INNO-LiPA HBV Multi-DR

Transkript

1 ANAHTAR-KODU: FRI INNO-LiPA HBV Multi-DR v p 1/18 Türkçe INNO-LiPA HBV Multi-DR Tarafından üretildi: Fujirebio Europe N.V. Technologiepark Gent Belgium Tel BTW BE RPR Gent Tarafından dağıtılan: Fujirebio Europe N.V. Tel Fax customer.support@fujirebio-europe.com Fujirebio Germany GmbH Tel Fax germany@fujirebio-europe.com Fujirebio France SARL Tel Fax france@fujirebio-europe.com 0459 Fujirebio Italia S.r.l. Tel Fax italy@fujirebio-europe.com Fujirebio Iberia S.L. Tel Fax spain@fujirebio-europe.com "Vurgulanan Not değişiklikleri" Diğer Dillere bakınız / Autres langues voir / Andere Sprachen siehe / Altre lingue vedere / Ver otros idiomas / Outras línguas ver: AVRUPA GR IS LT RO SK TR LI MT EE non-europe US CA AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU :00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Europe N.V

2 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 2/18 İÇİNDEKİLER Kullanılan Semboller... 2 Kullanım amacı... 3 Test prensibi... 3 Reaktifler... 4 Açıklama, kullanım için hazırlanması ve önerilen depolama koşulları... 4 Verilen Reaktifler:... 4 Gerekli ama sağlanmayan malzemeler... 5 Amplifikasyon... 5 LiPA... 6 UYARILAR VE ÖNLEMLER... 6 Güvenlik ve Çevre Koşulları... 7 Örnek toplama, kullanma ve saklama... 8 Amplifikasyon test prosedür... 8 Amplifikasyon protokol... 9 Amplifikasyon sonucları Görüntüleme Kalite Kontrol LiPA manual test prosedür Numunelerin denatürasyonu Numunelerin hibridizasyonu Striplerin yıkanması Renk gelişimi Otomatik test prosedürü: LiPA sonucları Okuma Kalite Kontrol Sonucların yorumlanması Performans özellikleri Başarı oranı ve uyuşma Örnek Tipleri Otomasyon Klinik özgüllük Kesinlik Prosedür sınırlamaları Ticari markalar Kullanılan Semboller Üretici In Vitro Diagnostic Medikal Cihaz Parti kodu Katalog numarası Tarafından Kullanılan Kullanım Talimatlarına başvurun Sıcaklık sınırlaması <n> testleri için yeterli içerir

3 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 3/18 Amplifikasyon (AMP) reaktifleri: Birincil Karışım LiPA reaktifler: Konjugat 100x Kullanım amacı Konjugat Diluent Denatürasyon Çözeltisi Hibridizasyon Çözeltisi Durulama Çözeltisi 5x Sıkı Yıkama Çözeltisi Stripler Substrat BCIP/NBT 100x Substrat Tampon Tehlike Uyarı: INNO-LiPA HBV Multi-DR insan serum ya da plazma örnekleri üzerinde kullanım için in vitro ters hibridizasyon çizgi probu testidir. INNO-LiPA HBV Multi-DR kullanılarak HBV polimeraz geninin kodon 80, 173, 180, 181, 184, 194, 202, 204, 236 ve 250 sinde wild tip, mutasyonlar veya polimorfizmler aynı anda tespit edilebilir. Test prensibi Hepatitis B virüsü (HBV), RNA üzerinden eşlenen, kısmi çift sarmallı DNA virüsüdür. Prosedürün birinci adımı, viral DNA nın örnekten izole edilmesidir. Saflaştırılmış DNA daha sonra, biyotinlenmiş PCR primerleri kullanılarak bir çevrim PCR üzerine amplifiye(yükseltme) edilir. Bu testte kullanılan primerler HBV polimeraz geninin bir parçasını(a-f etki alanı) amplifiye eder. Hedef dizileri primerlere maruz bırakmak için ısıtılmak suretiyle DNA sarmalının iki ipi birbirinden ayrılır ( denatürasyon ). Bu oligonükleotid primerler, hedef bölgeye komşu olan korunmuş bölgelere tamamlayıcı niteliktedir. Bu nedenle, belirli bir sıcaklığa kadar soğutulduktan sonra, primerler, hedef bölgesine (tavlama) bağlanacaktır. Artan sıcaklıkta, dntp lerin varlığında, thermostable DNA polimeraz hedef şablon boyunca bağlanan primerleri uzatır (uzama). Bir döngü denatürizasyon, ısıl işlem ve genişletme işlemlerinin ardından şablonun birebir kopyası üretilir. Bu uygulama, 50 döngü için tekrarlanır, böylece, 867 bp, lik, çoklu-kat amplifiye edilmiş hedef sekans elde edilmiş olur. Amplifikasyon (güçlendirme/yükseltme) ardından, HBV polimeraz geninden elde edilen biyotinlenmiş DNA maddesi, membran bazlı şeritlerde paralel çizgiler şeklinde sabitlenmiş spesifik oligonükleotid problar ile hibridize edilmiştir. Hibridizasyon (melezleştirme) işleminin ardından, bağlanmamış DNA, strip üzerinden yıkanır. Sıkı yıkamadan sonra alkalin fostatazlı streptavidin konjugat eklenir ve önceden şekillenmiş herhangi bir biotinlenmiş hibrite bağlanır. BCIP/NBT kromojen ile inkübasyon mor/kahverengi çökelme ile sonuçlanır.

