INNO-LiPA HBV Multi-DR

Transkript

1 ANAHTAR_KODU: FRI INNO-LiPA HBV Multi-DR v p 1/12 Türkçe INNO-LiPA HBV Multi-DR Üretici: Fujirebio Europe N.V. Technologiepark Gent Belçika BTW BE RPR Gent Distribitörü: Fujirebio Almanya GmbH Hans-Böckler-Allee Hannover Almanya Fujirebio İtalya S.r.l. Via Vaccareccia 39/A Pomezia (Roma) İtalya Fujirebio Fransa SARL. Les Conquérants, Bât. Le Kilimandjaro 8/10, avenue des Tropiques Les Ulis Fransa Fujirebio İberya S.L. Calle Tarragona 161, Planta Barselona İspanya Fujirebio Europe N.V. Technologiepark Gent Belçika Diğer diller için / Autres langues voir / Andere Sprachen siehe / Altre lingue vedere / Ver otros idiomas / Outras línguas ver: EUROPE GR IS LT RO SK TR LI MT non-europe US CA AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU :00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Europe N.V.

2 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v2 / ANAHTAR-KODU: FRI15250 p 2/12 İçindekiler Kullanılan semboller... 2 Kullanım amacı... 3 Test prensibi... 3 Reaktifler... 3 Açıklama, kullanım için hazırlık ve önerilen saklama koşulları... 3 Verilen reaktifler... 4 Gerekli ama sağlanmayan materyaller... 4 Amplifikasyon...4 LiPA... 4 Uyarı ve önlemler... 5 Güvenlik ve Çevre... 5 Örneklerin toplanması, işlenmesi ve saklanması... 6 Amplifikasyon test prosedürü... 6 Amplifikasyon protokolü...6 Amplifikasyon sonuçları... 7 Görüntüleme... 7 Kalite Kontrol... 7 LiPA manüel test prosedürü... 7 Örneklerin denatürasyonu... 7 Örneklerin hibridizasyonu... 8 Striplerin yıkanması... 8 Renk gelişimi... 8 LiPA otomatik test prosedürü: Oto-LiPA ve Oto-LiPA LiPA sonuçları... 8 Okuma... 8 Kalite Kontrol... 9 Sonuçların yorumlanması... 9 Performans özellikleri...10 Başarı oranı ve anlaşma Örnek tipi Otomasyon Klinik özgünlük Kesinlik Prosedürün kısıtlamaları Ticari markalar Kullanılan semboler Üretici In Vitro Tanısal Medikal Yöntem Batch kodu Katalog numarası Kullanıcı Kullanım talimatlarını Danışın Sıcaklık kısıtlamaları

3 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v2 / ANAHTAR-KODU: FRI15250 p 3/12 <n> test için Yeterli İçerik Amplifikasyon (AMP) reaktifleri: Primer Mix LiPA reaktifleri: Konjügat 100x Konjügat Diluent Denatürasyon Çözeltisi Hibridizasyon Çözeltisi Durulama Çözeltisi 5x Sıkı yıkama Çözeltisi Stripler Substrat BCIP/NBT 100x Substrat Tamponu Kullanım amacı INNO-LiPA HBV Multi-DR insan serum ya da plazma örnekleri üzerinde kullanım için in vitro ters hibridizasyon çizgi probu testidir. INNO-LiPA HBV Multi-DR kullanılarak, wild tip, mutasyonlar ve ya HBV polimeriz kodon 80, 173, 180, 181, 184, 194, 202, 204, 236 ve 250 üzerindeki polimorfizmler eş zamanlı olarak tespit edilebilir. Test prensibi Hepatitis B virüsü (HBV), RNA üzerinden eşlenen, kısmi çift sarmallı DNA virüsüdür. Prosedürün birinci adımı, viral DNA nın örnekten izole edilmesidir. Saflaştırılmış DNA daha sonra, biyotinlenmiş PCR primerleri kullanılarak bir çevrim PCR üzerine amplifiye (yükseltme) edilir. Bu testte kullanılan primerler HBV polimeraz geninin bir parçasını (A-F etki alanı) amplifiye eder. DNA sarmalının iki ipliği, primerlerin hedefini ortaya çıkarmak amacıyla, ısıtma ile (denatürasyon) ayrılır. Bu oligonükleotid primerler, hedef bölgeye komşu olan korunmuş bölgelere tamamlayıcı niteliktedir. Bu sebeple, belirli bir dereceye kadar soğutulması ile, primerler kendilerine özgü sıralamada bağlanırlar (55 C de ısıl işlem). Yüksek bir sıcaklıkta, dntp varlığında, termostabil DNA polimeraz, ısıl işlem görmüş primerleri hedef şablon boyunca (uzatır) genişletir. Bir çevrim denatürizasyon, ısıl işlem ve genişletme işlemlerinin ardından şablonun birebir kopyası üretilir. Bu uygulama, 50 çevrim için tekrarlanır, böylece, 867 bp, lik, çoklu-kat amplifiye edilmiş hedef sekans elde edilmiş olur. Amplifikasyon ardından, HBV polimeraz geninden elde edilen biyotinlenmiş DNA maddesi, membran bazlı şeritlerde paralel çizgiler şeklinde sabitlenmiş spesifik oligonükleotid problar ile hibridize edilmiştir. Hibridizasyon işleminin ardından, hibridize olmamış DNA stripten yıkanır. Alkali fosfataz ile etiketlenmiş streptavidin eklenir ve önceden oluşmuş biyotinlenmiş hibritlere bağlanır. BCIP/NBT kromojen ile inkübasyon mor/kahverengi çökelek oluşturmaktadır. INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri, bir mavi markır çizgi, 2 kontrol çizgisi ve 32 paralel prob çizgisinden oluşmaktadır. INNO- LiPA HBV DR v3 stripleri bir krom/sarımsı markır çizgi, 2 kontrol çizgisi ve 22 paralel prob çizgisinden oluşmaktadır. Konjügat kontrol çizgisi, renk gelişim reaksiyonunu kontrol amaçlıdır ve amplifikasyon kontrol çizgisi, yükseltilmiş HBV genomik maddesinin varlığını kontrol edebilmek için evrensel HBV problarını içermektedir. Reaktifler Açıklama, kullanım için hazırlık ve önerilen saklama koşulları Uyarı: Amplifikasyon ve LiPA reaktifleri ulaştıklarındaki doğru sıcaklıkta muhafaza edilmelidir: ön-amplifikasyon alanında amplifikasyon reaktifleri ve post-amplifikasyon alanında LiPA reaktifleri. - Eğer 2-8 C de saklanmışsa, açılmış ya da açılmamış, reaktifler son kullanma tarihine kadar stabildir. Son kullanma tarihini aştıktan sonra reaktifleri kullanmayınız. - Kontaminasyonu önlemek için, amplifikasyon reaktiflerinin ilk kullanımda alikotlar içine dağıtılması önerilir. - Reaktifler, özellikle de amplifiye edilmiş ürünler, artık DNA içeren her türlü kaynaktan korunarak saklanmalıdır. Tek kullanımlık tüpler ve pipet uçları (tercihen pamuk tıkalı) kullanılması önerilir. - Tüm bileşenler kullanımdan 30 dakika önce oda sıcaklığına (20-25 C) getirilmeli ve kullanımın hemen ardından buzdolabına geri konmalıdır. Şişeleri açmadan önce tüm bileşenleri aşağı yukarı karıştırın. Kullanımın hemen ardından şişeleri kapatınız.

