28772 v p 1/15 Türkçe

Transkript

1 80558 INNO-LiPA CFTR17+ Tn Update KOD: FRI INNO-LiPA CFTR17+ Tn Update v p 1/15 Türkçe Üretici: Fujirebio Europe N.V. Technologiepark Gent Belgium Tel BTW BE RPR Gent Dağıtıcı: Fujirebio Europe N.V. Tel Fax customer.support@fujirebio-europe.com Fujirebio Germany GmbH Tel Fax germany@fujirebio-europe.com Fujirebio France SARL Tel Fax france@fujirebio-europe.com Fujirebio Italia S.r.l. Tel Fax italy@fujirebio-europe.com Fujirebio Iberia S.L. Tel Fax spain@fujirebio-europe.com Vurgulanan değişiklikleri not edin. AVRUPA GR IS LT RO SK TR LI MT EE AVRUPA-dışı US CA AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU :00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Europe N.V

2 80558 INNO-LiPA CFTR17+ Tn Update / v4 / FRI40998 p 2/15 İÇİNDEKİLER Kullanım amacı... 3 Test prensibi... 3 Reaktifler... 4 Açıklama, kullanıma hazırlık ve önerilen saklama koşulları Gerekli ama sağlanmayan malzemeler... 5 Güvenlik ve Çevre Koşulları... 6 Örnekler... 7 LiPA test prosedürü... 7 Manipülasyon prosedürleri... 7 Strip kullanımı... 7 Manuel inkübasyon talimatları... 8 Oluklarının içindeki sıvının manuel değişimi için talimatlar... 8 Uyarılar ve önlemler... 9 LiPA manual test prosedür... 9 Numuneler... 9 Denatürasyon ve hibridizasyon... 9 Stringent wash Renk gelişimi Otomatik test prosedürleri: Sonuçlar Okuma Onaylama Sonuçların yorumlanması Yorumlama yazılımı: LiRAS Prosedür sınırlamaları Test performansı INNO-LiPA CFTR19 ve INNO-LiPA CFTR17+Tn Update Numune reaktivitesi Kesinlik Lisanslar Ticari markalar Kullanılan Semboller Üretici In vitro diagnostik medikal ürün Parti kodu Katalog numarası Tarafından kullanım Kullanım talimatlarına bakın Sıcaklık sınırlaması <n> testleri için yeterli içerik Conjugate 100x Conjugate diluent Denaturation solution Hybridization solution

3 80558 INNO-LiPA CFTR17+ Tn Update / v4 / FRI40998 p 3/15 Rinse solution 5x Stringent wash solution Stripler Substrate BCIP/NBT 100x Substrate buffer Tehlike Uyarı Line Probe Assay Kullanım amacı INNO-LiPA CFTR17 + Tn Update, insan tam kan, bukkal fırça ve kan lekesi örneklerinde, 17 İnsan Kistik Fibroz Transmembran İletkenlik Düzenleyici ( Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)) gen mutasyonlarının ve vahşi tip sekansları ile CFTR polymorphism Tn'nin eş zamanlı in vitro tespiti ve tanımlanmaları için kullanılan bir line probe assay'dir. Bu kalitatif genotiplendirme testi, üreme çağındaki erişkinlerin taşıyıcılığı hakkında bilgi verir, ve ayrıca doğrulayıcı tanı testleriyle birlikte yenidoğan taramasında da yardımcı olabilir. Tek başına teşhis ya da doğum öncesi tarama amaçlı kullanılmaz. INNO-LiPA CFTR17 + Tn Update kiti, CFTR gen mutasyonları için çok parametreli tarama testi sağlar ve sağlıklı normaller, sağlıklı taşıyıcılar ve etkilenen hastalarda görülen mutasyonları ayırt eder. Bu test ayrıca,eksik penetrans olan vas deferens (CBAVD) hastaların doğumsal bilateral yokluğunda sık görülen bir hastalık mutasyonu olan 5T allelilin, olası homozigot ya da heterezigot şekilde var olup olmadıgını tespit eder. Bu daha doğru genetik danışmanlığa olanak sağlar,cftr gen mutasyonunun sınıfını ve gözlenen Tn varyantını esas alır, CF hasta vak alarında klinik prognozun belirlenmesine yardım eder. Test prensibi INNO-LiPA CFTR testleri, ters hibridizasyon esasına dayanmaktadır. Amplifiye biotinlenmiş DNA materyali kimyasal olarak denatüre edilir ve ayrılan iplikçikler, membran bazlı stripler üzerine paralel çizgiler halinde sabitlenmiş spesifik oligonükleotidler ile hibridize olur. Bu işlemi, uyuşmayan amplifiye materyalleri uzaklaştırmak için yapılan stringent wash adımı takip eder. Stringent wash'tan sonra, alkalin fosfataz ile konjüge edilmiş streptavidin eklenir ve daha önceden oluşan herhangi bir biyotinilize hibrid'e bağlanır. Kromojen içeren substrat çözeltisi ile inkübasyon mor/kahverengi renkli bir çökelti ile sonuçlanır. Reaksiyon yıkama adımı ile durdurulur ve probların reaktivite şablonu kaydedilir. INNO-LiPA CFTR17+Tn Update kitiyle, multiplex amplifikasyon kiti (Amplifikasyon CFTR), iki primer solüsyonu ve amplifikasyon buffer içeren, biyotinli amplifiye materyalin standardize edilmiş hazırlığı için mevcuttur. Bu amplifikasyon kiti, polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) esasına dayanmaktadır.