4 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 4/18 INNO-LiPA HBV DR v2 stribi, bir mavi markır çizgisi, 2 kontrol çizgisi ve 32 paralel prob çizgisinden oluşmaktadır. INNO- LiPA HBV DR v3 stribi bir krom/sarımsı markır çizgi, 2 kontrol çizgisi ve 22 paralel prob çizgisinden oluşmaktadır. Konjügat kontrol çizgisi, renk gelişim reaksiyonunu kontrol amaçlıdır ve amplifikasyon kontrol çizgisi, yükseltilmiş HBV genomik maddesinin varlığını kontrol edebilmek için evrensel HBV problarını içermektedir. Reaktifler Açıklama, kullanım için hazırlanması ve önerilen depolama koşulları AÇIKLAMA: Amplifikasyon ve LiPA reaktifleri ulaştıklarındaki doğru sıcaklıkta muhafaza edilmelidir: öncül amplifikasyon alanında amplifikasyon reaktifleri ve post-amplifikasyon (sonrasında) alanında LiPA ayraçları C de saklanmışsa, açılmış veya açılmamış, reaktifler son kullanma tarihine kadar kararlıdır. Son kullanma tarihinden sonra reaktifleri kullanmayın. - Kontaminasyonu önlemek için, ilk kullanımda amplifikasyon reaktiflerinin porsiyonlanması önerilir. - Reaktifler özellikle amplifiye edilmiş ürünler DNA kontaminasyonuna sebep olacak kaynaklardan korunmalıdır. Tek kullanımlık tüpler ve pipet uçları (tercihen pamuk filtreli) kullanılmalıdır. - Tüm reaktifler kullanımdan önce yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığına (20-25 C) getirilmiş olmalı ve kullanımdan hemen sonra buzdolabına kaldırılmalıdır. Kısaca vorteksleyin ve şişeleri açmadan önce tüm reaktifleri aşağı doğru döndürün. Kullandıktan sonra şişenin kapağını derhal kapatın. - Kit reaktiflerin fiziksel görünümündeki değişiklikler istikrarsızlık veya bozulma belirtisine neden olabilir. - Striplerin kullanımdan önce kıvrılmasını önlenmesi için plastik tüplerin yatay olarak saklanması önerilir. Verilen Reaktifler: Bileşen Miktar Ref. Açıklama Amplifikasyon reaktifleri: Birincil Karışım 1x 0.04mL Koruyucu olarak 0.05% NaN3 ile biotinlenmiş primerler içerir. LiPA reaktifler: Stripler 1x 20 Denatürasyon Çözeltisi Hibridizasyon Çözeltisi 1x Mavi markır çizgisi ile işaretlenmiş INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri içeren 1 plastik tüp. Kırmızı markır çizgisi ile işaretlenmiş INNO-LiPA HBV Genotipleme stripleri içeren 1 plastik tüp. 1x 1 ml EDTA içeren alkalin çözeltisi. Dikkat: Denatürasyon Çözeltisi içeren şişenin kapağı kullanımdan hemen sonra kapatılmalıdır; havaya uzun süre maruz kalmak içeriğin hızla bozulmasına sebep olur. 1x 80 ml SSC-tampon ile deterjanlar ve koruyucu içerir. Hibridizasyon solüsyonu en az 37 C kadar ve 49 C aşmadan önceden ısıtılmalıdır. Sıkı Yıkama Çözeltisi 1x 200 ml SSC-tampon ile deterjanlar ve koruyucu içerir. Sıkı yıkama solüsyonu en az 37 C ye önceden ısıtılmalı ve 49 C yi geçmemelidir. Konjugat 100x 1x 0,8 ml Kullanımdan önce Konjugat Seyreltici içinde 1/100

5 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 5/18 Bileşen Miktar Ref. Açıklama seyreltilecek protein stabilizatörleri ve koruyucu olarak 0.01% MIT/<0.1% CAA içeren Tris tamponunda alkalin fosfataz ile etiketlenmiş streptavidin. Her test oluğu için 2 ml Konjugat çalışma solüsyonu hazırlayın + 2 ml fazladan. Auto-LiPA için 10 ml fazla hazırlayın. Konjugat çalışma tamponu oda sıcaklığında ( C) karanlıkta korunduğu süre içerisinde 24 saat kararlıdır. Konjugat Diluent 1x 80 ml NaCl, Triton, protein stabilizatörleri ve koruyucu olarak 0.01% MIT/<0.1% CAA içeren fosfat- tamponu. Substrat BCIP/NBT 1x 0,8 ml Kullanımdan önce Dimetilformamid içinde 5-brom-4-klor- 100x 3-indolilfosfat ve 4- nitro-mavi tetrazolyum, 1/100 oranında Bileşen tampon içinde seyreltilir. Her test oluğu için 2 ml substrat çalışma solüsyonu hazırlayın + 2 ml fazladan. Auto-LiPA için 10 ml fazla hazırlayın. Substrat çalışma solüsyonu karanlıkta saklanırsa oda sıcaklığında (20-25 C) 24 saat stabildir. Substrat Tampon 1x 180 ml NaCl, MgCl2 ve koruyucu olarak 0.01% MIT/<0.1% CAA Durulama Çözeltisi 5x içeren Tris-tamponu. 1x 80 ml NaCl, Triton ve koruyucu olarak 0.05% MIT/0.48% CAA içeren fosfat tamponu. Kullanımdan önce distile ya da deiyonize suda 1/5 (1 bölüm + 4 bölüm) seyreltilecek. Her test oluğu için 8 ml Durulama çalışma solüsyonu hazırlayın + 10 ml fazladan. Auto-LiPA için, test oluğu başına 12 ml Durulama çalışma solüsyonu hazırlayın +20 ml fazladan. Durulama Çalışma Çözeltisi C de iki hafta kararlıdır. İnkubasyon tepsisi 3 - Her biri sekiz küvet içerir. Okuma kartı 1 - Pozitif probların tanımlanması için. Veri raporlama sayfası 2 - Kullanılan striplerin saklanması için. Gerekli ama sağlanmayan malzemeler - Tek kullanımlık eldiven. - Tek kullanımlık steril pipet uçları (tercihen pamuk filtreli). - Steril mikrotüpler. - Mikrotüp rakları. - Microtüp santrifüjü. - Dağıtım için ayarlanabilir pipetler 1-20 µl, µl ve µl - Otoklavlanmış distile su. Amplifikasyon Amplifikasyon için, Qiagen HotStarTaq DNA polimeraz (Cat. no: ) ve 10x PCR tampon (Cat. no: ) kullanımı önerilmektedir. (Cat. no:203203), 10x PCR buffer (Cat. no: ) tavsiye edilir. - DNA termal döngü ve ekipmanları. - dntp ler (25 mm) - MgCl2 (25 mm) - Qiagen 10x PCR buffer (Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, 15 mm MgCl2, ph 8.7 içerir).