4 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v2 / ANAHTAR-KODU: FRI15250 p 4/12 - Kit reaktiflerinin fiziksel görünümündeki değişiklikler kararsızlık ve ya bozulma gösterebilir. - Striplerin kullanımdan önce kıvrılma olasılığını en aza indirgemek için, tüpün yatay muhafaza edilmesi tavsiye edilmektedir. Verilen reaktifler Bileşenler Miktar Ref. Açıklama Amplifikasyon reaktifleri: Primer Mix 1x 0.04mL Koruyucu olarak, %0.05 NaN3 ile biyotinlenmiş primerler içermektedir. LiPA reaktifleri: Stripler 1x 20 1x Mavi markır çizgilerle işaretlenmiş INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri içeren 1 plastik tüp. Sarımsı markır çizgilerle işaretlenmiş INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri içeren 1 plastik tüp. Denatürizasyon Çözeltisi 1x 1 ml EDTA içeren Alkalin solüsyonu. Uyarı: Denatürizasyon solüsyonunu içeren şişe kullanımının ardından hemen kapatılmalıdır: gereğinden fazla Hibridizasyon Çözeltisi 1x 80 ml havaya maruz kalma durumu hızlı bir bozulmaya sebep olur. Deterjanlar ve koruyucular ile SSC-tampon içerir. Hibridizasyon solüsyonu en az 37 C kadar ve 49 C aşmadan önceden ısıtılmalıdır. Sıkı Yıkama Çözeltisi 1x 200 ml Deterjanlar ve koruyucular ile SSC-tampon içerir. Sıkı Yıkama çözeltisi en az 37 C kadar ve 49 C aşmadan önceden ısıtılmalıdır. Konjügat 100x 1x 0.8 ml Kullanımdan önce 1/100 oranında Konjügat Seyreltici içinde seyreltilecek, protein stabilizatörleri ve koruyucu olarak 0.01% MIT/ <0.1% CAA içeren Tris tampondaki alkali fosfataz ile etiketlenmiş streptavidin. Her test için 2 ml ve fazla olarak 2ml çalışan konjügat solüsyonu hazırlayınız. Oto-LiPA için fazladan 10 ml hazırlayınız. Çalışan konjügat, karanlıkta ve oda sıcaklığında (20-25 C) solüsyon 24 saat boyunca stabildir. Konjügat Diluent 1x 80 ml Koruyucu olarak NaCl, Triton, protein stabilizatörler ve 0.01% MIT /<0.1% CAA içeren fosfat-tampon. Substrat BCIP/NBT 100x 1x 0.8 ml Dimetilformamid içinde 5-brom-4-klor-3-indolilfosfat ve4- nitro-mavi tetrazolyum, 1/100 oranında Bileşen tampon içinde seyreltilecektir. Her test için 2 ml ve fazla olarak 2ml çalışan konjugat solüsyonu hazırlayınız. Oto-LiPA için fazladan 10 ml hazırlayınız. Çalışan konjugat, karanlıkta ve oda sıcaklığında(20-25 C) solüsyon 24 saat boyunca stabildir. Substrate Buffer 1x 180 ml Koruyucu olarak NaCl, MgCl2 ve %0.01 MIT/<%0.1 CAA içeren Tris tampon. Rinse Solution 5x 1x 80 ml Koruyucu olarak NaCl, Triton, ve 0.05% MIT/0.48% CAA içeren fosfat tampon. Kullanımdan önce distile ya da deiyonize edilmiş su ile 1/5 (1 + 4) oranında seyreltilmelidir. Her test için 8 ml ve fazla olarak10ml çalışan durulama solüsyonu hazırlayınız. Oto-LiPA için 12ml ve fazla olarak 20 ml çalışan durulama solüsyonu hazırlayınız. Çalışan durulama solüsyonu 2-8 C arasında 2 hafta boyunca stabildir. İnkübasyon tepsileri 3 - Her birinde 8 oluk bulunmaktadır. Okuma kartı 1 - Pozitif probların tanınması içindir. Veri raporlama sayfaları 2 - Geliştirilmiş striplerin saklanması içindir. Gereken ama sağlanmayan materyaller - Tek kullanımlık eldivenler. - Tek kullanımlık steril pipet uçları (tercihen pamuk-tıkalı). - Steril mikro tüpler. - Mikro tüp rafları. - Mikro tüp santrifüj µl, µl ve µl taşımak için ayarlanabilir pipetler. - Otoklavlanmış distile su. Amplifikasyon Amplifikasyon için, Qiagen HotStarTaq DNA polimeraz (Kat. no: ) ve 10x PCR tampon (Kat. no: ) kullanımı önerilmektedir. - DNA termal döngü cihazı ve ekipmanları. - dntps (25 mm) - MgCl 2 (25 mm) - Qiagen 10x PCR tampon (Tris-HCl, KCl, (NH 4 ) 2 SO 4, 15 mm MgCl 2, ph 8.7 içerir). - Qiagen HotStarTaq DNA polimeraz. LiPA - Aspirasyon aparatları.