4 80558 INNO-LiPA CFTR17+ Tn Update / v4 / FRI40998 p 4/15 Amplifikasyon ürünleri daha sonra, 36 sekans-spesifik DNA prob hattı, bir kontrol çizgisi ve iki işaret çizgisi sabitlenmiş olan 1 tiplensirme stribi kullanılarak hibridize edilir (Şekil 1, Sonuçlara Bakın). INNO-LiPA CFTR17+Tn Update: ilgili adımlar 1. Adım İki multipleks amplifikasyon reaksiyonu: CFTR geninin ekzon/intron 4, intron 5, ekzon 10, intron 10/ekzon 11, intron 12, intron 16, ekzon 20 ve ekzon 21 i CFTR geninin ekzon 2, intron 1/intron 3, ekzon 3, ekzon 7, intron 8/ekzon 9,ekzon 13, intron 14b, ekzon 17a, intron 17a/ekzon 17b, ekzon 19 ve intron 19 u Adım 2 Bir INNO-LiPA CFTR17+Tn Update stribinde sabit 36 probla hibridizasyon ve stringent wash Adım 3 Renk gelişimi. 4. Adım Prob reaktivite şablonunun yorumlanması Reaktifler Açıklama, kullanıma hazırlık ve önerilen saklama koşulları C de ve orijinal şişelerinde muhafaza edilen açılmamış reaktifler, kitin son kullanma tarihine kadar stabildir. Reaktifleri dondurmayın Reaktifleri, son kullanma tarihlerinden sonra kullanmayın. - Kit herhangi bir kontamine DNA kaynağından, özellikle de amplifiye ürünlerinden ayrı saklanmalıdır. - Tüm reaktifler kullanımdan yaklaşık 60 dakika önce oda sıcaklığına (20-25 C) getirilmeli ve kullanımdan hemen sonra buzdolabına konulmalıdır. - Kit bileşenlerinin fiziksel görünümündeki değişiklikler, kararsızlık veya bozulma belirtisi olabilir. - Bileşenler aynı lot numaralarına sahip olmadığı sürece, farklı kitlerin reaktifleri ile karıştırmayın. - Striplerin kullanımdan önce kıvrılma ihtimalini en aza indirmek için, tüpün yatay olarak saklanması önerilir. Sağlanan Reaktifler: Bileşen Miktar Ref. Açıklama Stripler 1x Opsiyonel Tn tiplendirmesi için bir üst kahverengi işaret çizgisi ve ikinci bir mavi işaret çizgisi ile işaretlenmiş 20 INNO-LiPA CFTR17 + Tn Update stribi içerir. Denaturation solution 1x 1 ml EDTA içeren alkali solüsyon Bu şişe kullanıldıktan hemen sonra kapatılmalıdır; solüsyonun havaya uzun süre maruz kalması, denatüre etme kuvvetinin hızlı bir şekilde bozulmasına neden olur. Hybridization solution 1x 80 ml C yi geçmeyecek şekilde en az 37 C ye önceden ısıtılması gereken, 0.1 %0.5 SDS içeren SSC buffer (tüm kristaller kullanımdan önce çözülmelidir). Stringent wash solution 1x 200 ml C yi geçmeyecek şekilde en az 37 C sıcaklığa önceden ısıtıllması gereken %0.1 SDS içeren SSC buffer (tüm kristaller kullanımdan önce çözülmelidir).

5 80558 INNO-LiPA CFTR17+ Tn Update / v4 / FRI40998 p 5/15 Bileşen Miktar Ref. Açıklama Conjugate 100x 1x 0,8 ml Streptavidin; Protein stabilizörleri ve koruyucu olarak %0.01 MIT/ <%0.1CAA içeren Tris tamponda alkalin fosfataz etiketli. Streptavidin conjugate diluent ile 1/100 oranında dilüe edilmelidir: her test oluğu için 2 ml conjugate diluent hazırlayın (manuel çalışma için fazladan 2 ml). Conjugate working solution karanlıkta ve oda sıcaklığında (20-25 C) saklandığında 24 saat stabildir. Conjugate diluent 1x 80 ml NaCl, Triton, protein stabilizörleri ve koruyucu olarak 0.01% MIT/<0.1% CAA içeren fosfat tamponu. Substrate BCIP/NBT 100x 1x 0,8 ml DMF içinde BCIP ve NBT, kullanılmadan önce substrat tamponunda 1/100 oranında dilüe edilmelidir: her test oluğu için 2 ml substrate working solution hazırlayın (manuel çalışma için fazladan 2 ml). Substrate working solution, oda sıcaklığında (20-25 C) ve karanlıkta muhafaza edilirse, 24 saat stabildir. Substrate buffer 1x 180 ml NaCl, MgCl2 ve koruyucu olarak 0.01% MIT/<%0.1 CAA içeren Tris-tamponu. Rinse solution 5x 1x 80 ml Fosfat tamponu; NaCl, Triton ve koruyucu olarak %0.05 MIT/%0.48 CAA içerir, kullanılmadan önce distile su ile 1/5 oranıında dilie edilmelidir: her test oluğu için 8 ml rinse working solution hazırlayın (manuel çalışma için fazladan 10 ml). Rinse working solution, 2-8 C de, 2 hafta stabildir. İnkübasyon tepsileri 3 - Reading card (okuma kartı) 1 - Pozitif probların tanımlanması için. Veri raporlama sayfası 2 - Geliştirilen striplerin saklanması için. Gerekli ama sağlanmayan malzemeler - Amplification CFTR. - Çalkalayıcı platformlu su banyosu (80 rpm; eğimli kapaklı; sıcaklığı 47 C ± 0.5 C ye ayarlanabilen). - Aspirasyon aparatları. - Kalibre edilmiş termometre. - Orbital, karşılıklı (çift taraflı) veya sallanan platform çalkalayıcı Öneriler Orbital çalkalayıcı için: Dairesel hareket çapı 13 mm 'ye eşit ya da daha fazla olmalıdır 13 mm dairesel hareket için önerilen hız 160 rpm dir. Karşılıklı çalkalayıcı için: İleri geri hareket için önerilen hız, dakikada 80 harekettir. Sallanan platformlu çalkalayıcı için: Sallama açısı, sıvının dökülmesini önlemek amacıyla,13 'yi geçmemelidir. Önerilen hız 50 rpm dir. - Vorteks mikser veya eşdeğeri. - Dereceli silindirler (10, 25, 50, ve 100 ml).

