kontrol edin (ilk iki çizgi) (bkz. "Onaylama"). - Tiplendirme sonuçları, kit içindeki probların reaktivitesini esas alır. Prob özgünlükleri listesi mevcuttur. - INNO-LiPA HLA-B Update Plus striplerinde pozitif olan bütün prob numaralarını belirleyin ve INNO-LiPA HLA-B Update Plus tiplendirme tablosunuveya LİPA yorumlama yazılımının bir versiyonunu kullanarak HLA-B tipini sonuçlandırın. (Yorumlama yazılımı: LiRAS bakın). Yazılım çoğu zaman, kullanım amacından daha fazla sayıda sonuç verir; allel grubundaki yorumlamaların yanı sıra bütün muhtemel allel kombinasyonları. Bu bilgiler ekstra sayılmalı ve karar aşamasında kullanılmamalıdır. Yorumlama yazılımı: LiRAS INNO-LiPA HLA için LiRAS yazılımı, LİPA sonuçlarının yorumlanmasını desteklemek için tasarlanmıştır. En son güncellenen versiyonu edinmek için, lütfen yerel distribütörünüz ile temasa geçin. Prosedür sınırlamaları - Bu ürün, sadece hibridizasyon teknikleri konusunda eğitimli personel tarafından kullanılmalıdır. - Spesifik hibridizasyon ve hedef DNA'nın doğru tiplendirilmesi, iyi laboratuar uygulamaları ve belirtilen prosedürlerin dikkatli bir şekilde uygulanması ile sağlanır.

13 80634 INNO-LiPA HLA-B Update Plus / v5 / KOD:FRI41618 p 13/17 - INNO-LiPA HLA-B Update Plus stripleri, allel grup seviyesinde çözünürlük vermek üzere tasarlanmıştır (B*07 - B*83). Bununla birlikte, belirli alellerin bir kombinasyonu benzersiz olmayan bir prob kombinasyonuna ve dolayısıyla iki veya daha fazla olası allelik kombinasyonun belirsiz bir cevabına neden olabilir. - Yeni alleller, tiplendirme sonucunu etkileyebilecek polimorfizmlere sahip olabilir. Sonuçların yorumlanmasında bu dikkate alınmalıdır. - Allellerin hepsi için, primer bağlanma bölgesindeki sekans bilinmemektedir. Primer bölgedeki uyumsuzluk riski, primer başarısızlığa dikkat edilmediğinden ve tüm grupları kapsayan önemli sayıdaki allel test edildiği için çok düşük kabul edilir. Buna rağmen, homozigot sonuçlarda allelik drop-out durumu göz önüne alınmalıdır. - HLA-B Update Plus kontrol çizgileri sadece HLA-B için spesifik değildir, ayrıca bazı HLA-A ve bazı HLA-C allelleri için de spesifiktir. Bu nedenle HLA-B Control çizgileri HLA-A ve HLA-C amplifiye ürünleri ile de reaksiyona girebilir. Test performansı HLA-B Multiplex primer solution ile amplifiye edilen DNA kullanımıyla testin performansı INNO-LiPA HLA-B Update testinin performansı 4 Avrupa doku tipleme bankasının rutin tipleme örnekleri ile değerlendirilmiştir. Toplamda 347 numune analiz edilmiştir. DNA, taze veya dondurulmuş EDTA antikoagülanlı veya sitratlı kandan ekstrakte edilmiştir. Salting out, QIAamp 96 DNA blood kit (Qiagen),Genomic DNA Purification kit (Promega) ve Puregene (Gentra Systems) DNA ekstraksiyon yöntemleri arasındadır. Taze veya dondurulmuş DNA, GeneAmp PCR System PE-9600 veya PE-9700 thermal cycler kullanılarak amplifiye edilmiştir. Amplikonlar striplere eklenmeden önce 2-8 C veya -25/-15 C de saklanmıştır. Bir merkezden iki örneğe tekrar testi yapılması gerekmiş olsa da, amplifikasyonlarda başarısızlık gözlenmemiştir. Örnekler Auto-LiPA cihazı kullanılarak işlenmiş ve LiRAS yorumlama yazılımının klinik deneme sürümü ile yorumlanmıştır. Doğruluk 347 örnekten 342 i için HLA- B tipleme sonucu elde edilmiştir. Bir merkezden gelen 4 numune için tekrar testi gerekmiştir. Bir numune, 'hiçbir tiplendirme yapılamadı' sonucunu vermiştir, ancak araştırmacıya göre bu sonuç muhtemelen DNA kirliliğinden kaynaklanıyordu. Bir merkezdeki 4 örnek için araştırmacı tarafından herhangi bir tiplendirme sonucu elde