6 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 6/18 - Qiagen HotStarTaq DNA polimeraz. LiPA - Aspirasyon aparatları. - Kalibre edilmiş termometre. - Forsepsler. - Dereceli silindirler (10, 25, 50, ve 100 ml). - Zamanlayıcı, (2 saat ± 1 dakika). - Vorteks mikser veya eşdeğer. - Çalkalayıcı platformlu su banyosu (80 rpm; eğimli kapak; sıcaklığı en az 49 C ± 0.5 C ye ayarlanabilen). - Orbital çalkalayıcı (160 rpm) veya rocker çalkalayıcı (50 rpm). Opsiyonel materyaller: - Dağıtıcı çok kanallı pipet (Multipipet, Eppendorf veya eşdeğer). - Şerit işlem adımlarının otomasyonu için ekipmanlar (Auto-LiPA veya Auto-LiPA 48). Ayrıntılar için distribütörünüzle temasa geçin. UYARILAR VE ÖNLEMLER - Sadece profesyonel kullanım için. - Amplifikasyon prosedürü için otoklavlanmış tüpler ve pipet uçları kullanılmalıdır. Pamuk tıpalı pipet uçları önerilir. Sadece tek kullanımlık laboratuvar malzemeleri kullanın. - Her numune porsiyonu için yeni bir steril pipet ucu kullanın. - Bileşenler aynı lot numaralarına sahip olmadığı sürece, farklı kitlerin reaktiflerini karıştırmayın. - PCR kontaminasyonunu önlemek için, öncesi ve sonrası-amplifikasyon adımlarının fiziksel ayrımını maksimize edin. - Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri önceki adımın yapıldığı bölgeye/alana geri döndürmeyin. Bir önceki çalışma alanına dönülmesi gerekiyorsa, öncelikle uygun dekontaminasyon adımları gerçekleştirin. - Stripleri işlemek için forsepsler kullanın ve tek kullanımlık eldivenler giyinin. Çıplak ellerinizle şeritlere dokunmayınız. - Striplerin üzerinde yazmak için yalnızca kurşun kalem kullanın. Tahlil reaktifleri şeritler üzerindeki mürekkebi çıkarabilir. - Doğru sonuçlar için, Hibridizasyon ve yıkama adımları için su banyosunun sıcaklığınını 49 C ± 0.5 C ölçün. Sıcak hava çalkalayıcısı kullanmayın. Kesin bir sıcaklık kontrolü gerektiğinden, kalibre edilmiş bir termometre kullanın. Sıcaklığı korumak için her zaman su banyosunun kapağını kapalı tutunuz. Sıcaklık çok düşük ise, test yalancı pozitif sonuçlar doğurabilir; sıcaklık çok yüksek ise çok zayıf sinyaller veya yalancı negatif sonuç görülebilir. Optimum sıcaklık kontrolü için eğimli kapaklı, çalkalamalı bir su banyosu kullanın. - Renk gelişimi esnasında orbital veya sallanan çalkalayıcı tarafından hibridizasyon ve sıkı yıkama esnasında çalkalayıcı su banyosu tarafından meydana gelen hareket önemlidir. Reaktiflerin şeritler üzerindeki hareketini maksimize etmek ve tepsilerdeki oluklar arasında sıçramaları önlemek için bu cihazların hızlarının dikkatlice ayarlanması gerekmektedir.

7 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 7/18 - Su banyosundan oluklara su sıçramasından kaçının. Su banyosundaki su seviyesini tepsi yüksekliğinin yarısı ile üçte biri kadar olacak şekilde ayarlayınız. Tepsiyi, Kaymasını önlemek için ağırlıklar kullanarak sabitleyiniz. - Yıkama aşamaları arasında striplerin kurumasına izin vermeyin. - Prosedür boyunca her şeridi aynı olukta tutun. - Pipet kullanarak oluktan sıvıyı aspire edin (vakum aspiratöre takılabilir). - Olukları tekrar kullanmayın. Güvenlik ve Çevre Koşulları Lütfen Material Safety Data Sheet (SDS) ve potansiyel tehlikeli komponentler içeren işaretli ürün bilgilerini inceleyiniz. En son güncellenen SDS versiyonu almaktadır. Tehlike Uyarı. Tehlike Tehlike Açıklamaları H312 H314 H317 H319 H332 H360D Önlem ifadeleri: P201 P260 P261 P280 P302+P352 P303+P361+P353 P305+P351+P338 Sodyum hidroksit içerir H314 P260-P280-P303+P361+P353-P305+P351+P338-P310-P363 2-Kloroasetamid içerir H317 P261-P280-P302+P352-P333+P313-P362+P364 N,N-Dimethylformamide, 5,5'-diphenyl-3,3'-bis (4-nitrophenyl)-2,2'-(3,3'-dimethoxybiphenyl-4,4'-ylene)ditetrazolium dichloride ve metanol içerir H312-H319-H332-H360D P201-P261-P280-P303+P361+P353-P305+P351+P338-P308+P313 Cilt ile temasta zararlı. Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına neden olur. Allerjik deri reaksiyonuna neden olabilir. Ciddi derecede göz tahrişine neden olur. Solunması halinde zararlıdır. Fetüsa zarar verebilir. Kullanmadan önce özel talimatlar elde ediniz. Duman/buhar/sprey solumayın. Duman/buhar/sprey solunmaktan kaçının. Koruyucu eldiven/koruyucu giysi/göz koruyucu/yüz koruyucusu kullanın. Cilt temasında: Bol su ve sabun ile yıkayın. Cilt temasında(veya saç): Derhal tüm bulaşmış olan kıyafetleri çıkarın. Su/duş ile cildi durulayın. GÖZ TEMASINDA: Dikkatlice bir kaç dakika sudan geçiriniz. Mevcut ve kolaysa kontakt lensleri çıkarın. Yıkamaya devam edin.

