Enzim Agregat Sistemlerinde Kinetik Parametrelerin Optimizasyonu

Transkript

1 Akademik Bilişim 213 Akdeiz Üiversitesi, Atalya, Ocak 213 Ezim Agregat istemleride Kietik Parametreleri Optimizasyou Oğuz Akpolat 1 *, Fatma Ayha 1, Gülçi Özevci 2, Haka Ayha 1 1 Muğla ıtkı Koçma Uiversitesi, Fe Fakültesi, Kimya Bölümü, Muğla, Türkiye 2 Ege Uiversitesi, Nükleer Bilimler Estitüsü, İzmir, Türkiye *oakpolat@mu.edu.tr Özet: 2 e yakı kalıtsal hastalık ezim yoksuluğua/ eksikliğie bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. Bu hastalıkları çok azı spesifik diyetle iyileştirilebilmektedir. Buu dışıdaki tedaviler içi geellikle eksikliği duyula ezim metabolizmaya doğruda verilmektedir. Bu durumda hastalık belirtilerii hafiflemesi beklee durum olduğu halde uygu tasarımlar yapılamadığı taktirde tedavi başarısızlıkla da souçlaabilmektedir. Medikal uygulamalarda immobilize ezimleri kullaımı içi başarılı çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Kliik uygulamalar içi tek bir ezimi immobilizasyouu yaı sıra çoklu ezim sistemlerii taşıyıcılı immobilizasyou da çalışıla koular arasıdadır. Acak taşıyıcılı ezim sistemleride taşıyıcı olarak kullaıla doğal ya da setetik polimer, katalitik olmaya kütlesi edeiyle immobilize ezimleri aktiviteside düşüş yaşamasıa ede olmaktadır. Bu çalışmada, taşıyıcılı immobilizasyou getirdiği soruları ortada kaldırmak amacıyla tekli ezim sistemleride, çözümüş ezimleri uygu çapraz bağlayıcı madde kullaılarak ezim moleküllerii ki üzerie bağlama yötemleri ile (yai taşıyıcısız immobilizasyo ile) ezim agregasyou işlemi gerçekleştirilecektir Aahtar kelimeler: Ezim immobilizasyou, optimizasyo, kietik, multi ezim kompleksleri Optimizatio of Kietics Parameters for Ezyme Aggregates ystems Abstract: Geetic diseas early 2 types origiate from lack of ezymes. A few of them could be cured specific diets. Ezyme is give directly to metabolisma as a alterative cure method. If a suitable drug desig was ot doe the cure ca be ieffective. I medical applicatios it was carried out succesfull studies by usig immobilise ezyme. Additioally usig carrier immobilisatio of multiple ezyme systems istead of sigle ezyme immobilizatio are icreased. Because of usig atural or sythetic polymer or ocatalytic mass as carrier ezyme activities decrease. I this study, to elimiate the problems of carrier immobilizatio the ezyme aggregatio will be doe by usig cross-liked ezyme agregates. Keywords: Ezyme immobilizatio, optimizatio, kietics, multi ezyme complex 1. GİRİŞ Medikal uygulamalarda immobilize ezimleri kullaımı içi başarılı çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Kliik uygulamalar içi tek bir ezimi immobilizasyouu yaı sıra çoklu ezim sistemlerii taşıyıcılı immobilizasyou da çalışıla koular arasıdadır. Acak taşıyıcılı ezim sistemleride taşıyıcı olarak kullaıla doğal ya da setetik polimerler, katalitik olmaya kütlesi edeiyle immobilize ezimleri aktiviteside düşüş yaşamasıa ede olmaktadır. 