6 80558 INNO-LiPA CFTR17+ Tn Update / v4 / FRI40998 p 6/15 - Distile veya deiyonize su. - Tek kullanımlık eldiven. - Tek kullanımlık steril pipet uçları (tercihen pamuk filtreli). - Strip çalışması için forseps µl, µl, ve µl dağıtımı için ayarlanabilir pipetler. - Dispensiyon için multipipet (Eppendorf, isteğe bağlı). - Zamanlayıcı, 2 saat (± 1 dakika). Güvenlik ve Çevre Koşulları Potansiyel tehlikeli bileşenler hakkında bilgi edinmek için, Güvenlik Bilgi Formuna (SDS) ve ürünün etiketine bakınız. En yeni SDS versiyonu te mevcuttur. Tehlike Uyarı Tehlike Tehlike İfadeleri H312+H332 H314 H317 H319 H360D Önlem ifadeleri P201 P260 P261 P280 Sodyum hidroksit içerir H314 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P310 P363 2-kloroasetamid içerir H317 P280 P261 P362+P364 P333+P313 P302+P352 N,N-Dimethylformamide, 5,5'-diphenyl-3,3'-bis (4-nitrophenyl)-2,2'-(3,3'-dimethoxybiphenyl-4,4'-ylene)ditetrazolium dichloride ve metanol içerir H312 + H332 H319 H360D P261 P280 P201 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P308+P313 Yutulduğunda ya da cilt ile teması halinde zararlıdır. Ciddi derecede deri yanıklarına ve göz hasarına neden olur. Allerjik deri reaksiyonuna neden olabilir. Ciddi derecede göz tahrişine neden olur. Fetüsa zarar verebilir. Kullanmadan önce özel talimatları edinin. Dumanı/buharı/spreyi solumayın. Dumanı/buharı/spreyi solumaktan kaçının. Koruyucu eldiven / koruyucu giysi / göz koruması / yüz koruması kullanın. P302+P352 CİLT İLE TEMAS HALİNDE: Bol su ile yıkayın/... P303+P361+P353 Cilt temasında(veya saç): Kontamine olan tüm giysileri derhal çıkarın. Cildi su / duş ile yıkayın. P305+P351+P338 GÖZ TEMASINDA: Birkaç dakika su ile dikkatlice yıkayın. Varsa ve kolayca çıkarılabiliyorsa, kontakt lensleri çıkarın. Yıkamaya devam edin. P308+P313 P310 Maruz kaldığınızda veya endişelendiğinizde: Tıbbi yardım/destek alın. Hemen bir ZEHİR MERKEZİ / Doktor /.. a başvurun.

7 80558 INNO-LiPA CFTR17+ Tn Update / v4 / FRI40998 p 7/15 P333+P313 P362+P364 P363 Ciltte tahriş veya kızarıklık meydana gelirse: Tıbbi yardım/destek alın. kontamine giysileri çıkartın ve tekrar kullanmadan önce yıkayın. Kontamine giysileri tekrar kullanmadan önce yıkayın. - Bu test, sadece eğitimli personel tarafından yapılmalıdır. - Numune, potansiyel enfeksiyöz olarak ele alınmalıdır. Bu nedenle, tüm kan bileşenlerinin ve biyolojik materyallerin potansiyel olarak bulaşıcı olduğu düşünülmeli ve bu şekilde ele alınmalıdır. Tüm kan bileşenleri ve biyolojik materyaller, belirlenmiş emniyet prosedürlerine uygun olarak atılmalıdır. 121 C de minimum 15 dakika otoklavlanmalıdır. Tek kullanımlık malzemeleri yakın. Nihai konsantrasyon ±% 1 sodyum hipokloritli olacak şekilde,sıvı atığı sodyum hipoklorit ile karıştırın. Atmadan önce bir gece bekletin. DİKKAT: Sodyum hipoklorit eklemeden önce asit içeren sıvı atığı nötralize edin. - Kişisel koruyucu ekipmanların kullanılması gereklidir: Tehlikeli veya bulaşıcı ajanlar ile çalışılırken, eldiven ve koruyucu gözlük kullanılmalıdır. - Atık, kurumun atık imha etme esaslarına göre işleme tabii tutulmalıdır. Tüm federal, eyalet ve yerel çevresel düzenlemeler de dikkate alınmalıdır. Örnekler INNO-LiPA CFTR19 testinde, biyotinlenmiş amplifiye DNA materyali kullanıldığı için, numunedeki CFTR geninin sırasıyla 8 (primer solution part 1 kullanılarak) ve 11 (primer solution part 2 kullanılarak) multipleks amplifikasyonları için Amplification CFTR kullanıma uygundur. LiPA test prosedürü Standart bir LiPA prosedürü, bir olukta bir stribin test edilmesi anlamına gelir. Bununla birlikte, bir denklik çalışması, INNO-LiPA CFTR17 + Tn Update'in INNO-LiPA CFTR19 ile aynıolukta test edilebileceğini göstermiştir. Bu nedenle, diğer tüm protokol parametrelerini aynı tutarken 10 μldenatürasyon solüsyonuna her iki amplikon da 10 μl eklenmelidir. Manipülasyon prosedürleri Strip kullanımı - Stripler, sadece bir kez kullanılmak üzere tasarlanmıştır! - Striplere çıplak elle dokunmayın, temiz forseps kullanın. - Test striplerinin tanımlaması için kurşun kalem kullanın. Tükenmez kalem vs kullanmayın. ID yi striplerin üzerindeki işaret çizgisinin üstüne yazın. - Test striplerini oluklara, kaplı membranları yukarı bakacak şekilde yerleştirin (bu taraf işaretlenmiştir). - Farklı inkübasyon adımları esnasında, test stripleri daima aynı olukta kalmalıdır. - Kullanılmamış veya geliştirilen stripler yoğun ışık ve ısıdan uzak tutulmalıdır. - Yorumlama, kapatma ve saklamadan önce, striplerin tamamen kurumasını bekleyin. - Renklenmiş kuru stripler tercihen oda ısısında ( C) ve karanlıkta saklanmalıdır. - Olukları tekrar kullanmayın.