8 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 8/18 P308+P313 Maruz kaldığınızda veya endişenlendiğinizde: Tıbbi yardım/destek alın. P310 Hemen bir ZEHİR MERKEZİ/doktor/... başvurun. P333+P313 Ciltte tahriş veya kızarıklık meydana gelirse: Tıbbi yardım/destek alın. P362+P364 Kirlenen giysileri çıkartın ve tekrar kullanmadan önce yıkayın. P363 Tekrar kullanmadan önce kontamine olmuş giysileri yıkayın. - Sadece yeterince eğitimli personel test prosedürünü yapmak için izinli olmalıdır. - Numuneler her zaman potansiyel bulaşıcı olarak ele alınmalıdır. Bu nedenle tüm kan bileşenleri ve biyolojik materyaller olası bulaşıcı gibi düşünülmeli ve öyle ele alınmalıdır. - Tüm kan bileşenleri ve tüm biyolojik materyaller güvenlik koşullarına uygun olarak atılmalıdır. 121 C de 15 dakika otoklavlanmalıdır. Tek kullanımlık malzemeleri yakınız. Nihai konsantrasyon ±% 1 sodyum hipokloritli olacak şekilde,sıvı atığı sodyum hipoklorit ile karıştırın. Bertaraf etmeden önce bir gece bekletin. Dikkat: Asit içeren sıvı atığı sodium hipoklorit eklemeden önce nötralize edin. - Kişisel koruyucu ekipman kullanımı gereklidir: Tehlikeli veya bulaşıcı ajanlar işlenirken eldiven ve koruyucu gözlük kullanılmalıdır. - Atık, kurumun atık bertaraf kurallarına göre ele alınmalıdır. Tüm federal, eyalet ve yerel çevresel düzenlemeler de dikkate alınmalıdır. Örnek toplama, kullanma ve saklama DNA, insan serumu ve ya plazmasından elde edilebilir. Plazma örneklerinin hazırlanması ve saklanması: - EDTA içeren steril tüplerde kanı toplayın. AN-ntikoagulan olarak heparin kullanmayın. - Üreticinin talimatlarına göre hücrelerden plazmayı ayırın. - Plazmayı -70 C veya altında muhafaza edin. Yalnızca kullanım için çözünüz. Serum örneklerinin hazırlanması ve saklanması: - Antikoagülan bulunmayan steril tüplerde ya da serum ayırıcı tüplerde kanı toplayın. - Oda sıcaklığında kanın pıhtılaşmasına izin verin, santrifüj edin ve üreticinin talimatlarına göre hücrelerden serumu ayırın. - Serumu -70 C veya altında muhafaza edin. Yalnızca kullanım için çözünüz. HBV-pozitif örneklerden elde edilmiş DNA derhal kullanılmalı ya da -20 C de ve ya altında dondurulmalı, tercihen asla çözülüp yeniden dondurulmamalıdır. Böylece HBVpol geni A-F etki alanı nın amplifiye edilmiş materyali oluşturulabilir. LiPA prosedürü için 10 µl amplifiye edilmiş ürün kullanın. Amplifikasyon test prosedür DNA izolasyonu için Qiagen QIAamp DNA Kan Mini Kit (Cat. no: 51104) tavsiye edilir. (Cat. No:51104) tavsiye edilir. Protokole bakın ve izole methodu için lütfen verilen talimatları izleyin. Piyasada mevcut diğer izolasyon yöntemlerini kullanırken yöntem laboratuarınızda doğrulanmalıdır.

9 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 9/18 Amplifikasyon protokol Aşağıda verilen protokol optimum amplifikasyon için aşağıdakiler kullanılarak tasarlanmıştır, - Qiagen HotStarTaq polimeraz (5 U/µL). - Qiagen 10x PCR buffer (Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, 15 mm MgCl2, ph 8.7 içerir). - MicroAmp PCR tüpleri (0.2 ml ince duvarlı tüpler; Applied Biosystems Cat. no: N ). - GeneAmp PCR sistem PE-9700 termal döngü cihazı. (Applied Biosystems Cat. no: N ). Bu protokol çoğu ticari termal döngü cihazı ile kullanılabilir ancak cihazın üretici tarafından sağlanan bazı modifikasyonlara ihtiyaç duyulabilir. Sonuçları bozabilecek spesifik olmayan amplifikasyonları önlemek için aşağıdaki gerekli önlemleri alınız: - Aşağıda listelenmiş bileşenleri çözün ve buz üzerine yerleştirin. - Buz üzerinde ve gecikmeden tüm pipetleme adımlarını uygulayın. 1. (N) olarak hazırlanacak şişelerin sayısını belirleyin: N = Numune sayısı + 1 İzolasyon için Negatif Kontrol + 1 PCR için Negatif Kontrol + 1 Pozitif Kontrol + 1 extra. 2. Pamuk-tıkalı pipet uçları kullanılarak, otoklavlanmış nükleaz bulunmayan mikro santrifüj tüpü içine bir Ana Karışım hazırlayın: Aşağıdakileri içeren bir Ana Karışık hazırlayın: (N x 22.2 µl) otoklavlanmış distile su + (N x 5.0 µl) Qiagen 10x PCR buffer + (N x 0.4 µl) dntp mix (25 mm) + (N x 1.0 µl) Primer Mix + (N x 1.0 µl) 25 mm MgCl2 + (N x 0.4 µl) Qiagen HotStarTaq DNA Polimeraz 5 U/µL Kısaca vorteksleyin ve otoklavlanmış amplifikasyon tüplerine (N-1) 30 µl Master Mix porsiyonlarından dağıtın μl saflaştırılmış DNA veya 20 μl distile su (Negatif Kontrol için DNAsız ) pipetleyin. AÇIKLAMA: Yavaşça karıştırınız ve sıvıyı tüplerin tabanına getirmek için karışımı yavaşça döndürünüz. 4. Örnekleri kalibrasyonu yapılmış termal bloklara yerleştirin ( termal cyclerın üreticisi tarafından sağlanan talimatları izleyin). INNO-LiPA HBV Multi-DR amplifikasyon için tasarlanan amplifikasyon programını başlatın: PE-9700 termal döngü cihazı için INNO-LiPA HBV Multi-DR amplifikasyon profili: Aşama Sıcaklık Zaman 1 Denatüre 95 C 15 min 2 Denatüre 94 C 30 san. 24 basamakları 50 defa tekrarlayın 3 Birincil sertleşme 55 C 30 san. 4 Birincil uzama 72 C 40 san. 5 uzatma 72 C 10 dak. 6 4 C'ye soğutun 5. Amplifikasyondan sonra, örnekleri derhal INNO-LiPA HBV Multi-DR test stribiyle kullanın veya -15/-25 C de saklayın.