edilemedi, ancak bunlardan birisi için düzenleme yoluyla tiplendirme sağlanmıştır. Allel grubu düzeyinde doğruluk alternatif DNA testleri ile gözlenen uyum yüzdesi olarak hesaplanmıştır (Biotest ELPHA HLA-AB LowRes Typing kit, Dynal SSP, LiPA HLA-B, sequencing, Micro SSP, OLERUP SSP, Biotest HLA-A SSP). İki sonuç aynı ise, INNO- LiPA HLA-B Update sonuçları referans sonuçtan daha spesifik ise veya INNO-LiPA HLA-B Update sonuçları daha düşük çözünürlük göstermiş ancak referans yöntemlerine kıyasla doğru sonuç göstermişse INNO-LiPA HLA-B Update sonuçları referans test sonucuyla uyumlu kabul edilir. Doğruluk % 100 idi (342/342). Çözünürlük (tipleme tablosu sürüm v1.0/ )...

14 80634 INNO-LiPA HLA-B Update Plus / v5 / KOD:FRI41618 p 14/17 INNO-LiPA HLA-B Güncellemesi, HLA-B allellerini allel grubuna yani hem serolojik geniş hem de bölünmüş düzeye çevirmek için tasarlanmıştır. Allel grubu standart HLA isimlendirmesinde yıldız işaretini takip eden ilk iki basamağın belirlenmesine denktir (ör. HLA B*07). Ayrıca kit, aşağıdaki önemsiz alelleri de saptamak üzere tasarlanmıştır: 0808N (ekzon 3), 1526N (ekzon 3) and 5111N (ekzon 4). Allel grup seviyesindeki çözünürlük % 92.4 (316/342) olarak hesaplanmıştır. Gözlenen belirsizlikler B*08xB*51 veya B*08xB*78 (8 vaka), B*15xB*35 veya B*15xB*15 (2 vaka), B*35xB*38 veya B*39xB*53 (2 vaka), B*08xB*38 veya B*08xB*39 (2 vaka), B*15xB*51 veya B*15xB*52 veya B*15xB*78 (2 vaka), B*35xB*51 veya B*53xB*78 (2 vaka), B*35xB*38 veya B*35xB*53 (1 vaka), B*35xB*49 veya B*50xB*53 (1 vaka), B*35xB*47 veya B*53xB*47 (1 vaka), B*40xB*78 veya B*40xB*52 (1 vaka), B*35xB*55 veya B*35xB*56 (1 vaka), B*15xB*49 veya B*15xB*50 (1 vaka), B*49xB*78 veya B*50xB*51 (1 vaka), B*15xB*51 veya B*52xB*78 (1 vaka) idi. Bu vak alardan altısı için, hem referans test hem de INNO-LiPA HLA-B Update belirsiz sonuç vermiştir. Referans yöntem ile gözlenen iki belirsizlik (6 adet) INNO-Lipa HLA-B Update testi kullanılarak tek keskin hatlı bir sonuca indirgenmiştir. Prob reaktivitesi Klinik deneme boyunca bir veya daha fazla durumda 4 prob yalancı pozitif, 9 prob ise zayıf yalancı negatif sonuç vermiştir. Bu bilgi, henüz mevcut değil ise, gelecek tiplemelere yardımcı olmak için yazılıma ve/veya rehbere eklenmiştir. LiRAS yorumlama yazılımı kullanıldığında, yanlış pozitiflerin hepsi tanımlandı ve allel grup seviyesinde uyumlu tiplendirme elde edilmiştir. Probe reaktivitesi hakkında, spesifik bilgi için kılavuza bakın. Prob ve primer özgünlüklerin tam bir listesi mevcuttur. Tüm problar, aksi belirtilmediği sürece, bir uyumsuzluk seviyesinde spesifik olarak tamamlayıcı sekansları ile hibridleşecek şekilde tasarlanmıştır. Testin hassasiyeti 0.01 μg / μl'den 2μg / μl'ye kadar değişen 3 DNA numuneisinin dilüsyon serisinin dahili değerlendirmesi sırasında elde edilen sonuçlar, minimum 0.1 μg DNA kullanılması gerektiğinini göstermiştir. Harici performans değerlendirmesi 20 ng/µl ve 1500 ng/µl arasında konsantrasyona ve 1.5 saflığa (A260nm/A280nm) sahip 347 DNA numunesini içeriyodu. DNA, amplifikasyon öncesi 20 ng/μl ng/μl arasında bir konsantrasyona dilüe edilmiştir. Bir merkezden iki örnek için yeniden test etme gerekse de amplifikasyonda başarısızlık yaşanmamıştır. Kesinlik Dahili veri: Üç numune, manuel yöntem kullanılarak iki farklı kişi tarafından ya da iki farklı Auto- LiPA enstrümanında bir kişi tarafından 4 kez test edilmiştir. 2 numune, 3 farklı lot ile 2 farklı çalışmada test edilmiştir. Sonuçların yorumlanması bütün numuneler için aynıdı. Prob reaktivitesi bütün durumlarda karşılaştırılabilirdi.