5 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v2 / ANAHTAR-KODU: FRI15250 p 5/12 - Kalibre edilmiş termometre. - Pense (forceps). - Dereceli silindirler (10, 25, 50, ve 100 ml). - Zamanlayıcı (2 saat ± 1 dakika). - Vorteks karıştırıcı veya muadili. - Çalkalama platformu bulunan su banyosu (80 rpm; eğimli kapak; minimum 49 C ± 0.5 C ayarlanabilen sıcaklık). - Orbital çalkalıyıcı (160 rpm) veya dalgalı çalkalayıcı(50 rpm). Opsiyonel materyaller: - Dağıtıcı çok kanallı pipet (Multipipet, Eppendorf ve ya muadili). - Strip işlem adımlarının otomasyonu için ekipmanlar (Oto-LiPA veya Oto-LiPA 48). Detaylı bilgi için distribütörünüzle temasa geçiniz. Uyarılar ve önlemler - Yalnızca profesyonel kullanım içindir. - Amplifikasyon işlemi için kullanılan tüm pipet uçları ve tüpler otoklavlanmalıdır. Pamuk tıkalı pipet uçları tavsiye edilir. Yalnızca tek kullanımlık laboratuar malzemeleri kullanınız. - Her numune kısmı için yeni bir pipet ucu kullanınız. - Aynı lot numaraları olmadığı sürece farklı kitlerden reaktifleri karıştırmayınız. - PCR kontaminasyonunu önlemek için, öncesi ve sonrası amplifikasyon adımlarının fiziksel ayrımını maksimize ediniz. Örnekler, ekipmanları ve ya reaktifleri bir önceki adımı yaptığınız yere geri döndürmeyiniz. Eğer önceki çalışma alanlarından birine dönmeniz gerekiyorsa öncelikle uygun arındırma adımlarını gerçekleştiriniz. - Stripleri kullanmak ve tek kullanımlık eldivenleri giymek için forseps kullanın. Çıplak ellerinizle striplere dokunmayınız. - Striplerin üzerine yazmak için yalnızca kurşun kalem kullanın. Tahlil reaktifleri stripler üzerindeki mürekkebi çıkarabilir. - Doğru sonuçlar için, Hibridizasyon ve yıkama adımları için su banyosu kullanın ve sıcaklığın 49 C ± 0.5 C olduğundan emin olun. Sıcak hava çalkalayıcısı kullanmayın. Kesin bir sıcaklık kontrolü gerektiğinden, kalibre edilmiş bir termometre kullanın. Sıcaklığı korumak için her zaman su banyosunun kapağını kapalı tutunuz. Eğer sıcaklık çok düşükse, tahlil hatalı pozitif sonuçlar doğurabilir; eğer sıcaklık çok yüksek ise, çok zayıf sinyaller ya da hatalı negatif sonuçlar alınabilir. Optimum sıcaklık kontrolü için eğimli kapaklı, çalkalamalı bir su banyosu kullanın. - Hibridizasyon sırasında çalkalamalı su banyosunun ve orbital ve ya dalgalı çalkalayıcı tarafından renk geliştirilmesi sırasında yapılan sıkı yıkamasının yarattığı hareket önemlidir. Reaktiflerin stripler üzerindeki hareketini maksimize etmek ve tepsilerdeki oluklar arasında sıçramaları önlemek için bu cihazların hızlarının dikkatlice ayarlanması gerekmektedir. - Banyo suyundan tepsiye su sıçratmamaya özen gösterin. Su banyosundaki su seviyesini tepsi yüksekliğinin yarısı ile üçte biri kadar olacak şekilde ayarlayınız. Tepsinin kaymasını önlemek için ağırlık kullanarak sabitleyiniz. - Adımlar arasında striplerin kurumasına izin vermeyin. - Prosedür boyunca her stribi aynı olukta tutun. - Oluktan sıvıyı pipet kullanarak çekiniz (tercihe göre vakum aspiratöre takılabilir). Güvenlik ve Çevre Potansiyel zararlı bileşenler hakkında bilgi için lütfen Güvenlik Bilgi Formuna(SDS) ve ürün etiketine bakınız. En güncel SDS versiyonu web sitesinde bulunmaktadır. Tehlike: Denatürasyon Çözeltisi H314 P260; P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P310 P363 Uyarı: 2-Chloroacetamide içerir: Durulama Çözeltisi 5x H317 P261 P280 P333+P313 P363 P302+P352 Tehlike: N,N-Dimethylformamide ve 5,5'-diphenyl-3,3'-bis(4-nitrophenyl)-2,2'-(3,3'-dimethoxybiphenyl-4,4'-ylene)ditetrazolium dichloride içerir: Substrat BCIP/NBT 100x H312 H319 H332 H360D P201 P261 P280 P281 P305+P351+P338 P308+P313

6 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v2 / ANAHTAR-KODU: FRI15250 p 6/12 Tehlike ifadeleri H312 H314 H317 H319 H332 H360D Önlem ifadeleri P201 P260 P261 P280 P281 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P308+P313 P310 P333+P313 P363 P302+P352 Cilde değmesi zararlıdır. Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına sebep olur. Alerjik deri reaksiyonuna neden olabilir. Ciddi göz tahrişine neden olur. Solunması halinde zararlıdır. Anne karnındaki bebeğe zarar verebilir. Kullanmadan önce özel talimatları edininiz. Duman / buhar / sprey teneffüs etmeyiniz. Duman / buhar / sprey solumaktan kaçınınız. Uygun koruyucu eldivenler/ koruyucu giysi/ göz koruyucu / yüz koruyucusu kullanın. Gerektiği gibi kişisel koruyucu ekipman kullanın. CİLDE GELMESİ HALİNDE (ya da saça): Atın/ kirlenmiş olan giysilerinizi hemen çıkarınız. Su /duş ile cildi durulayın. GÖZE GELMESİ HALİNDE: Birkaç dakika iyice suyla durulayınız. Mevcut ve kolay ise kontak lensleri çıkarın. Durulamaya devam edin. Maruz kalmış veya ilgili ise: Tıbbi tavsiye / yardım alın. Hemen ZEHİR MERKEZİ veya doktora / hekime başvurun. Ciltte tahriş veya kızarıklık olursa: Tıbbi tavsiye / yardım alın. Tekrar kullanmadan önce kirlenmiş giysileri yıkayın. CİLDE DEĞMESİ HALİNDE: Sabun ve bol su ile yıkayın. - Örnekler her zaman bulaşıcı olarak ele alınmalıdır. Bu nedenle, tüm kan bileşenleri ve biyolojik materyaller potansiyel bulaşıcı olarak kabul edilmeli ve bu şekilde ele alınmalıdır. Test prosedürünün yalnızca eğitimli personel tarafından gerçekleştirilmesine izin verilmelidir. - Tüm kan bileşenleri ve biyolojik materyaller, belirlenen güvenlik prosedürlerine uygun olarak imha edilmelidir C de en az 15 dakika