10 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 10/18 6. Bu işlemden sonra, 5 μl amplifiye edilmiş ürün 2% agaroz jel üzerinde analiz edilerek amplifikasyon kontrol edilebilir ya da -15/-25 C de saklanabilir. NOT: Amplifiye edilmiş DNA ürünlerini amplifikasyon reaktifleri ya da izole edilmiş DNA ile saklamayınız. Amplifikasyon sonuçları Görüntüleme - Amplifiye ürün varlığı, % 2'lik bir agaroz jeli üzerinde kontrol edilebilir. - Oluk başına amplifiye edilen üründen 5 µl yükleyin. - Amplikon 867 bp uzunluğunda bir bant olarak gözlenmelidir. Kalite Kontrol - Ekstraksiyon için en az bir boş ekleyin. - Her amplifikasyona en az bir Pozitif ve bir Negatif Kontrol ekleyin. Herhangi bir yeni laboratuvar prosedüründe test prosedürünün doğru bir şekilde uygulanabileceğine dair yüksek derecede güven gelişene kadar pozitif ve negatif kontrolün varlığı dikkate alınmalıdır. Eğer pozitif kontrol eklenmesi istenirse, bilinen bir HBV-pozitif örnek kullanın. - Eğer jelde ekstraksiyon amaçlı negatif kontrol için pozitif bant elde ediliyorsa, çalışma sonuçlarının atılması ve ekstraksiyondan itibaren prosedürün tekrar edilmesi tavsiye edilir. LiPA manual test prosedür Numunelerin denatürasyonu Dikkat: Kalibre edilmiş bir termometre kullanılarak, çalkalayıcılı su banyosunun sıcaklığının 49 C ± 0.5 C olduğunu kontrol edin, ve örnekleri yüklemeden önce gerekirse sıcaklığı yeniden ayarlayın. 1. Çalkalamalı su banyosu sıcaklığını 49 C ± 0.5 C de dengeleyin. 2. Tüm kristalleri çözmek için Hibridizasyon ve sıkı yıkama solüsyonlarını C arası sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin. Su banyosu 49 C ± 0.5 C yi aşmadığından emin olun. Kullanmadan önce şişeyi çalkalayarak karıştırın. 3. Pozitif kontrol örneği yanı sıra, her zaman, izolasyon adımı için bir negatif kontrol örneği, PCR adımı için bir negatif kontrol örneği ve LiPA adımı için bir negatif kontrol örneği (bu strip için denatürasyon solüsyonuna örnek eklemeyin) eklemek tavsiye edilir. 4. Her örnek için, bir INNO-LiPA HBV DR v2 stribi ve bir INNO-LiPA HBV DR v3 stribini forsepsler kullanarak ilgili tüplerden alınız. Stribin üzerine kırmızı markırın yukarısına bir kurşun kalem ile kimlik numarası yazın. NOT: Örneklerin hibritlenmesinde, 2. adıma geçene kadar oluklar içine stripleri yerleştirmeyin. 5. Tepsiye her numune/şerit için bir oluk yerleştirin. 6. Her oluğun üst köşesine 10 µl Denatürasyon Çözeltisi ekleyin. NOT: Her kullanımın ardından denatürasyon solüsyonunu içeren şişeyi derhal kapatın. Havayla uzun süre temas solüsyonun bozulmasına neden olmaktadır. 7. Her olukta denatürasyon solüsyonuna 10 μl örnek (veya kontrol örneği) ekleyin. Pipetle yukarı aşağı hareketlerle dikkatlice karıştırın.

11 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 11/18 8. Oda sıcaklığında, 5 dakika boyunca denatürasyona izin verin. Numunelerin hibridizasyonu 1. Her oluğa dikkatlice, diğer olukların kontamine olmamasına özen göstererek, 2 ml Hibridizasyon Solüsyonu ekleyin. Reaktifleri karıştırmak üzere oluğu yavaşça sallayın. 2. Her örnek için, her strip için yukarı bakan markır çizgisiyle oluk içine her iki stribi yerleştirin (INNO-LiPA HBV DR v2 ve INNO-LiPA HBV DR v3). NOT: Tek kullanımlık eldivenler giyin ve şeritleri alırken forseps kullanın. 3. Şeridin tamamen solüsyon içine daldırılmış olduğundan emin olun. Çaprazbulaşmaya sebep olabileceğinden olukları sızdırmaz mikro plaklar ile kapatmayınız. 4. Tepsiyi 49 C ± 0.5 C sıcaklığındaki su banyosuna yerleştirin ve iki ağırlık arasına sabitleyin. Su banyosunu yaklaşık 80 rpm e ayarlayın, kapağı kapatın ve tepsiyi 60 dakika boyunca inkübe edin. Her şeridin tamamen batmış olduğundan ve serbestçe yüzebildiğinden emin olun. 5. Hibridizasyon inkübasyonu bittiğinde tepsiyi su banyosundan çıkartın. Striplerin yıkanması DİKKAT: Kolay çıkarabilmek amacıyla, sıvının oluğun bir ucunda, stripleri işaret çizgisinin üzerinde toplayabilmek için tepsiyi küçük bir açıyla tutun. Stribin yüzeyine zarar vermeyin. Sıçramalardan ve solüsyonların oluklar arasından geçmesinden kaçının. 1. Sıvı tercihen bir vakum aspiratörüne bağlı bir pipet ile oluklardan aspire edilir. 2. Her oluğa 2 ml sıkı yıkama solüsyonu ekleyin ve C de 1 dakika tepsiyi sallayarak stripleri durulayın. Her oluktan solüsyonu aspire edin. NOT: Çoklu pipet kullanarak sıkı yıkama solüsyonunun dağıtılması için kullanışlı olacaktır. 3. Her oluğa 2 ml Sıkı yıkama solüsyonu ekleyerek ve C de 1 dakika tepsiyi sallayarak stripleri durulayarak yıkamayı tekrarlayın. Solüsyonu her oluktan aspire edin. 4. Her oluğa 2 ml Sıkı yıkama solüsyonu ekleyin, tepsiyi 49 C ± 0.5 C sıcaklığındaki çalkalayıcı su banyosuna yerleştirin ve tepsiyi iki ağırlık arasında sabitleyin. Su banyosunu yaklaşık 80 rpm e ayarlayın, kapağı kapatın ve tepsiyi 30 dakika boyunca inkübe edin. 5. Rinse çalışma solüzyonu ve konjugat çalışma solüsyonunu hazırlayın (Reaktiflere bakınız). Renk gelişimi Dikkat: Kolay çıkarabilmek amacıyla, sıvının oluğun bir ucunda, stripleri işaret çizgisinin üzerinde toplayabilmek için tepsiyi küçük bir açıyla tutun. Stribin yüzeyine zarar vermeyin. Sıçramalardan ve solüsyonların oluklar arasından geçmesinden kaçının. 1. Bir pipet yardımıyla solüsyonu oluktan çekin. 2. Her oluğa 2 ml durulama çalışma solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika tepsiyi sallayarak stripleri yıkayın. Solüsyonu her oluktan aspire edin. Bu adımı tekrarlayın.