2 e yakı metabolik hastalığı ezim defektie dayadığı bilimektedir. Bu hastalıklarda, geellikle ilgili ezim ya hiç bulumamakta ya aşırı salgılamakta ya da yeterli düzeyde olmamaktadır. Glukoz 6 Fosfat Dehidrogeaz (G6PD) eksikliği, çok yaygı ve çok bilie ezim eksikliğie dayaa bir hastalıktır. Bu eksiklik alyuvarları yıkımıa yol aça iki ayrı hemolitik aemiye (bir tür ileri derecede kasızlık) ede olabilir. Bu hastalıkta hasta kişi (bakla vb) oksitleyici bir maddeyi vücudua aldıkta saat sora hemoliz (alyuvarları yıkımı) bulguları ortaya çıkar [1]. Glukozoksidaz, diyabet hastalarıı ka şekerii kliik aalizide kullaıla bir ezimdir ve kliik ezimleri teşhis amaçlı kit olarak kullaımıda, ezim immobilizasyou araştırıla bir koudur. Kotrollü ilaç salıımı uygulamaları çerçeveside; glukozoksidaz ezimii şeker hastalığıı tedaviside, metabolizmada glukoz kosatrasyoudaki değişimie bağlı olarak vücuda yerleştirile isülii salıımıı kotrol edebilecek bir kit olarak kullaımı ile ilgili literatürde yer ala çalışmalar vardır. Bu yapıla çalışmalarda glukozoksidaz ezimii geellikle taşıyıcılı immobilizasyou kullaılmıştır ve diyabet hastalarıı tedaviside etkili souçlar alımıştır [2, 3]. Taşıyıcıda kayaklaa soruları giderilmesi yöüde araştırmalar ilerlemektedir. Yapıla bu

2 O. Akpolat, F. Ayha, G. Özevci, H. Ayha çalışmada oluşturula multi ezim agregatlarıı bezer bir şekilde tedavi amaçlı ve diyabet hastalarıı yaşam kalitesii artmasıa yöelik çalışmalarda kullaılabileceği düşüülmektedir. Multi ezim kompleksleri, çoklu katalitik merkezler içere, dördücül yapılarla taımlaabile büyük polipeptitlerdir [4]. ubstratlar ardışık çok basamaklı reaksiyoları sırasıda tekli ezimlere azara pek çok avataj sağlayabilirler [5]. Çapraz bağlı ezim agregatları yötemi, birde fazla ezimi bir araya getirilmesi ile kombie edilmiş çapraz bağlı ezim agragatları oluşturmaya olaak taır. Katkı maddelerii varlığıda çapraz bağlı ezim agregatları setezi, immobilize ezimi isteile koformasyoda kilitlemeye yarar. Böylece daha yüksek aktivite ve/veya seçicilik sağlaabilir. Bu çalışma içi aşağıdaki çoklu ezim sistemi seçilmiş ve agregatlarıı hazırlaması ile bu ezim sistemii glukozu idirgeme kietiğii araştırılması düşüülmüştür. Glukozoksidaz- peroksidaz sistemi GOD D-glukoz + O 2 + H 2 O D-glukoikasit + H 2 O 2 POD H 2 O 2 + o-diaizidi o-diaizidi + H 2 O Ezim Kietiği: Ezimler substrata bağlaıp, ardıda ezim-substrat yapısıı oluşturarak tepkimeleri aktivasyo eerjisii düşürür. Ezim kullaımı tepkimei dege sabitii etkilemez. Acak aktivasyo eerjiside, tepkime ayı sıcaklıkta yürütülmesie rağme öemli şekilde düşme gözleir. Şekil 1 de alaşılacağı gibi ezimler özgül oldukları substrat ile etkileşerek ezim-substrat yapısıı oluştururlar [6, 7]. Şekil 1. Aahtar-kilit Modelii Şematik Gösterimi Geel olarak tepkime hızı tepkimeye gire bileşeleri ya da ürüleri zamaa bağlı olarak derişimii bir ifadesi olup, substrat, P, ürü ve E da başlagıçtaki ezim derişimlerii göstermek üzere geel tepkime deklemi içi öerile tepkime hızı aşağıdaki gibi verilmiştir. Bular; [ ] E [ ] m E [ P] m E [ P] E veya (1) E [ ] [ P] (2) veya v k d dp r dt dt (3) olarak yazılır ve ezimatik olmaya birici mertebe tepkimeler içi e basit tepkime kietik modeli (4) şeklide ike, bu ezimatik tepkimeler içi biraz daha karmaşık olup, Michealis- Mete tarafıda aşağıdaki gibi öerilmiş ve uygulamada büyük orada başarı sağlamıştır. v v m [ ] K m [ ] (5) Burada K m ezimatik tepkimeleri içi