boyunca otoklav. - Tek kullanımlık malzeme yakarak bertaraf ediniz. - Sıvı atıkları, son konsantrasyon ± 1% sodyum hipoklorit olacak şekilde sodyum hipoklorit ile karıştırınız. Atmadan önce gece boyunca bekletiniz. Dikkat: Asit içeren sıvı atıkları sodyum hipoklorit eklemeden önce nötralize ediniz. - Kişisel koruyucu ekipman kullanımı gereklidir: Tehlikeli ve bulaşıcı maddelerle çalışılırken eldiven ve koruyucu gözlük kullanılmalıdır. - Atıklar, kurumun atık imha kurallarına göre bertaraf edilmelidir. Tüm federal, eyalet ve yerel çevre yönetmelikleri de dikkate alınmalıdır. Örneklerin toplanması, işlenmesi ve saklanması DNA, insan serumu ve ya plazmasından elde edilebilir. Plazma örneklerinin hazırlanması ve saklanması: - EDTA içeren steril tüplere kan toplayın. Bir antikoagülan olarak heparin kullanmayın. - Üreticinin talimatlarına göre hücrelerden plazmayı ayırın. - Plazmayı -70 C de ve ya altında muhafaza edin. Yalnızca kullanım için çözünüz. Serum örneklerinin hazırlanması ve saklanması: - Antikoagülan bulunmayan steril tüplere ya da serum ayırıcı tüplerine kan toplayın. - Oda sıcaklığında kanın pıhtılaşmasına izin verin, santrifüj yapın ve üreticinin talimatlarına göre hücrelerden serumu ayırın. - Serumu -70 C de ve ya altında muhafaza edin. Yalnızca kullanım için çözünüz. HBV-pozitif örneklerden elde edilmiş DNA derhal kullanılmalı ya da -20 C de ve ya altında dondurulmalı, tercihen asla çözülüp yeniden dondurulmamalıdır. Böylece HBV-pol geni A-F etki alanı nın amplifiye edilmiş materyali oluşturulabilir. LiPA prosedürü için 10 µl amplifiye edilmiş ürün kullanın. Amplifikasyon test prosedürü DNA izolasyonu için Qiagen QIAamp DNA Kan Mini Kit (Kat. no: 51104) tavsiye edilir. Protokole bakın ve izole methodu için lütfen verilen talimatları izleyin. Piyasada mevcut diğer izolasyon yöntemlerini kullanırken yöntem laboratuarınızda doğrulanmalıdır. Amplifikasyon protokolü Aşağıda verilen protokol optimum amplifikasyon için aşağıdakiler kullanılarak tasarlanmıştır - Qiagen HotStarTaq polimeraz (5 U/µl). - Qiagen 10x PCR tampon (Tris-HCl, KCl, (NH 4 ) 2 SO 4, 15 mm MgCl 2 içerir, ph 8.7). - MikroAmp PCR tüpleri (0.2 ml ince-duvarlı tüpler; (Applied Biosystems Kat. no: N ). - GeneAmp PCR sistem PE-9700 termal döngü cihazı. (Applied Biosystems Kat. no: N ). Bu protokol çoğu ticari termal döngü cihazı ile kullanılabilir ancak cihazın üretici tarafından sağlanan bazı modifikasyonlara ihtiyaç duyulabilir.

7 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v2 / ANAHTAR-KODU: FRI15250 p 7/12 Sonuçları bozabilecek spesifik olmayan amplifikasyonları önlemek için aşağıdaki gerekli önlemleri alınız: - Aşağıda listelenmiş bileşenleri çözün ve buz üzerine yerleştirin. - Tüm pipetli adımları buz üzerinde geciktirmeden gerçekleştirin. 1. Hazırlanacak şişe sayısını(n) şu şekilde belirleyin: N = Örnek sayısı + İzolasyon için 1 Negatif Kontrol + PCR için 1 Negatif Kontrol + 1 Pozitif Kontrol + 1 extra. 2. Pamuk-tıkalı pipet uçları kullanılarak, otoklavlanmış nükleaz bulunmayan mikro santrifüj tüpü içine bir Ana Karışım hazırlayın. 3. Aşağıdakileri içeren bir Ana Karışım hazırlayın: (N x 22.2 µl) otoktavlı distile su + (N x 5.0 µl) Qiagen 10x PCR tampon + (N x 0.4 µl) dntp karışımı (25 mm) + (N x 1.0 µl) Primer Karışımı + (N x 1.0 µl) 25 mm MgCl 2 + (N x 0.4 µl) Qiagen HotStarTaq DNA Polimeraz 5 U/µl Yavaşça karıştırın ve ana karışımı 30-µl lik parçalar halinde otoklavlı (N-1) amplifikasyon tüpleri içine dağıtın µl saflaştırılmış DNA pipet ya da 20 µl distile su (DNA bulundurmayan Negatif Kontrol). Uyarı: Yavaşça karıştırınız ve sıvıyı tüplerin tabanına getirmek için karışımı yavaşça döndürünüz. 5. Örnekleri kalibre edilmiş termal bloklara yerleştirin (termal döngü cihazı üreticisi tarafından sağlanmış talimatlara bakınız ). INNO-LiPA HBV Multi-DR amplifikasyonu için tasarlanmış amplifikasyon programını başlatın. PE-9700 termal döngü cihazında INNO-LiPA HBV Multi-DR amplifikasyon profili: Adım Sıcaklık Zaman 1 Denatüre 95 C 15 dk. 2 Denatüre 94 C 30 sn. döngüyü tekrarlayın 3 Primerleri ısıl işlem 55 C 30 sn. adım Primerleri genişletme 72 C 40 sn. 50 kere 5 Uzatma 72 C 10 dk. 6 4 C ye soğutma 6. Amplifikasyon işleminden sonra, örnekleri derhal INNO-LiPA HBV Multi-DR test strip ile kullanın ya da 15/-25 C sıcaklıkta saklayın. 7. Bu işlemden sonra, 5 µl amplifiye edilmiş ürünü 2% agaroz jel üzerinde analiz ederek amplifikasyon kontrol edilebilir ya da -15/-25 C de saklanabilir. Not: Amplifiye edilmiş DNA ürünlerini amplifikasyon reaktifleri ya da izole edilmiş DNA ile saklamayınız. Amplifikasyon sonuçları Görüntüleme - Amplifiye edilmiş ürün varlığı, % 2 agaroz jel üzerinde kontrol edilebilir. - Slot başına 5 µl amplifiye ürün yükleyin. - Amplikon, 867bp uzunluğunda bir bant şeklinde görünmelidir. Kalite kontrol - Ekstraksiyon için en az bir blank dahil edin. - Her amplifikasyon uygulamasında en az bir pozitif bir negatif kontrol ekleyin. Herhangi yeni bir laboratuar prosedürü ile kaç tane pozitif ve negatif kontrol ilave edileceğine, prosedürü doğru şekilde gerçekleştirme yeteneği yüksek derece bir güven seviyesine ulaşılana kadar dikkat edilmelidir. Eğer pozitif kontrol eklenmesi istenirse, bilinen bir HBV-pozitif örnek kullanın. - Eğer jelde izolasyon için negatif kontrolde pozitif bant elde edildiyse, Bu çalışma sonuçlarını atmak, izolasyondan itibaren prosedür ve tekrar etmek tavsiye edilir. LiPA manual test prosedürü Örneklerin denatürasyonu Uyarı: Çalkalamalı su banyosunun sıcaklığının 49 C ± 0.5 C olduğundan kalibre edilmiş bir termometre kullanarak emin olun ve eğer gerekliyse numune tepsisi eklemeden sıcaklığı ayarlayın. 