12 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 12/18 3. Her oluğa 2 ml konjugat çalışma solüsyonu ekleyin, tepsiyi C de çalkalayıcı (160 rpm de orbital ya da 50rpm de rocker) üzerine yerleştirin ve 30 dakika inkübe edin. NOT: Konjugat inkübasyonunun bitmesine yaklaşık on dakika kala Substrat çalışma solüsyonu hazırlayın ( Reaktiflere bakın). 4. İnkübasyon tamamlandığında tepsiyi çalkalayıcıdan çıkarın ve pipet yardımıyla solüsyonu tüm oluklardan alın. 5. Her oluğa 2 ml durulama çalışma solüsyonu ekleyin ve C de 1 dakika tepsiyi sallayarak stripleri yıkayın. Solüsyonu her oluktan aspire edin. Bu adımı tekrarlayın. 6. Her oluğa 2 ml Substrat Tampon ekleyin ve C de 1dakika tepsiyi sallayarak şeritleri yıkayın. Solüsyonu her oluktan aspire edin. 7. Her oluğa 2 ml substrat çalışma solüsyonu ekleyin, C de çalkalayıcıya yerleştirin ve 30 dakika inkübe edin. 8. İnkübasyon tamamlandığında, stripleri yıkayarak renk gelişimini durdurun; tepsiyi çalkalayıcıdan kaldırın, her oluktan çözeltiyi aspire edin ve her oluğa 2 ml distile su ekleyin ve en az 3 dakika çalkalayıcı üstünde tepsiyi yerleştirin. Bu adımı tekrarlayın. 9. Cımbız yardımıyla tüm şeritleri oluklarından çıkartın ve emici kağıt üzerine işaret çizgisi yukarı gelecek şekilde yerleştirin. 10. Sonuçları okumadan önce stripleri tamamen kurutun. Renklenmiş stripleri karanlıkta saklayın. Otomatik test prosedürü: Göstergeler ve ilişkili protokoller Fujirebio Avrupa N.V. edinilebilir (bakınız- LiPA sonucları Okuma Şekil 1, INNO-LiPA HBV DR v2 stribinde farklı oligonükleotid problarının pozisyonunu göstermektedir. Bir çizgi, test prosedürünün sonunda net bir mor/kahverengi bant belirdiğinde Pozitif kabul edilir. Şekil 1: Maviı renkli markır çizgisinin yerleşimi, Konjügat Kontrol çizgisi (Conj. Kontrol), Amplifikasyon Kontrol çizgisi (Amp. Kontrol) ve INNO-LiPA HBV DR v2 32 prob çizgisi.

13 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 13/18 Şekil 2, INNO-LiPA HBV DR v3 stribinde farklı oligonükleotid problarının pozisyonunu göstermektedir. Bir çizgi, test prosedürünün sonunda net bir mor/kahverengi bant belirdiğinde Pozitif kabul edilir. Şekil 2: INNO-LiPA HBV DR v3 strip üzerinde, sarımsı renkli markır çizgisinin, konjügat kontrol çizgisinin (Konj.Kontrol),amplifikasyon kontrol çizgisinin(amp. Kontrol) ve 22 prob çizgisinin yerleri. Kalite Kontrol - En üstteki mavi çizgi (INNO-LiPA HBV DR v2 stribinde) yada sarı çizgi (INNO-LiPA HBV DR v3 stribinde) markır çizgisidir. Bu çizgi stribin doğru oryantasyonuna izin verir. - Her strip için, ilk renk geliştiren çizgi plastik okuma kartında "Conj.Control" çizgisiyle hizalanmalıdır. Bu çizgi, algılama işlemi sırasında reaktif konjugat ve bileşen solüsyonu ilavesini denetler. Aynı test içinde her şerit üzerinde pozitif ve yaklaşık olarak aynı yoğunlukta olmalıdır. Eğer çizgi negatif ise, sonuç geçersiz olarak kabul edilmelidir. Bu durumda LİPA testini tekrarlamak tavsiye edilir. - İkinci renk geliştiren çizgi (okuma kartı üzerinde "Amp. control") hibridizasyon için amplifiye edilmiş malzeme eklenmesini kontrol eder. Pozitif örnekler için bu çizgi örnekte uygun miktarda HBV bulunuyorsa, doğru örnek işleme yapılmışsa ve amplifikasyon başarılıysa pozitif olmalıdır (probit analizi kullanılarak, INNO-LiPA HBV DR v2 tespitinin alt sınırı 990 kopya/ml olarak bulundu (95%CI [454kopya/mL; 6327 kopya/ml])). Çizginin yoğunluğu örnekler arasında değişebilir, ve sonraki prob çizgisi sadece bu kontrol çizgi pozitif ise yorumlanmalıdır. Eğer çizgi pozitif örnek için negatif ise, örneğin viral yükü çok düşük olabilir, amlifikasyon inhibe edilmiş olabilir, ya da hiç amplikon eklenmemiş olabilir, ya da ekstrasyon yöntemi başarısız olmuş olabilir. Bu durumda, amplifikasyon veya ekstraksiyondan başlayarak LİPA testinin tekrarlanması tavsiye edilir. Negatif kontrol örnekleri için bu çizgi negatif olmalıdır; eğer bu çizgi pozitif ise-ya da herhangi başka sonraki prob çizgisi pozitif ise, - kontaminasyon meydana gelmiş olabilir. Bu durumda, negatif kontrol için amaçlanan tam çalışma sonuçlarının atılması tavsiye edilir. Pozitif kontrol örnekleri için bu çizgi pozitif olmalıdır (aynı zamanda beklenen wild-tip ya da mutant prob çizgisi); eğer bu çizgi negatif ise ekstrasyon, amlifikasyon, yada hibridizasyon başarısız olmuş olabilir. Bu durumda pozitif kontrol için amaçlanan tam çalışma sonuçlarının atılması tavsiye edilir. Sonucların yorumlanması - Eğer çizgi 1 ( Conj. control ) pozitif ise sonuç yorumlanabilir kabul edilir. Eğer çizgi 1 negatif ise, strip yorumlanmamalıdır. - Eğer sonuç yorumlanabilir ve çizgi 2 ( Amp.control ) pozitif ise ("Kalite kontrol" bölümüne bakınız) sonuç pozitif düşünülür. İkinci durumda wild- tip ve mutant prob çizgisi her stribde yorumlanmalıdır. Amp.control çizgisi negatif ise sonraki prob çizgileri yorumlanmamalıdır.