8 80558 INNO-LiPA CFTR17+ Tn Update / v4 / FRI40998 p 8/15 Manuel inkübasyon talimatları - Hibridizasyon ve stringent wash esnasında inkübasyonun 47 C ± 0.5 C'de tutulması, yanlış pozitif (çok düşük sıcaklık) veya yanlış negatif / çok zayıf sinyallerin ( çok yüksek sıcaklık) önlenmesi adına en kritik adımlardır. Eğimli kapaklı bir çalkalamalı su banyosu sıcaklık değişimleri üzerinde iyi bir kontrol sağlar. Sıcaklığın iyi bir şekilde kontrol edilmesi için, kalibre edilmiş termometre kullanılmalıdır. - Yanlış pozitif sinyallerden kaçınmak için inkübasyon sırasında daima su banyosunun kapağını kapalı tutun. - Hibridizasyon ve stringent wash için sıcak hava karıştırıcısı kullanmayın! - Hibridizasyon ve stringent wash için oluklar, su banyosunun sallanan platformuna yerleştirilmelidir. Su seviyesini oluk yüksekliğin üçte birine veya yarısına gelecek şekilde ayarlayın. Olukların suyun üstünde kalmadığından emin olun. Su oluklar ile doğrudan temas halinde olmalıdır. - Renk gelişimi için inkübasyonlar 20 ile 25 C arasında yapılmalıdır. Sıcaklık 20 C'nin altındaysa, zayıf sonuçlar elde edilebilir. Sıcaklık 25 C'nin üstünde ise, yüksek arka plan ve / veya yanlış pozitif sinyalleri alınabilir. - Hem sallanan (hibridizasyon prosedürü) hem de çalkalayıcısu banyosu (renk geliştirme prosedürü) tarafından oluşturulan hareket genliği, maksimum hassasiyet ve homojen boyama sağlamak için kritik önem taşır. Strip yüzeyi tamamen suya batmış olmalıdır. Genlik mümkün olduğunca yüksek olmalıdır, ayrıca hem sıvı hem de test stripleri oluk içinde ileri geri hareket edecek şekilde olmalıdır.. Bununla birlikte, olukların kenarlarından sıvı dökülmesinden kaçınılmalıdır! Bu, çapraz kontaminasyona ve geçersiz sonuca yol açabilir. - Tepsiyi kapatmayın. Hibridizasyon ve stringent wash inkubasyonları esnasında, oluklar su banyosunda açıkta kalabilir. Mikroplak kapağı ile olukların kapatılması, çapraz kontaminasyona neden olabilir. Oluklarının içindeki sıvının manuel değişimi için talimatlar - Sıvı oluktan, tercihen vakum aspiratörüne bağlı bir pipet ile aspire edilmelidir. Tepsi, tüm sıvının oluğun bir ucuna akmasına izin verecek bir açıyla tutulur. - Her oluğa uygun solüsyondan 2 ml ilave edin ve test prosedürüne devam edin. Bunun için multipipet (Eppendorf) kullanmak faydalı olacaktır. - Bu adımı, test prosedüründe belirtildiği kadar tekrar edin. NOT: İki adım arasında striplerin kurumasına izin vermeyin. Aspirasyon yaparken striplerin yüzeylerinin zarar görmediğinden emin olun. Sıvıyı, stripin üst kısmından işaret çizgisine kadar aspire edin. Stribin tamamının solüsyonun içine tamamen daldırarak, tamamen yıkanmış olduğundan emin olun. Gerekirse çalkalayıcının hızını ayarlayın.