15 80634 INNO-LiPA HLA-B Update Plus / v5 / KOD:FRI41618 p 15/17 Harici doğrulama: - Lotlar arası değişkenlik, ürünün iki farklı grubuna sahip bir yeterlilik paneli analiz edilerek değerlendirildi.(bilinen reaktivite ve yorumlanma ile 5 numune). Her bir numune için kullanılan gruptan bağımsız olarak, aynı tiplendirme sonucu elde edildi. - Laboratuarlar arası değişkenlik dört merkez tarafından test edilen aynı yeterlilik paneli kullanılarak değerlendirildi. Her merkez beş örnek için, aynı tiplendirmeyi elde etti. HLA-Bw4 primer solution ile amplifiye edilen DNA kullanılan testin performansı INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus'ın HLA-Bw4 rinse solution'ın performansı kurum içi ve iki Belçika doku tipleme laboratuarında değerlendirildi. Toplamda 82 içimsizörnek analiz edilmiştir (50 örnek harici olarak; 32 kurum-içi). Bütün numuneler önceden INNO-LiPA HLA-B Update ile tiplendirilmiştir. Numunelerin 31 i belirsiz (18 farklı belirsizlik) ve 51 i kesin sonuçluydu. Bütün belirsiz numunelerdem özgün sonuçlar almak için, bir veya daha fazla DNA temelli tiplendirme testleri ile ileri tiplemeleri yapılmıştır. Tüm hibridizasyonlar Auto-LiPA cihazı ve HLA56v3 programı kullanılarak yapılmıştır ve yorumlama ise LiPA HLA v3.00 yorumlama yazılımı için LiRAS nin klinik deneme versiyonu ile yapılmıştır. Doğruluk Teşhis doğruluğunun hesaplanması, başarıyla amplifiye edilmiş ve özgün bir referans sonucunun mevcut olduğu numuneler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak, iki numune bu hesaplamadan çıkarılmıştır. Geri kalan 80 numune için özgün bir HLA-B tipleme sonucu elde edilmiştir. Alel grup seviyesinde testin diagnostik doğruluğu INNO-LiPA HLA-B Update (Fujirebio Europe N.V.) veya bir alternatif tipleme testi (Olerup SSP (GenoVision), SBT (Abbott), Biotest HLA-B SSP (Biotest), Allset+ HLA-B Low Resolution (Dynal), ve sequencing (in-house metod)) ile elde edilen özgün tipleme sonucuna kıyasla doğru şekilde elde edilen tipleme sonuçlarının sayısı olarak hesaplandı. 80 örneğin hepsinin tipleme sonuçları referans test ile uyumludur, tanısal doğruluk ise %100 (80/80; %95 CI [%95.5; %100]) dür. Çözünürlük (tipleme tablosu versiyon v.1.4/031010) INNO-LiPA HLA-B Update stripleri ile kombinasyon halinde kullanılan HLA-B Multiplex primer solution, allel grup seviyesinde HLA-B allellerini tiplemek için tasarlanmıştır. INNO-LiPA HLA-B Update strip 1 ile kombinasyon halinde kullanılan HLA-Bw4 primer solution, en sık karşılaşılan belirsizlikleri çözmek için tasarlanmıştır,ör. Bw4/Bw6 allellerini içeren belirsizlikler. HLA-B Multiplex Primer solution ile test edildikten sonra gözlenen allel grup seviyesindeki bütün belirsizlikler