14 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 14/18 - Pozitif prob çizgisi aşağıdaki tablolarda listelendiği gibi ilgili kodonlarda wild- tip yada mutant sekansı ile karşılık gelir. Her kodon için bir wild-tip yada mutant çizgisi pozitif olması gerekir. - Belirli bir kodonda ya da çevresindeki nadir bir polimorfizm bu belirli kodon için INNO-LiPA HBV DR v2 veya v3 stribinde bulunan herhangi bir probda hibridizasyon yokluğuna neden olabilir. Bu durumda, test söz konusu kodon hakkında bilgi vermez: Hem wild tip hem de mutant çizgisinde "çift blank". Ancak kalan kodonlar bağımsız olarak okunabilir. Bu durumda, özellikle Amp. control çizgisinin yoğunluğu zayıfsa, LİPA tekrarlanması önerilir. - Nadiren, (çoğunlukla) tüm bantlar zayıf pozitif reaktivite gösterebilir ("zebra deseni"). Bu durumda, sonuçlar geçersiz düşünülür. Bu durumda, amplifikasyon veya ekstraksiyon dan başlayarak LİPA testinin tekrarlanması tavsiye edilir. INNO-LiPA HBV DR v2 strip sonucları: Çizgi Kodon pozisyon Polimeraz Amino asit Polimeraz Vahşi tip/mutant Polimeraz 3 80 L Vahşi tip 4 80 L Vahşi tip 5 80 V Mutant 6 80 I Mutant 7 80 I Mutant V Vahşi tip G Vahşi tip L Mutant /181 L / A Vahşi tip/vahşi tip /181 L / T Vahşi tip / Mutant /181 L / T Vahşi tip / Mutant /181 L / V Vahşi tip / Mutant /181 M / A Mutant/Vahşi tip /181 M / T Mutant/Mutant /181 M / V Mutant/Mutant M Vahşi tip M Vahşi tip V Mutant V Mutant I Mutant I Mutant I Mutant S Mutant N Vahşi tip N Vahşi tip N Vahşi tip N Vahşi tip N Vahşi tip T Mutant T Mutant T Mutant T Mutant INNO-LiPA HBV DR v3 strip sonucları: Çizgi Kodon pozisyon Polimeraz Amino asit Polimeraz Vahşi tip/mutant Polimeraz T Vahşi tip SCGA Mutant SCGA Mutant SCGA Mutant SCGA Mutant ILFM Mutant ILFM Mutant

15 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 15/18 Çizgi Kodon pozisyon Polimeraz Amino asit Polimeraz Vahşi tip/mutant Polimeraz ILFM Mutant A Vahşi tip T Mutant S Vahşi tip G Mutant C Mutant I Mutant M Vahşi tip M Vahşi tip V Mutant V Mutant I Mutant I Mutant L Mutant L Mutant Performans özellikleri Kullanılan kısaltmalar: CI = güven aralığı; LL = alt sınır; UL = üst sınır; WT = wild tip; MT = mutant; IND =belirsiz; seq = dizileme INNO-LiPA HBV Multi-DR testinin test performansı (INNO-LiPA HBV DR v2 and INNO- LiPA HBV DR v3 stripleri) dahili olarak ve iki harici merkezde (Fransa ve İtalya) değerlendirildi. Başarı oranı ve uyuşma Başarı oranı ve anlaşma iki harici merkezde (Fransa ve İtalya) HBV enfekte hastadan 204 serum örneği üstünde değerlendirilmiştir. Viral yük 103 örnek için biliniyordu. Viral yük 103 örnek için biliniyordu. 13 örnek 990 kopya/ml aşağısında viral yüke sahipken, (aralık kopya / ml) 90 örnek 990 kopya/ml üzerinde viral yüke sahipti. Hastaların 67.6% sı kan örnekleme zamanında HBV tedavisi altındaydı ve 32.4% ü tedavi naïve. Başarı oranı Başarı oranı test edilen HBV pozitif örneklerin toplam sayısı dışında stripte (strip üzerinde pozitif bir amplifikasyon kontrol çizgisiyle) yorumlanabilir sonuçla örneklerin sayısı olarak tanımlanır. İlk amlifikasyon sonrasında INNO-LiPA HBV DR v2 striplerin üzerinde yorumlanabilir sonuç 204 örneğin dışında 201 i için elde edildi, % 98.5 ilk başarı oranı ile sonuçlanarak (201/204; %95 CI LL = %96.4). Bu üç örneğin yeniden amlifikasyonu ve/veda yeniden ekstrasyonunun tekrar testten sonra INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri için %100 (204/204; %95 CI LL = %98.7) başarı oranı ile başarılı şekilde sonuçlandığı bulunmuştur. İlk amlifikasyon sonrasında INNO-LiPA HBV DR v3 striplerin üzerinde yorumlanabilir sonuç 204 örneğin dışında 200 ü için elde edildi, % 98 (200/204; %95 CI LL = %95.7) ilk başarı oranı ile sonuçlanarak. Bu dört örneğin yeniden amlifikasyonu ve/yada yeniden ekstrasyonunun tekrar testten sonra INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri için %100 (204/204; %95 CI LL = %98.7) başarı oranı ile başarılı şekilde sonuçlandığı bulunmuştur. Dizileme ile uyuşma Referans sıralaması sonucu olarak bu analizden hariç tutulan bir örnek mevcut değildi.