9 80558 INNO-LiPA CFTR17+ Tn Update / v4 / FRI40998 p 9/15 Uyarılar ve önlemler - Sadece profesyonel kullanım içindir. - DNA kontaminasyonunu önlemek için, pre- ve post- amplifikasyon aşamaları arasında maksimum fiziksel ayrım yapılması önerilir: ayrı odalar, ayrı pipetler ve başka laboratuar malzemeleri, ayrı laboratuar giysileri ve eldivenler (ve stokları) iyi laboratuvar uygulaması için gereken minimum önlemlerdir. - Post amplifikasyon odasından, pre amplifikasyon odasına herhangi bir dönüş yapmayın. - Otoklavlanmış tek kullanımlık laboratuar malzemesi kullanılması tavsiye edilir. - Tek kullanımlık laboratuar malzemelerini tekrar kullanmayın. - Her bir porsiyonlanmış örnek için yeni bir pipet ucu kullanın. - Reaktifleri, son kullanma tarihlerinden sonra kullanmayın. - Reaktiflerin mikrobiyal kontaminasyonundan kaçının. LiPA manual test prosedür NOT: Farklı inkübasyon adımları boyunca, test stripleri hep aynı oluk içinde kalmalıdır. İnkübasyondan önce, kalibre edilmiş bir termometre kullanarak su banyosunun sıcaklığını (47 C ± 0.5 C) kontrol edin ve gerekirse tepsiyi su banyosuna yerleştirmeden önce sıcaklığı ayarlayın. Kapağı her zaman kapalı tutun. Numuneler 1. CFTR amplifiye ürün (10 μl PS part 1-amplifiye ürün kullanın + 10 μl PS part 2- amplifiye ürün). Numune hazırlama için: kullanma talimatlarına bakın Amplification CFTR. NOT: Her iki amplifiye numuneden de tam olarak 10 μl eklendiğine emin olun. Gereğinden fazla veya az örnek yanlış tiplendirmeye sebep olabilir. 2. Kör amplifiye kontrol örneği (negatif kontroller; her iki negatif kontrolden 10 μl kullanın; Amplification CFTR Talimatlarına bakın). Denatürasyon ve hibridizasyon 1. Çalkalayıcılı su banyosunu 47 C ± 0.5 C ye ısıtın. Sıcaklığı kalibre edilmiş bir termometre ile kontrol edin ve gerekirse ayarlayın. Belirtilen sıcaklığı aşmayın. Hibridizasyon ve stringent wash solüsyonunu en az 37 C'lik bir su banyosunda önceden ısıtın, sıcaklık 47 C'yi geçmemelidir. Solüsyonları kullanmadan önce karıştırın. Bütün kristaller çözülmelidir. 2. Forsepsler kullanarak, tüpten gerekli sayıda INNO-LiPA CFTR17+Tn Update stribi çıkartın (test örneği başına bir strip). Kör (Blank) amplifiye kontrol numunesi için de bir strip ekleyin. Strip üzerindeki kahverengi markır çizgisi üstünde kimlik numarasını kurşun kalemle yazın. 3. Gereken sayıda test oluğu alın ve tepsiye yerleştirin ( her strip için bir oluk). 4. Her oluğun üst köşesine 10 µl Denaturation Solution pipetleyin. Not: Kullandıktan sonra şişenin kapağını derhal kapatın μl PS part 1-amplifiye ürün ekleyin ve aşağı-yukarı pipetleyerek aşağı-yukarı ile dikkatlice karıştırın. Her zaman steril pipet ucu kullanın. 6. Hemen 10 μl PS part 2- amplifiye ürün ekleyin ve aşağı-yukarı pipetleyerek aşağıyukarı ile dikkatlice karıştırın. Her zaman steril pipet ucu kullanın. Denatürasyonun gerçekleşmesi için C de, 5 dakika bekletin.

10 80558 INNO-LiPA CFTR17+ Tn Update / v4 / FRI40998 p 10/15 7. Önceden ısıtılmış hybridization solution ı çalkalayın ve her oluğa denatüre olmuş amplifiye ürüne n.yavaşca 2 ml ekleyin. Yavaşça çalkalayarak karıştırın. Pipetleme sırasında komşu olukları kontamine etmemeye özen gösterin. 8. Stripleri derhal işaretli membran tarafı yukarıya bakacak şekilde oluklara yerleştirin. Stripler solüsyona tamamen batırılmış olmalıdır. Not: Tek kullanımlık eldiven giyin ve forseps kullanın. 9. Tepsiyi 47 C ± 0.5 C çalkalayıcı su banyosuna yerleştirin (80 rpm; manuel inkübasyon için Talimatlara bakın), kapağı kapatın ve 90 dakikainkübe edin Not: Suyun, banyodan oluklara sıçramasını önleyin. Su seviyesini oluk yüksekliğin üçte birine veya yarısına gelecek şekilde ayarlayın. Tepsinin kaymasını engellemek için, tepsiyi iki ağırlık arasında sabitleyin. Stringent wash 1. Hibridizasyonun ardından tepsiyi su banyosundan çıkarın. 2. Tepsiyi düşük açıda tutun ve sıvıyı tercihen vakum aspiratöre bağlı bir pipetle oluktan aspire edin. Her oluk içine 2 ml önceden ısıtılmış stringent wash solution ekleyin ve tepsiyi C de (10-20 saniye) hafifçe sallayarak yıkayın. Her oluktan solüsyonu aspire edin. Bu kısa yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın (ayrıca "Oluklarının içindeki sıvının manuel değişimi için talimatlar"a bakınız). 3. En son, solüsyonu aspire edin ve her stribi 2 ml önceden ısıtılmış stringent wash solüsyonu içinde 47 C ± 0.5 C deki çalkalayıcı su banyosunda 30 dk inkübe edin. Su banyosun kapağını kapatın. İnkübasyondan önce kalibre edilmiş bir termometre kullanarak su banyosunun sıcaklığını kontrol edin, gerekli ise sıcaklığı ayarlayın. Kapağı her zaman kapalı tutun. Not: Stringent wash esnasında conjugate ve rinse konsantratını dilüe edin. Bkz. Reaktifler Renk gelişimi Sonraki tüm inkübasyonlar, çalkalayıcıda C de gerçekleştirilir. İnkübasyon sırasında, sıvı ve test stripleri, homojen bir boyama için oluk içinde ileri ve geri hareket ettirmelidir. 1. Her bir stribi 2 ml rinse solüsyonu kullanarak 1 dakika boyunca iki kez yıkayın (Bkz. "Oluklarının içindeki sıvının manuel değişimi için talimatlar"). 2. Her oluğa 2 ml conjugate working solution (bkz. "Reaktifler") ilave edin ve çalkalayıdaki tepsi çalkalanırken 30 dakika inkübe edin. Not: Konjugat inkübasyonunun bitiminden yaklaşık 10 dakika önce BCIP/NBT Substrat Solüsyonunu dilüe edin. Bkz. Reaktifler 3. Her bir stribi, 2 ml rinse working solution kullanarak, 1 dakika boyunca iki kez yıkayın ve ardından 2 ml'lik substrat buffer ile bir kez daha yıkayın. 4. Her oluğa 2 ml dilüe substrate working solution (bkz. "Reaktifler") ilave edin ve çalkalayıcı üstünde tepsi çalkalanırken 30 dakika inkübe edin. 5. Tepsi en az 3 dakika boyunca çalkalayıcı üzerinde çalkalanırken, stripleri 2 ml distile su içinde, iki kez yıkayarak renk gelişimini durdurun.