1. Çalkalamalı su banyosu sıcaklığını 49 C ± 0.5 C de dengeleyin. 2. Tüm kristalleri çözmek için Hibridizasyon ve sıkı yıkama solüsyonlarını C arası sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin. Su banyosunu 49 C ± 0.5 C geçmediğinden emin olun. Kullanmadan önce şişeyi çalkalayarak karıştırın. 3. Pozitif kontrol örneği yanı sıra, her zaman, izolasyon adımı için bir negatif kontrol örneği, PCR adımı için bir negatif kontrol örneği ve LiPA adımı için bir negatif kontrol örneği (bu strip için denatürasyon solüsyonuna örnek eklemeyin) eklemek tavsiye edilir. 4. Her örnek için, bir INNO-LiPA HBV DR v2 stribi ve bir INNO-LiPA HBV DR v3 stribi forseps kullanarak ilgili tüpten alınız. Kurşun kalem ile her strip üzerindeki markır çizgisinin üstüne bir kimlik numarası yazın. Not: Örneklerin hibritlenmesinde, 2. adıma geçene kadar oluklar içine stripleri yerleştirmeyin. 5. Tepsiye her örnek/strip için bir oluk yerleştirin. 6. Her oluğun üst köşesine 10 µl Denatürasyon Solüsyonu ekleyin. Not: Her kullanımın ardından denatürasyon solüsyonunu içeren şişeyi derhal kapatın. Havayla uzun süre temas solüsyonun bozulmasına neden olmaktadır. 7. Her olukta bulunan denatürasyon solüsyonuna 10 µl örnek (veya kontrol örneği) ekleyin. Pipetle yukarı aşağı hareketlerle dikkatlice karıştırın.

8 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v2 / ANAHTAR-KODU: FRI15250 p 8/12 8. Oda sıcaklığında, 5 dakika boyunca denatürasyona izin verin. Örneklerin hibridizasyonu 1. Her oluğa dikkatlice, diğer oluklara taşırmamaya özen göstererek, 2 ml Hibridizasyon solüsyonu ekleyin.reaktifleri karıştırmak üzere oluğu yavaşça sallayın. 2. Her örnek için, derhal, her strip için markır çizgi yukarıya gelecek şekilde oluğa her iki stripide yerleştirin. Not:Tek kullanımlık eldivenler giyin ve şeritleri alırken forseps kullanın. 3. Striplerin tamamen solüsyon içine daldırılmış olduğundan emin olun. Çapraz-bulaşmaya sebep olabileceğinden olukları sızdırmaz mikro plaklar ile kapatmayınız. 4. Tepsiyi 49 C ± 0.5 C sıcaklığındaki su banyosuna yerleştirin ve iki ağırlık arasına sabitleyin. Su banyosunu yaklaşık 80 rpm e ayarlayın, kapağı kapatın ve tepsiyi 60 dakika boyunca inkübe edin. Her şeridin tamamen batmış olduğundan ve serbestçe yüzebildiğinden emin olun. 5. Hibridizasyon inkübasyonu bittiğinde tepsiyi su banyosundan çıkartın. Striplerin yıkanması Uyarı: Kolay çıkarabilmek amacıyla, sıvının oluğun bir ucunda, stripleri işaret çizgisinin üzerinde toplayabilmek için tepsiyi küçük bir açıyla tutun. Stribin yüzeyine zarar vermeyin. Sıçramalardan ve solüsyonların oluklar arasından geçmesinden kaçının. 1. Tercihen bir vakum aspiratörüne bağlı olarak, bir pipet yardımıyla solüsyonu oluktan çekin. 2. Her oluğa 2 ml sıkı yıkama solüsyonu ekleyin ve 1dakika boyunca C sıcaklığında tepsiyi sallayarak stripleri durulayın. Solüsyonu her oluktan çekin. Not: Çoklu pipet kullanmak sıkı yıkama solüsyonunun dağıtılması için kullanışlı olacaktır. 3. Her oluğa 2 ml Sıkı yıkama solüsyonu ekleyerek yıkamayı ve 1 dakika boyunca C sıcaklığında tepsiyi sallayarak stripleri durulamayı tekrarlayın. Solüsyonu her oluktan çekin. 4. Her oluğa 2 ml Sıkı yıkama solüsyonu ekleyin, tepsiyi 49 C ± 0.5 C sıcaklığındaki sallamalı su banyosuna yerleştirin ve tepsiyi iki ağırlık arasında sabitleyin. Su banyosunu yaklaşık 80 rpm e ayarlayın, kapağı kapatın ve tepsiyi 30 dakika boyunca inkübe edin. 5. Çalışan durulama ve konjügat solüsyonlarını hazırlayın (Reaktiflere bakınız). Renk Geliştirme Uyarı: Kolay çıkarabilmek amacıyla, sıvının oluğun bir ucunda, stripleri işaret çizgisinin üzerinde toplayabilmek için tepsiyi küçük bir açıyla tutun. Striplerin yüzeyine zarar vermeyin. Sıçramalardan ve solüsyonların oluklar arasından geçmesinden kaçının. 1. Bir pipet yardımıyla solüsyonu oluktan çekin. 2. Her oluğa 2 ml çalışan durulama solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 1dakika boyunca tepsiyi sallayarak stripleri durulayın. Solüsyonu her oluktan çekin. Bu adımı bir kez tekrarlayın. 3. Her oluğa 2 ml çalışan konjugat solüsyonu ekleyin, tepsiyi çalkalayıcı(160 rpm de orbital ya da 50rpm de dalgalı) üzerine C sıcaklığında yerleştirin ve 30 dakika boyunca inkübe edin. Not :Çalışan bileşen solüsyonunu konjugat inkübasyonunun bitimine 10 dakika kala hazırlayın (Reaktiflere bakınız). 4. İnkübasyon tamamlandığında tepsiyi çalkalayıcıdan çıkarın ve pipet yardımıyla solüsyonu tüm oluklardan alın. 5. Her oluğa 2 ml çalışan durulama solüsyonu ekleyin ve 1dakika boyunca, C sıcaklığında, tepsiyi sallayarak stripleri yıkayın. Solüsyonu her oluktan çekin. Bu adımı bir kez tekrarlayın. 6. Her oluğa 2 ml çalışan bileşen tampon ekleyin ve 1dakika boyunca, C sıcaklığında, tepsiyi sallayarak stripleri yıkayın. Solüsyonu her oluktan çekin. 7. Her oluğa 2 ml çalışan bileşen solüsyonu ekleyin, C sıcaklığında çalkalayıcıya yerleştirin ve 30 dakika boyunca inkübe edin. 8. İnkübasyon tamamlandığında, stripleri yıkayarak renk geliştirmeyi durdurun: tepsiyi çalkalayıcıdan çıkartın, her oluktan solüsyonu çekip 2 ml damıtılmış su ekleyin ve tepsiyi en az 3 dakika için çalkalayıcıya yerleştirin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın. 9. Cımbız yardımıyla tüm şeritleri oluklarından çıkartın ve emici kağıt üzerine işaret çizgisi yukarı gelecek şekilde yerleştirin. 