16 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 16/18 INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri üzerinde test edilen 203 HBV pozitif örnek arasında, ilk testten sonra %7.9 (16/203; 95% CI UL = 11.6%) belirsizlik sonuçlanarak 16 belirsiz sonuç gözlendi. Bu 16 örneğin yeniden amplifikasyon ve / veya yeniden ekstrasyonu tekrar testten sonra INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri için %4 (8/203; %95 CI UL = %6.9) ü belirsizlikle sonuçlaranak 8 örnek için başarılı bulundu. INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri üzerinde test edilen 203 HBV pozitif örnek arasında ilk testten sonra %11.3 (23/203; 95% CI UL = 15.5%) belirsizlikle sonuçlanarak, 23 belirsiz sonuç gözlendi. Bu 23 örneğin yeniden amplifikasyon ve/veya yeniden ekstraksiyonu tekrar testten sonra INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri için %3.5 (7/203; 95% CI UL = 6.2%) belirsizlikle sonuçlanarak 16 örnek için başarılı bulundu.elektroferogram doğrulanmasından sonra, tüm belirsiz sonuçlar prob bölgesindeki bitişik kodonda polimorfizm ile açıklanabilir, amllifiye edilmiş materyal INNO-LiPA HBV DR v2 stribi veya INNO-LiPA HBV DR v3 stribi üzerinde kaplı LİPA problarına hidribize olamaz. Dizileme ile tanı uyuşması strip üzerinde yorumlanabilir sonuç ile örneklerin toplam sayısı tarafından bölünerek uyumlu örnek sayısı olarak hesaplandı. Uyumlu sonuç örneğinin %91 (185/203; 95% CI LL = 87.29%) için INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri için dizileme ile karşılaştırılarak elde edildi. Kodon seviyesinde, INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri %91,5 (1115/1218) durumu içinde aynı amino asit bilgisini verdi ve INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri %5.4 (66/1218) içinde ek bilgi verdi. Dizileme ile karşılaştırıldığında INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri için tamamen farklı sonuç örneklerin %8.87 si için (18/203; 95% CI UL = 12.72%) elde edildi. Tutarsızlık testinden sonra, %97.5 uyuşma (198/203; 95% CI UL = 98.5%) ile sonuçlanarak, bu 18 numune 13 örnek için uyumlu sonuç verdi. 5 örnek INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri için uyumsuz kaldı. Uyumsuz 18 örneğin 11 i yeni DNA ekstraktı kullanılarak yeniden dizildi. Yeni DNA ekstrat dizileme sonuçları 11 örneğin dışında 6 örnek için ilk LİPA ile uyumluydu. Uyumlu sonuç örneğinin %100 (203/203; %95 CI UL = %98.7) için INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri için dizileme ile karşılaştırılarak elde edildi. INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri %96.7 (785/812) durumu içinde aynı amino asit bilgisini verdi ve INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri %0.5 (4/812) içinde ek bilgi verdi. Kodon seviyesinde uyuşma sonuçları aşağıdaki tabloda özetlenmektedir. Uyumlu Uyumsuz Striple kodon r v2 v3 Aynı WT Aynı MT MT WT+MT LİPA da MT ekleme WT MT Diff MT Seq üstünde MT ekleme LiPA da IND Toplam

17 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 17/18 Striple r Örnek Tipleri Uyumlu Uyumsuz Seq LiPA da kodon Aynı Aynı MT LİPA da WT Diff üstünde IND WT MT WT+MT MT ekleme MT MT MT ekleme Toplam DNA örneği HBV pozitif bireylerin plazma örneklerinden elde edildi, INNO-LiPA HBV Multi-DR nin bir lotu dahili olarak test edildi. 24 HBV pozitif örneğin tümü, her strip için %100 (24/24; 95% CI [85.8%, 100.0%]) başarılı sonuçla sonuçlanarak, INNO-LiPA HBV DR v2 ve INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri üzerinde yorumlanabilir sonuç verdi (strip üzerinde pozitif amplifikasyon kontrol çizgisi ile). Otomasyon HBV pozitif bireylerin 30 DNA örneği dahili olarak,ayrıca manuel olarak 3 cihaz üstünde (Auto-LiPA 30, Auto-LiPA 48 ve AutoBlot), INNO-LiPA HBV Multi-DR bir lotu üstünde test edildi. Stripte amplifikasyon kontrol çizgisi olarak analizden hariç tutulan bir örnek dört test prosedürün hepsi için negatifti ve negatif amlifikasyon kontrol çizgisi ile bir strip yorumlanabilir değildir. INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri için, Otoblot cihazında test yapılırken bir örnek kodon 236 için belirsiz sonuç verdi. Bu Auto-LiPA 30 ve Auto-LiPA 48, ve Auto-LiPA 30 ve manual test prosedürü arasında %100 (29/29; 95% CI [88.1%, 100.0%]) uyumla sonuçlandı. INNO-LiPA HBV DR v2 stripleri için Auto-LiPA 30 ve AutoBlot arasında uyum %96.6 dır (28/29; 95% CI [82.2%, 99.9%]). INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri için, tüm metotlar arasında %100 uyum (29/29; %95 CI [88.1%, %100.0]) elde edilmiştir. Klinik özgüllük HBV negatif bireylerin serum örneklerinden çıkarılan 100 DNA örneği, INNO-LiPA HBV Genotipleme striplerinin bir lotu üzerinde dahili olarak test edildi. 100 HBV negatif örneğin hepsi, her strip için %100 (100/100; 95% CI [96.4%, 100%]) klinik özgünlükle sonuçlanarak, INNO-LiPA HBV DR v2 ve INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri üstünde negatif LİPA modeli verdi. Kesinlik Yedi DNA örneği dahili ve iki harici sitede test edildi (Fransa ve İtalya). Örnekler farklı operatörler tarafından, farklı günlerde üç farklı lot primer kullanılarak iki kopya halinde amplifiye edilmiştir. Bu amplifiye edilmiş ürünler farklı operatörler tarafından, farklı günlerde, farklı oto-lipa cihazları kullanılarak INNO-LiPA HBV Multi-DR nin üç farklı lotunda test edilmiştir. IINNO-LiPA HBV DR v2 stripleri için % 99.5 uyum (193/194) elde edilmiştir. Uyumsuz sonuç ile bir tekrar testin kabul edilen reaktivite değişim aralığı içindedir. INNO-LiPA HBV DR v3 stripleri için %100 uyum (194/194) elde edilmiştir.

18 81383 INNO-LiPA HBV Multi-DR / v3 / ANAHTAR KODU: FRI26498 p 18/18 Prosedür sınırlamaları - Bu kitin kullanımı HBV nükleik asit ekstraksiyonu, amplifikasyon ve hibridizasyon teknikleri konusunda eğitim almış personel ile sınırlandırılmalıdır. - İyi laboratuvar uygulamaları ve önceden belirtilen prosedürlerin dikkatli uygulanması spesifik amplifikasyona olanak sağlar. - HBV enfekte örneklerin zaman zaman çok yüksek viral yükü nedeniyle kontaminasyonu önlemek için çok dikkat edilmelidir. - Polimeraz inhibasyonu (ör, heparin, hemoglobin ile) testin tamamen başarısız olması için bir sebep olabilir. - Tek kullanımlık eldivenlerin pudrası ve sodyum hipoklorit amplifikasyon inhibisyonuna neden olabilir. Ticari markalar - INNO-LiPA, dünya çapında bir ticari markadır örneğin ABD de. - LiPA Benelux da tescili ticari markadır ve dünyanın geri kalanında bir ticari markadır (ABD dahil). - Auto-LiPA dünya çapında bir ticari markadır örneğin ABD de. - GeneAmp ve MicroAmp Applied Biosystems, LLC tescilli ticari markalarıdır. - Qiagen, QIAamp QIAGEN Grubun tescilli ticari markalarıdır. - Eppendorf Eppendorf AG tescilli ticari markasıdır, DE.