öerilmiş ola Michealis-Mete kietik sabitii belirtmektedir. ν m ise ulaşılabilecek e yüksek tepkime hızıdır. Tepkime hızlarıı buluması başlı başıa bir işlem olup Şekil 2 de alaşılacağı gibi tepkimeye ilişki çizilecek zama-derişim eğrisii belirlee oktalarıdaki teğetlerii eğimide hesaplaabilir. Tepkime hızıı hesaplaması zamaa ilişki bir limit işlemi olup, aşağıdaki gibi yazılır [8]. t limt Derişim [], [P] d dt Herhagi bir t aıdaki tepkime hızı m v t Herhagi bir t aı t Zama (6) Şekil 2. Tepkime hızlarıı zama-derişim eğriside hesaplaması Çoklu ezim sistemleri kullaımı çalışmaları çok olmamamakla birlikte, bu tür ezim sistemlerii kietik modellemesi içi tekli ezim sistemlerie bezer modeller öe sürülmektedir. Buları e basiti aşağıdaki gibi öerilebilir [7, 9]. E 1 ve E 2 iki farklı ezimi göstermek üzere, E E E P E E P Ü (7) şeklide düşüülüp, buradaki 1 -P 1 döüşmesi de % 1 kabul edilerek 1 =P 1 = olarak Michealis- Mete kietik modeli çift ezim içi aşağıdaki şekilde ampirik model aşağıda suulmuştur, burada Km 1 ve Km 2 birici ve ikici ezime ait Michealis- Mete sabitleridir. Bu modeli çözümüde her iki ezim içi subsrat tüketimii 1 ve 2 gibi belirli oralardaki üstel değişimi de aşağıdaki gibi kabul edilmiştir 3

3 Ezim Agregat istemleride Kietik Parametreleri Optimizasyou v v m * K m1 1 1 * K m2 2 2 (8) U ( i deeysel ihesaplaa ) /( ideeyse ) l i1 i1 (11) 2. YÖNTEM uula çalışmada, Glukozoksidaz ve peroksidaz ezim sistemi çoklu ezim agregatı olarak setezlemiştir. Ezimleri çözümez agregatlarıı oluşturmak içi çözümüş durumdaki ezim, uygu bir proteiik besleyici varlığıda bifoksiyoel çapraz bağlayıcı ile muamele edilmiştir. Bu işlem protei yapısıdaki molekül içi ve moleküller arası etkileşimleri değiştirecek, fiziksel olarak çözümez ezim agregatlarıı oluşturacaktır. E verimli agregat oluşumuu sağlayabilmek içi ezim sistemlerii optimizasyouda bazı değişkeler (başlagıç ezim derişimi, proteiik besleyici derişimi, çapraz bağlayıcı derişimi, ortam ph ı, kullaıla tampo türü) kullaılmıştır. Deklem 8 de verile kietik parametrelerii optimizasyouda çift ezim davraışıı tek ezim davraışı olarak kabulu ve bu kabul soucu tek ezimli Michealis-Mete kietik modelii doğrusallaştırılması ile bulua değerler hesaplama dögüsü içi başlagıç değerleri olarak değerlirilmiştir. Bu işlem sırasıda kietik parametreleri de içere optimizasyo foksiyou J, J i1 ( i deeysel ihesaplaa )2 Miimum (9) şeklide yazılır. [] substrat kosatrasyoua bağlı olarak yazıla bu deklikte reaksiyo hızı v=d[]/dt dir ve daha sora çizile -t grafiği yai derişime ilişki simulasyo eğrisi yie e küçük kareler yötemiyle optimize edilir. -t grafiğii çizimi t= ve = da d/dt=v diferasiyel eşitliğii bir çözümü olup kietik modeli parametreleriide içere J yi miimum yapa değerleri buluması ile mümküdür. Bu optimizasyo problemii çözümü de acak Euler gibi sayısal bir yötemle bu diferasiyel deklemi verile başlagıç koşulları çözümü çerçeveside bir optimizasyo dögüsüyle gerçekleştirilebilir. Böylece kietik parametre değerleri doğrusal olmaya etkileri de içerecek şekilde bulumuş olur ve çözüm içi kullaıla. Euler yötemi kısaca aşağıdaki deklikle ifade edilmektedir [8]: 1 i R * t i i (1) imulasyo eğrilerii deeysel ölçüm değerleriyle uyumu aşağıdaki gibi hesaplamıştır. imulasyo içi hazırlaa yazılım algoritması aşağıda ayrıtılı olarak verilmiştir. % Mugla Uiversitesi Fe Fakultesi Kimya Bolumu % 212 % =============================================== clear all, clc, clf '% C:\...