10. Sonuçları okumadan önce şeritleri tamamen kurutun. Geliştirilmiş ve kurutulmuş stripleri karanlıkta saklayınız. LiPA otomatik test prosedürü: Oto-LiPA ve Oto-LiPA 48 LiPA test prosedürü otomasyon adımları için son derece uygundur. Bu nedenle, Oto-LiPA ve Oto-LiPA 48 sıkı yıkama ve renk geliştirme adımlarını tam işleme hibridizasyonu için tasarlanmıştır. Oto-LiPA ve Oto-LiPA 48 otomatik ısıtma ve soğutma ve otomatik aspirasyon(emme) ve pipetleme ile kolayca adapte olabilen sistem özelliğindedir. Oto-LiPA ve Oto- LiPA 48 hakkında daha fazla bilgi ve özel protokoller için lütfen yerel distribütörünüze başvurun. LiPA sonuçları Okuma Şekil 1, INNO-LiPA HBV DR v2 strip üzerindeki farklı oligonükleotid problarının pozisyonlarını göstermektedir. Test prosedürünün sonunda görünür mor/kahve renkli bant oluştuğunda çizgi pozitif olarak değerlendirilir.

9 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v2 / ANAHTAR-KODU: FRI15250 p 9/12 Şekil 1: INNO-LiPA HBV DR v2 strip üzerinde, mavi renkli markır çizgisinin, konjügat kontrol çizgisinin (Konj. Kontrol),amplifikasyon kontrol çizgisinin(amp. Kontrol) ve 32 prob çizgisinin yerleri. Şekil 2 INNO LiPA HBV DR v3 strip üzerindeki farklı oligonükleotid problarının pozisyonlarını göstermektedir. Test prosedürünün sonunda görünür mor/kahve renkli bant oluştuğunda çizgi pozitif olarak değerlendirilir. Şekil 2: INNO-LiPA HBV DR v3 strip üzerinde, sarımsı renkli markır çizgisinin, konjügat kontrol çizgisinin (Konj. Kontrol),amplifikasyon kontrol çizgisinin(amp. Kontrol) ve 22 prob çizgisinin yerleri Kalite kontrol - En üstteki mavi çizgi (INNO-LiPA HBV DR v2 stribi üzerindeki) yada sarı çizgi (INNO-LiPA HBV DR v3 stribi üzerindeki), markır çizgisidir. Bu çizgi, stribin doğru yönde olduğunu doğrulamak içindir. - Her strip için, ilk renk geliştiren çizgi plastik okuma kartı üzerindeki "Konj. Kontrol" çizgisi ile dizilmiş olmalıdır. Bu çizgi, algılama işlemi sırasında reaktif konjugat ve bileşen solüsyonu ilavesini denetler. Aynı test içinde her strip üzerinde pozitif ve yaklaşık olarak aynı yoğunlukta olmalıdır. Eğer çizgi negatif ise, sonuç geçersiz olarak kabul edilmelidir. Bu durumda LİPA testini tekrarlamak tavsiye edilir. - İkinci renk geliştiren çizgi (okuma kartı üzerinde "Amp. kontrol") hibridizasyon için amplifiye edilmiş malzeme eklenmesini kontrol eder. Pozitif örnekler için, örnek içinde HBV nin uygun miktarı bulunuyorsa, doğru örnek işleme gerçekleşmiş ve amplifikasyon başarılıysa bu çizgi pozitif olmalıdır (probit analizi kullanılarak, INNO-LiPA HBV DR v2 'nin en alt limitinin tespiti 990 kopya/ml olarak bulundu (95%CI [454kopya/ml; 6327 kopya/ml]). Çizginin yoğunluğu örnekler arasında değişebilir, ve sonraki prob çizgisi sadece bu kontrol çizgi pozitif ise yorumlanmalıdır. Eğer çizgi pozitif örnek için negatif ise, örneğin viral yükü çok düşük olabilir, amlifikasyon inhibe edilmiş olabilir, ya da hiç amplikon eklenmemiş olabilir, ya da ekstrasyon yöntemi başarısız olmuş olabilir. Bu durumda, amplifikasyon veya ekstraksiyon dan başlayarak LİPA testinin tekrarlanması tavsiye edilir. Negatif kontrol örnekleri için bu çizgi negatif olmalıdır; Eğer bu çizgi pozitif ise-yada sonraki prob çizgisinin herhangi biri pozitif ise, -kontaminasyon meydana gelmiş olabilir. Bu durumda, negatif kontrol için amaçlanan tam çalışma sonuçlarının atılması tavsiye edilir. Pozitif kontrol örnekleri için bu çizgi pozitif olmalıdır (aynı zamanda beklenen wild-tip ya da mutant prob çizgisi); eğer bu çizgi negatif ise ekstrasyon, amlifikasyon, yada hibridizasyon başarısız olmuş olabilir. Bu durumda pozitif kontrol için amaçlanan tam çalışma sonuçlarının atılması tavsiye edilir. Sonuçların yorumlanması - Eğer çizgi 1 ( Konj. kontrol ) pozitif ise sonuç yorumlanması düşünülür. Eğer çizgi 1 negatif ise, strip yorumlanmamalıdır. - Eğer sonuç yorumlanabilir ve çizgi 2 ( Amp.kontrol ) pozitif ise ("Kalite kontrol" bölümüne bakınız) sonuç pozitif düşünülür. Bu durumda wild- tip ve mutant prob çizgisi her sitribde yorumlanmalıdır. Eğer bu Amp.kontrol çizgisi negatif ise, sonraki prob çizgisi yorumlanmamalıdır. - Pozitif prob çizgisi aşağıdaki tablolarda listelendiği gibi ilgili kodonlarda wild- tip yada mutant sekansı ile karşılık gelir. Her kodon için bir wild-tip yada mutant çizgisi pozitif olması gerekir.. - Belirli bir kodonda ya da çevresinde oluşacak nadir bir polimorfizm bu belirli kodon için INNO-LiPA HBV DR v2 yada v3 strip üzerindeki herhangi bir probda hibridizasyon yokluğuna neden olabilir. Bu durumda, test söz konusu kodon hakkında bilgi vermez: Hem wild tip hem de mutant çizgisinde "çift blank". Ancak kalan kodonlar bağımsız olarak okunabilir. Bu durumda özellikle Amp. kontrol çizginin yoğunluğu zayıf ise, ekstrasyon yada amplifikasyondan başlayarak tercihen LİPA deneyinin tekrarlanması tavsiye edilir. - Nadiren, (çoğunlukla) tüm bantlar zayıf pozitif reaktivite gösterebilir ("zebra deseni"). Bu durumda, sonuçlar geçersiz düşünülür. Ekstrasyon yada amplifikasyondan başlayarak tercihen LİPA deneyinin tekrarlanması tavsiye edilir.