HLA-Bw4 Primer solutionkullanılarak kesin tipleme sonucuna indirgenmiştir: B*08, B*38 veya B*08, B*39 (2 vaka); B*08, B*51 veya B*08, B*78 (4 vaka); B*13, B*49 veya B*13, B*50 (2 vaka); B*15, B*38 veya B*15, B*39 (1 vaka); B*15, B*51 veya B*15, B*52 veya B*15, B*78 (1 vaka); B*15, B*51 veya B*15, B*52 veya B*15, B*78 veya B*35, B*52 (1 vaka); B*35, B*38 veya B*39, B*53 (4 vaka); B*35, B*40 veya B*40, B*53 (1 vaka); B*35, B*47 veya B*47, B*53 (1 vaka); B*35,

16 80634 INNO-LiPA HLA-B Update Plus / v5 / KOD:FRI41618 p 16/17 B*49 veya B*50, B*53 (2 vaka); B*35, B*52 veya B*53, B*78 (2 vaka); B*38, B*44 veya B*39, B*44 (1 vaka); B*38, B*50 veya B*39, B*49 (1 vaka); B*38, B*78 veya B*39, B*51 (1 vaka); B*40, B*49 veya B*40, B*50 (2 vaka); B*41, B*53 veya B*42, B*53 (1 vaka); B*44, B*49 veya B*44, B*50 (2 vaka). Bütün belirsiz sonuçlar için LiRAS yorumlama yazılımı INNO-LiPA HLA-B Update strip 1 ile hibridizasyonu takiben Bw4 amplifikasyonunu önermiştir.

17 80634 INNO-LiPA HLA-B Update Plus / v5 / KOD:FRI41618 p 17/17 Prob reaktivitesi Bu çalışma esnasında bir numune, bir ya da daha çok kez, zayıf tepki vermiştir. LiRAS yorumlama yazılımı kullanıldığında, allel grup seviyesinde uyumlu tiplendirme elde edilmiştir. Testin hassasiyeti Tahlilin allel grubu düzeyindeki test hassasiyeti, başarılı bir şekilde tiplenmiş numunelerin toplam numune sayısına oranı olarak hesaplanmıştır. Bu değerlendirmede test hassasiyeti, dört numunenin tek bir tekrar amplifikasyon testinden sonra % 98.8 (81/82;% 95 CI [% 93.4;% 100]) idi. Merkezde yeniden yapılan testten sonra amplifikasyonu başarısız olan numune, kurum içi olaak başarıyla amplifiye edilmiş ve doğru bir tiplendirme sonucu elde edilmiştir. Kesinlik Tekrarlanabilirlik (intra-assay), inter-assay ve inter-person varyasyon kurum-içi değerlendirildi. Üç farklı scycler kullanarak amplifiye edilmiş ve cycler başına iki kez çalışılan bir numune, Auto-LiPA cihazı kullanılarak test edildi. Bu protokol iki farklı kullanıcı tarafından, ikişer kez tekrar edilmiştir. Hiçbir önemli varyasyon gözlenmedi ve düzenleme gerektirmeyen tüm olgularda aynı tiplendirme sonucu elde edildi. Lisanslar Bu ürünün satın alınması, alıcının insan in vitro teşhislerinde, teşhisin gerçekleştirilmesi için kullanıma olanak sağlar. Satın alma yoluyla kullanıma ilişkin bu özel kullanım hakkı dışındaki herhangi bir genel patent veya başka herhangi bir lisans verilmemektedir. Ticari markalar - INNO-LiPA, LiRAS ve Auto-LiPA USA ve diğer ülkelerde tescilli olan, Fujirebio Europe N.V. ticari markalarıdır. - GeneAmp Uygulanmış Biyosistemlerin tescilli ticari markasıdır, LLC. - QIAamp ve Puregene, QIAGEN Group tescilli ticari markalarıdır.