11 80558 INNO-LiPA CFTR17+ Tn Update / v4 / FRI40998 p 11/15 6. Forseps kullanarak, stripleri oluklardan çıkarın ve kurutma kağıdı üzerine koyun. Sonuçları okumadan önce stripleri tamamen kurutun. Renklenmiş ve kurumuş stripleri karanlıkta saklayın. Otomatik test prosedürleri: Dökümanlar ve ilişkili protokoller Fujirebio Avrupa N.V. den edinilebilir (Bkz. Sonuçlar Okuma Şekil 1 INNO-LiPA CFTR17+Tn Update stribi üstünde faklı oligonükleotid problarının pozisyonunu gösterir. Test prosedürünün sonunda net bir mor / kahverengi bant görünüyorsa,bu bant/çizgi pozitif olarak kabul edilir. Şekil 1: Onaylama INNO-LiPA CFTR17+Tn Update stribinde üst markır çizgisi (kahverengi çizgi), Tn probları üstündeki ikinci markır çizgisi (mavi çizgi), konjugat kontrol çizgisi ve 36 sequence-spesifik DNA problarının konumu - Her test çalışmasına, bir negatif amplifiye kontrol örneği dahil edilmelidir. Her yeni test prosedüründe olduğu gibi, test prosedürünü doğru bir şekilde yapıldığından emin olunana kadar, test prosedürüne ilave pozitif ve negatif kontroller dahil edilmesi önerilir. Uygun test koşullarının oluşturulduğunu doğrulamak için referans DNA'nın kullanılması önerilmektedir. - INNO-LiPA CFTR17+Tn Update stribinde en üstteki çizgi markır çizgisidir (kahverengi çizgi). Bu çizgi, stribin doğru oryantasyonda olmasını sağlar. - Sonraki çizgi tespit prosedürü esnasında, reactive conjugate ve substrate working solution eklenip eklenmediğini kontrol eder. Bu çizgi, plastik okuma kartındaki konjugat kontrol çizgisi ile hizalanmalıdır. Çizgi daima pozitif olmalı ve aynı test çalışmasında her strip yaklaşık aynı yoğunluğa sahip olmalıdır. - Her bir amplifiye kontrol numunesinin test sonucu, stripte konjugat kontrol çizgisi hariç herhangi bir görünür sinyal vermemelidir. - Strip üzerindeki probların renk yoğunlukları, bir çizgiden diğerine farklılık gösterebilir.

12 80558 INNO-LiPA CFTR17+ Tn Update / v4 / FRI40998 p 12/15 Sonuçların yorumlanması - İlk olarak her bir stribi doğrulamak için kontrol çizgisinin pozitifliğini kontrol edin (üstteki işaret çizgisinden sonraki ilk çizgi) (Validasyon kısmına bakın). - Stripteki işaret çizgisi(kahverengi) plastik okuma kartındaki işaret çizgisi ile hizalanmalıdır. - INNO-LiPA CFTR17+Tn Update stribi 16 wild-tip prob (W.-tipleri) ve 17 mutant-tip prob (M.- tipleri) ve 3 Tn probu içerir. W.2183AAG=W.2184delA, 2183AAG ve 2184delA için wild-tip sekansıdır - INNO-LiPA CFTR17+Tn Update stribinde pozitif olan tüm probları belirleyin. - W.-tip ve M.-tip problarının yorumlanması: Görünür bir çizginin varlığı, W.-tipi veya M.-tipi sekanslarının bir veya her iki allelde de mevcut olduğu anlamına gelir. Belli bir W.-tip alleli için homozigot olan bireyler, ilgili M.-tip probu için değil, sadece ilgili W.- tip probu için pozitif sinyal gösterir. Belli M.- tip alel için homozigot olan bireyler sadece ilgili M.-tip probu için pozitif sinyal gösterir, ilgili W.- tip probu için değil. Belli mutasyon(lar) için heterezigot veya bileşik heterezigot olan bireyler, her iki ilgili W.- ve M.-tip probları için de pozitif sinyal gösterir. - Tn problarının yorumlanması (isteğe bağlı): Görünür çizginin varlığı, ilgili Tn dizisinin bir veya her iki alelde bulunduğu anlamına gelir. Belli Tn aleli için homozigot olan bireyler, sadece ilgili Tn probu için pozitif sinyal gösterir. - R117H tespit edildiğinde, T5 veya T7 durumu ayrıca belirlenmelidir. R117H T5 veya T7 ile cis olarak bulunabilir. R117H-T5, hafif bir CF'ye neden olan kompleks alel olarak düşünülür; R117H-T7 muhtemelen bir CFTR ile ilişkili bozukluk mutasyonu olarak kabul edilir. R117H-T7, CF'ye neden olan bir mutasyondaya da muhtemelen homozigotluk derecesinde bileşik heterozigotlukta görülürse, genellikle pankreatik yeterli CF ile sonuçlanırken R117H-T7, hafif bir CF, obstrüktif azoospermi veya hiç hastalık göstermeyebilir. (Castellani C, Cuppens H, Macek JR M et al. Klinikte kistik fibroz mutasyon analizinin kullanımı ve yorumlanması konusundaki fikir birliği. J Cyst Fibros 2008; 7: ). (Dequeker E, Stuhrmann M, Morris MA et al. Kistik fibroz ve CFTR ile ilgili bozuklukların moleküler genetik teşhisi için, en iyi uygulama kılavuzları - güncellenmiş Avrupa önerileri. Eur j Hum Genet 2008; 1-15) Görünür anormal reaksiyon şablonları - W.2183AAG, 2183AAG ve 2184delA için W.-tip diziyken, bir homozigot 2183AAG/2183AAG, bir homozigot 2184delA/2184delA, veya bileşik heterezigot 2183AAG/2184delA hasta örneği W.2183AAG probuyla sinyal göstermez. - W.711+5GA (INNO-LiPA CFTR17+Tn Update strip üstünde bulunan) 711+5GA ve 711+1GT için W.-tip diziyken (INNO-LiPA CFTR19 stribinde bulunan), bir homozigot 711+1GT/711+1GT, bir homozigot 711+5GA/711+5GA, veya bileşik heterezigot 711+1GT/711+5GA hasta örneği W.711+5GA probuyla sinyal göstermez. - Homozigot CFTRdele2,3 (21kb)/CFTRdele2,3 (21kb) hasta örneği için INNO- LiPA CFTR17+Tn Update üzerinde ekzon3 W.-tip sekans(w.e60x, W.G85E, ve W.394delTT) ile sinyal yoktur.