10 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v2 / ANAHTAR-KODU: FRI15250 p 10/12 INNO-LiPA HBV DR v2 strip sonuçları: Çizgi Kodon pozisyon Polimeraz Amino asit Polimeraz Wild tip /Mutant Polimeraz 3 80 L Wild tip 4 80 L Wild tip 5 80 V Mutant 6 80 I Mutant 7 80 I Mutant V Wild tip G Wild tip L Mutant /181 L / A Wild tip / Wild tip /181 L / T Wild tip /Mutant /181 L / T Wild tip /Mutant /181 L / V Wild tip /Mutant /181 M / A Mutant/ Wild tip /181 M / T Mutant/Mutant /181 M / V Mutant/Mutant M Wild tip M Wild tip V Mutant V Mutant I Mutant I Mutant I Mutant S Mutant N Wild tip N Wild tip N Wild tip N Wild tip N Wild tip T Mutant T Mutant T Mutant T Mutant INNO-LiPA HBV DR v3 strip sonuçları: Çizgi Kodon pozisyon Polimeraz Amino asit Polimeraz Wild tip /Mutant Polimeraz T Wild tip SCGA Mutant SCGA Mutant SCGA Mutant SCGA Mutant ILFM Mutant ILFM Mutant ILFM Mutant A Wild tip T Mutant S Wild tip G Mutant C Mutant I Mutant M Wild tip M Wild tip V Mutant V Mutant I Mutant I Mutant L Mutant L Mutant Performans Özellikleri Kullanılan kısaltmalar: CI = güven aralığı; LL = alt sınır; UL = üst sınır; WT = wild tip; MT = mutant; IND = belirsiz; seq = sıralama

11 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v2 / ANAHTAR-KODU: FRI15250 p 11/12 INNO-LiPA HBV Multi-DR test performasının testi (INNO-LiPA HBV DR v2 ve INNO-LiPA HBV DR v3 strips) dahili ve iki harici merkez de değerlendirilmiştir (Fransa ve İtalya). Başarı oranı ve uyuşma Başarı oranı ve anlaşma iki harici merkezde (Fransa ve İtalya) HBV enfekte hastadan 204 serum örneği üstünde değerlendirilmiştir. Viral yük 103 örnek için biliniyordu. 13 örnek 990 kopya/ml aşağısında viral yüke sahipken, (aralık kopya / ml) 90 örnek 990 kopya/ml üzerinde viral yüke sahipti. % 32.4 'ü doğal tedavi iken hastaların % 67.6 sı kan örnekleme zamanında HBV tedavisi altındaydı. Başarı oranı Başarı oranı test edilen HBV pozitif örneklerin toplam sayısı dışında stripte (strip üzerinde pozitif bir amplifikasyon kontrol çizgisiyle) yorumlanabilir sonuçla örneklerin sayısı olarak tanımlanır. İlk amlifikasyon sonrasında INNO-LiPA HBV DR v2 striplerin üzerinde yorumlanabilir sonuç 204 örneğin dışında 201 i için elde edildi, % 98.5 ilk başarı oranı ile sonuçlanarak (201/204; %95 CI LL = %96.4). Bu üç örneğin yeniden amlifikasyonu ve/veda yeniden ekstrasyonunun tekrar testten sonra INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri için %100 (204/204; %95 CI LL = %98.7) başarı oranı ile başarılı şekilde sonuçlandığı bulunmuştur. İlk amlifikasyon sonrasında INNO-LiPA HBV DR v3 striplerin üzerinde yorumlanabilir sonuç 204 örneğin dışında 200 ü için elde edildi, % 98 (200/204; %95 CI LL = %95.7) ilk başarı oranı ile sonuçlanarak. Bu dört örneğin yeniden amlifikasyonu ve/yada yeniden ekstrasyonunun tekrar testten sonra INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri için %100 (204/204; %95 CI LL = %98.7) başarı oranı ile başarılı şekilde sonuçlandığı bulunmuştur. Dizileme ile uyuşma Referans sıralaması sonucu olarak bu analizden hariç tutulan bir örnek mevcut değildi. INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri üzerinde test edilen 203 HBV pozitif örnek arasında, ilk testten sonra %7.9 (16/203; %95 CI UL = %11.6) belirsizlik sonuçlanarak 16 belirsiz sonuç gözlendi. Bu 16 örneğin yeniden amplifikasyon ve / veya yeniden ekstrasyonu tekrar testten sonra INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri için %4 (8/203; %95 CI UL = %6.9) ü belirsizlikle sonuçlaranak 8 örnek için başarılı bulundu. 203 HBV pozitif örnek arasında INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri üzerinde test edildi, ilk testen sonra %11.3 (%23/203; %95 CI UL = %15.5) belirsizlikle sonuçlanarak, 23 belirsiz sonuç gözlendi. Bu 23 örneğin yeniden amplifikasyon ve / veya yeniden ekstrasyonu tekrar testten sonra INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri için %3.5 i (7/203; %95 CI UL = %6.2) belirsizlikle sonuçlanarak 16 örnek için başarılı bulundu. Elektroferogramın doğrulanmasından sonra, tüm belirsiz sonuçlar prob bölgesinde bitişik kodon içinde polimorfizm ile açıklanabilir, amllifiye edilmiş materyal INNO-LiPA HBV DR v2 strip ya da INNO-LiPA HBV DR v3 stribi üzerinde kaplı LİPA problara hidribize olamaz. Dizileme ile tanı uyuşması strip üzerinde yorumlanabilir sonuç ile örneklerin toplam sayısı tarafından bölünerek uyumlu örnek sayısı olarak hesaplandı. Uyumlu sonuç örneğinin %91 (185/203; 95% CI LL = 87.29%) için INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri için dizileme ile karşılaştırılarak elde edildi. Kodon seviyesinde, INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri %91,5 (1115/1218) durumu içinde aynı amino asit bilgisini verdi ve INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri %5.4 (66/1218) içinde ek bilgi verdi. INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri için tamamen farklı sonuç dizileme ile karşılaştırılarak örneklerin %8.87 si (18/203; %95 CI UL = %12.72) elde edildi. Uyuşmazlığı test ettikten sonra, %97.5 i(198/203; %95 CI UL = %98.5) bir anlaşma ile sonuçlanan, bu 18 örnek 13 örnek için uyumlu sonuç verdi. 5 örnek INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri için uyumsuz kaldı. Uyumsuz 18 örneğin 11 i yeni DNA ekstraktı kullanılarak yeniden dizildi. Yeni DNA ekstratı dizileme sonuçları 11 örneğin dışında 6 örnek için ilk LİPA ile uyumluydu. Uyumlu sonuç örneğinin %100 (203/203; %95 CI UL = %98.7) için INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri için dizileme ile karşılaştırılarak elde edildi. INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri %96.7 (785/812) durumu içinde aynı amino asit bilgisini verdi ve INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri %0.5 (4/812) içinde ek bilgi verdi. Anlaşma sonuçları kodon seviyesinde aşağıdaki tabloda özetlenmiştir. Strip Kodon Uyumlu Uyumsuz IND on Aynı Aynı MT LiPA üstünde WT Diff Seq üstünde LiPA WT MT WT+MT MT ekleme MT MT MT ekleme v Toplam v

12 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v2 / ANAHTAR-KODU: FRI15250 p 12/12 Strip Örnek tipi Uyumlu Uyumsuz LİPA Kodon Aynı Aynı MT LiPA üstünde WT Diff seq üstünde üstünde WT MT WT+MT MT ekleme MT MT MT ekleme IND Toplam DNA örneği HBV pozitif bireylerin plazma örneklerinden elde edildi, INNO-LiPA HBV Multi-DR nin bir lotu dahili olarak test edildi. Bütün 24 HBV pozitif örnekler, her strip için %100(24/24; %95 CI [%85.8, %100.0]) başarılı sonuçla sonuçlanarak, INNO- LiPA HBV DR v2 ve INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri üzerinde yorumlanabilir sonuç verdi (strip üzerinde pozitif amplifikasyon kontrol çizgisi ile). Otomasyon HBV pozitif bireylerin 30 DNA örneği dahili olarak,ayrıca manuel olarak 3 cihaz üstünde (Oto- LiPA 30, Oto-LiPA 48 ve OtoBlot), INNO-LiPA HBV Multi-DR bir lotu üstünde test edildi. Stripte amplifikasyon kontrol çizgisi olarak analizden hariç tutulan bir örnek dört test prosedürün hepsi için negatifti ve negatif amlifikasyon kontrol çizgisi ile bir strip yorumlanabilir değildir. INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri için, Otoblot cihazında test yapılırken bir örnek kodon 236 için belirsiz sonuç verdi. Bu Oto- LiPA 30 ve Oto-LiPA 48, ve Oto-LiPA 30 ve manual test prosedürü arasında %100 (29/29; %95 CI [%88.1, %100.0]) uyum olarak sonuçlandı. INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri için Oto-LiPA 30 ve OtoBlot arasında uyum %96.6 dır (28/29; %95 CI [%82.2, %99.9]). INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri için, tüm metotlar arasında %100 uyum (29/29; %95 CI [88.1%, %100.0]) elde edilmiştir. Klinik özgünlük HBV negatif bireylerin serum örneklerinden çıkarılan 100 DNA örneği, INNO-LiPA HBV Multi-DR nin bir lotu üstünde dahili test edildi. 100 HBV negatif örnekleğin hepsi, her strip için %100(100/100; %95 CI [%96.4, %100]) klinik özgünlükle sonuçlanarak, INNO-LiPA HBV DR v2 ve INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri üstünde negatif LİPA modeli verdi. Kesinlik Yedi DNA örneği dahili ve iki harici sitede test edildi (Fransa ve İtalya). Örnekler farklı operatörler tarafından, farklı günlerde üç farklı lot primer kullanılarak iki kopya halinde amplifiye edilmiştir. Bu amplifiye edilmiş ürünler farklı operatörler tarafından, farklı günlerde, farklı oto-lipa cihazları kullanılarak INNO-LiPA HBV Multi-DR nin üç farklı lotunda test edilmiştir. INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri için % 99.5 uyum (193/194) elde edilmiştir. Uyumsuz sonuç ile bir tekrar testin kabul edilen reaktivite değişim aralığı içindedir. INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri için %100 uyum (194/194) elde edilmiştir. Prosedürün kısıtlamaları - Bu kitin kullanımı HBV nükleik asit izolasyonu, amplifikasyonu ve hibridizasyonu teknikleri konusunda eğitim almış personel ile sınırlandırılmalıdır. - İyi laboratuar uygulamaları ve tanımlanmış prosedürün dikkatlice uygulanması spesifik amplifikasyon sağlar. - HBV infekte örneklerinden kaynaklanan zaman zaman çok yüksek viral yük nedeniyle bulaşmayı önlemek nedeniyle yüksek miktarda önlem almak gerekmektedir. - Polimeraz inhibisyonu (örn. Heparin, hemoglobin sebebiyle) tüm testin başarısız olmasına neden olabilir. - Tek kullanımlık eldivenlerin pudrası ve sodyum hipoklorit amplifikasyon inhibisyonuna neden olabilir. Ticari markalar - INNO-LiPA ABD de olduğu gibi dünya çapında bir markadır. - LiPA Benelüks'te tescilli markadır ve dünyanın geri kalanında markadır (ABD dahil). - Auto-LiPA ABD de olduğu gibi dünya çapında bir markadır. - GeneAmp ve MicroAmp Applied Biyosistemlerin tescilli markalarıdır, LLC. - Qiagen, QIAamp QIAGEN Grubun tescilli markalarıdır. - Eppendorf Eppendorf AG tescilli markasıdır, DE.