13 80558 INNO-LiPA CFTR17+ Tn Update / v4 / FRI40998 p 13/15 - Aşağıdaki diğer nadir CFTR mutasyonları çapraz-reaktivite için değerlendirilmiştir ve INNO-LiPA CFTR17+Tn Update testiyle tespit edilmedi: 2184insA (ekzon 13), delG (intron 14b), R347H (ekzon 7), R117C (ekzon 4), 621+2TC (intron 4), ve 711+3AG (intron 5). - Bir hasta 3617G->T polimorfizm için homozigot olduğunda W.R1162X probuyla sinyal elde edilmedi. - Tanımlanmış ile 9T-probunun zayıf bir çapraz reaktivitesi (Kobler D, Modi H, Goldman B. CFTR geni intron 8 in poliprimidin yolunda 11T allelinin tanımlanması Genet Med 2006; 8: 125-8) ve nadir 11T-alleli gözlenmiştir. - R117H probu ile R117P mutasyonu için çapraz reaktivite gözlemlendi. - Bir homozigot E60X numunesi için, karşılık gelen w. tip probu üzerinde, çapraz reaktivite gözlemlenebilir. Yorumlama yazılımı: LiRAS LiPA Cystic Fibrosis için LiRAS yazılımı, LİPA sonuçlarının yorumlanmasına yardımcı olmak üzere tasarlanmıştır. En son güncellenen versiyonu edinmek için, lütfen yerel distribütörünüz ile temasa geçin. Prosedür sınırlamaları - Bu ürün sadece amplifikasyon ve hibridizasyon teknikleri konusunda eğitim almış personel tarafından kullanılmalıdır. - Spesifik hibridizasyon ve hedef DNA'nın doğru tiplendirilmesi, iyi laboratuar uygulamaları ve belirtilen prosedürlerin dikkatli bir şekilde uygulanması ile sağlanır. - Yorumlanabilir olmayan veya yanlış sonuç CFTR polimorfizimlerinin varlığı veya problarımızın bölgesinde veya primerlerimizin 3' kısmındaki başka nadir CFTR mutasyonlarının varlığı nedeniyle oluşabilir. - Bir bileşik heterozigot numune için, mutasyonlar bir veya iki kromozom üzerinde yer alıyorsa, LiPA testi bunu açığa çıkaramaz. Ancak ebeveyn DNA örnekleri ayrıca yanlış yorumlama riskini azaltmak için INNO-LiPA CFTR17+Tn Update ile test edilebilir. - Kit içinde olmayan diğer mutasyonların olması da mümkündür ve ancak bunlar bu nedenle tespit edilemez. - Aplikasyon aralığının üst sınırına yakın konsantrasyondaki çok saf DNA spesifik olmayan reaktivitelere yol açabilir. Test performansı INNO-LiPA CFTR19 ve INNO-LiPA CFTR17+Tn Update - INNO-LiPA CFTR19 ve INNO-LiPA CFTR17+Tn Update performansı harici olarak iki Belçika insan genetikleri laboratuvarında değerlendirildi. Toplam 101 isimsiz numune analiz edildi. - Hibridizasyonlar bir merkezde manuel olarak, bir diğerinde ise Auto-LiPA kullanılarak yapıldı. Sonuçlar görsel olarak yorumlandı. İki stripten elde edilen veri birleştirilerek, her örnek için bir genotip belgelendi.

14 80558 INNO-LiPA CFTR17+ Tn Update / v4 / FRI40998 p 14/15 - Test hassasiyeti ve diagnostik doğruluğu ile ilgili hesaplamalar için sadece INNO- LiPA CFTR19 ve INNO-LiPA CFTR17+Tn Update striplerinde dahil olan mutasyonlar dikkate alındı. Referans test sonucu INNO-LiPA CFTR19 ve INNO-LiPA CFTR17+Tn Update (711+3AG) ile tespit edilemeyen bir mutasyon saptadığı için bir örnek hesaplamaların dışında bırakıldı (aşağıdaki tartışmaya bakın). - Testin hassasiyeti, test edilen örneklerin toplam sayısı üzerinden pozitif sonuçların sayısı olarak hesaplandı (LiPA üstünde başarılı amplifikasyon ve yorumlanabilir sonuç ). Bu değerlendirmede test duyarlılığı %100 (100/100; %95 CI [%95.9; %100]) bulunmuştur. - Diagnostik doğruluk, bir veya daha fazla alternatif tahlil ile elde edilen sonuçla kıyaslandığında doğru tanımlanmış genotiplerin sayısı olarak hesaplandı (INNO- LiPA, Fujirebio Europe N.V.; Elucigene, Orchid; sekanslama; kendi yöntemleri). Avrupa N.V.;Elucigene, Orchid; sequencing; in-house metodlar). Referans sonucu ile tam bir mutabakat elde edildi ve sonuçta % 100 (100/100;% 95 GA;% 96;% 100] teşhis doğruluğu elde edildi. Tn polimorfizmleri 51 örnek için kıyaslanabilirdi, tüm sonuçlar aynıydı. - Strip üzerinde bulunan ancak merkezlere mevcut olmayan mutasyonların yanı sıra, çok sayıda diğer mutasyon dahili olarak değerlendirildi. Tüm örnekler doğru şekilde genotiplendirildi. Ek olarak, kan donörlerinden alınan 13 bukkal fırça ve 20 kurumuş kan spotu değerlendirildi. Her iki durumda da, bukkal fırça ve kurutulmuş kan lekeleri ile elde edilen sonuçlar, aynı kişilerin kan numunelerindeki sonuçlarla aynıdı. Kurumuş kan spotları ve bukkal fırçalar ile elde edilen strip sonuçlarının genel reaktivitesi, tam kan örnekleri ile elde edilen prob reaktivitelerine kıyasla daha az yoğun bulundu. Numune reaktivitesi - Testlerin geliştirilmesi,cftr genindeki diğer mutasyonlar veya polimorfizmlerle çapraz-reaktiviteyi önlemeyi hedeflemiştir. Merkezlerde karşılaşılan aşağıdaki mutasyonlar / polimorfizmler, şstripler üzerinde bulunan problarla herhangi bir çapraz reaktivite göstermemiştir: R117C+R347H+F508C: Dahili veri, 2184insA için çapraz-reaktivite olmadığını kanıtladı. Bir heterezigot örnek için, çapraz-reaktivite prob GA ile GC mutasyonu için gözlendi. - Mutant bantların spesifik olmayan reaktivitesi, bir merkezde 3 örnek için gözlendi ancak tekrar testinde görülmedi. Araştırmacıya göre, spesifik olmayan reaktivite strip ve amplikon/ denatürasyon solüsyonu arasındaki erken temas kaynaklıydı. Diğer merkez ayrıca birkaç örnek için spesifik olmayan reaktiviteler saptamıştır, ancak bunlar yorumlamaya etki etmedi. In-house gözlemler ve merkezden alınan veriler, bunun, uygulama aralığının üst sınırına yakın bir konsantrasyonda çok saf DNA kullanılmasıyla oluşabileceğini düşündürmektedir.

15 80558 INNO-LiPA CFTR17+ Tn Update / v4 / FRI40998 p 15/15 - Paket içindeki prospektüsün "Sonuçların Yorumlanması" bölümünde, vahşi- tip problarının hiçbir reaktivite göstermemesi ihtimalinden bahsedilmektedir. Harici değerlendirmede karşılaşılan örnekler homozigot mutanttı 711+1GT (wild- tip prob 711+5GA/711+1GT), ve F508del/I507del (wild-tip prob F508del/I507del). Mutant probların özgünlüğü nedeniyle, stripte olmayan, ancak problarımızda alan mutasyon taşıyan numuneler ile çok zayıf veya hiçbir reaktivite beklenemez. Örneğin, 711+3AG homozigot mutant wild-tip (homozigot mutant örnekle beklendiği gibi) veya 711+1GT için mutant problarla reaktivite göstermedi ya da 711+5GA. A 2184insA homozigot mutant, mutant 2184delA prob (wild-tip 2184delA probuyla çok zayıf reaktivite gözlendi) ile reaktivite göstermedi. Sırasıyla pozisyon 711 ve 2184 de wildtip veya mutant sekansı için yorumlanabilir sonucun elde edilmediği zaman, klinisyen bu spesifik pozisyonlarda bu numuneleri daha fazla araştırmak üzere uyarılmalıdır. Kesinlik 8 örnek, kurum-içi 3 ayrı kişi tarafından hem manuel hem de Auto-LiPA da olmak üzere 3 ayrı çalışmada, üç farklı membran partisinde, üç kez olmak üzere analiz edildi. Önemli bir varyasyon görülmedi ve genotip yorumlaması tüm durumlarda aynıydı. Reaktivitesi bilinen 5 numuneden oluşan bir yeterlik paneli iki dış merkezden sağlanmış ve ayrıca kurum-içi analiz edilmiştir. Üç laboratuardan alınan sonuçlar tam bir mutabakat sağladı. Lisanslar Bu ürünün satın alınması, alıcının insan in vitro teşhislerinde, teşhisin gerçekleştirilmesi için kullanıma olanak sağlar. Satın alma yoluyla kullanıma ilişkin bu özel kullanım hakkı dışındaki herhangi bir genel patent veya başka herhangi bir lisans verilmemektedir. Ticari markalar INNO-LiPA, Auto-LiPA ve LİRAS ABD ve diğer ülkelerde kayıtlı, Fujirebio Europe N.V. ticari markalarıdır.