\Ez_Mod_Yas_1_1_1_GOD Agr_Do_Gul_3_i mulasyo_3_gp2.m' % Grafik Koordiatlari Ici Deeysel Olcum Verilerii Alimasi (TOPLAM) Ez_Mod_Yas_1_1_1=... xlsread('ez_mod_yas_1_1_1_god Agr_Do_Gul_1 _Veri_Tablo_3GODPOD.xls'); tc_bas_1(1:6,1:1)=ez_mod_yas_1_1_1(1:6,1: Yc_Bas_1(1:6,1:1)=tc_Bas_1; Vc_Bas_1(1:6,1:1)=tc_Bas_1; Cc_Bas_1(1:6,1:1)=tc_Bas_1; Vv_Bas_1(1:6,1:1)=tc_Bas_1; Yc_Bas_1(i:i,j:j)=Ez_Mod_Yas_1_1_1(i:i,j:j); Cc_Bas_1(i:i,j:j)=Ez_Mod_Yas_1_1_1(7:7,j:j)- Ez_Mod_Yas_1_1_1(i:i,j:j); C=.1; Kod=1; tyc=yc_bas_1(1:6,1:syc=yc_bas_1(1:6,kod+1:kod+ tcc=cc_bas_1(1:6,1:scc=cc_bas_1(1:6,kod+1:kod+ tyc,syc,tcc;scc; % Grafik Koordiatlari Ici Deeysel Olcum Verilerii Alimasi (GOD) Ez_Mod_Yas_1_1_1g=... xlsread('ez_mod_yas_1_1_1_god Agr_Do_Gul_1 _Veri_Tablo_3GODPODg.xls'); tc_bas_1g(1:6,1:1)=ez_mod_yas_1_1_1g(1:6,1: Yc_Bas_1g(1:6,1:1)=tc_Bas_1g; Vc_Bas_1g(1:6,1:1)=tc_Bas_1g; Cc_Bas_1g(1:6,1:1)=tc_Bas_1g; Vv_Bas_1g(1:6,1:1)=tc_Bas_1g; Yc_Bas_1g(i:i,j:j)=Ez_Mod_Yas_1_1_1g(i:i,j:j); Cc_Bas_1g(i:i,j:j)=Ez_Mod_Yas_1_1_1g(7:7,j:j)- Ez_Mod_Yas_1_1_1g(i:i,j:j); C=.1; Kod=1; tycg=yc_bas_1g(1:6,1:sycg=yc_bas_1g(1:6,kod+1:kod+ tccg=cc_bas_1g(1:6,1:sccg=cc_bas_1g(1:6,kod+1:kod+ tycg;sycg;tccg;sccg; % Grafik Koordiatlari Ici Deeysel Olcum Verilerii Alimasi (POD) Ez_Mod_Yas_1_1_1p=...

4 O. Akpolat, F. Ayha, G. Özevci, H. Ayha xlsread('ez_mod_yas_1_1_1_god Agr_Do_Gul_1 _Veri_Tablo_3GODPODp.xls'); tc_bas_1p(1:6,1:1)=ez_mod_yas_1_1_1p(1:6,1: Yc_Bas_1p(1:6,1:1)=tc_Bas_1p; Vc_Bas_1p(1:6,1:1)=tc_Bas_1p; Cc_Bas_1p(1:6,1:1)=tc_Bas_1p; Vv_Bas_1p(1:6,1:1)=tc_Bas_1p; Yc_Bas_1p(i:i,j:j)=Ez_Mod_Yas_1_1_1p(i:i,j:j); Cc_Bas_1p(i:i,j:j)=Ez_Mod_Yas_1_1_1p(7:7,j:j)- Ez_Mod_Yas_1_1_1p(i:i,j:j); C=.1; Kod=1; tycp=yc_bas_1p(1:6,1:sycp=yc_bas_1p(1:6,kod+1:kod+ tccp=cc_bas_1p(1:6,1:sccp=cc_bas_1p(1:6,kod+1:kod+ tycp;sycp;tccp;sccp; % Hiz abiti Degerlerii Alimasi CVm_z11_z12_Km_z21_z22_R=xlsread... ('Ez_Mod_Yas_1_1_1_GOD Agr_Do_Gul_2_Max_ Hiz_Ki_ab_Tablo_2_b3VmKm.xls'); Vm=CVm_z11_z12_Km_z21_z22_R(1,1),Kmm=CVm_z11_z 12_Km_z21_z22_R(1,2) t=; Delt=.1; mumax=vm; % Baslagic degerleri Matematik Modeli cozumu ici % Optimize edilecek parametreler ', mumax ve Km % Baslagicda Zama-Derisim degerlerii optimizasyo ici hesaplamasi % 1=2= % 1 Dousme kabulu % e1 ve e2 ezim etkeli?i <1 t=; s=; sb=c; ss=sb-s; Delt=.1; k=.1; a=2; b1=2; b2=5; 1=.5; 2=1.5; e1=1;e2=1; %'imulasyo_ekil_1_a', t D_K_G(1,1)=t; t D_K_G(1,2)=s; t D_K_G(1,3)=sb; mumax_bas=vm; K_Bas=Kmm; smi=ss*k; % Optimizasyo Ici Baslagic Degerleri k_vm=a; k_km1=b1, k_km2=b2; % Basit Optimizasyo Taramasi ici mumax=vm*k_vm; Km1=Kmm*k_Km1; Km2=Kmm*k_Km2 % Optimizasyo Ici Hesaplaa Degerler for i=2:61 % Euler Dogusu mu1=(e1*(ss-smi)^1/(km1+(ss-smi)^1));mu2=(e2*(sssmi)^2/(km2+(ss-smi)^2)); mu=mumax*mu1*mu2; Del=mu*Delt; s=s+del; t=t+delt; ss=sb-s; t D_K_G(i,1)=t; t D_K_G(i,2)=s; t D_K_G(i,3)=sb-s; xlswrite('ez_mod_yas_1_1_1_god Agr_Do_Gul_ 3_imulasyo_3.xls',t D_K_G); t_im_do_kal_glu=xlsread... ('Ez_Mod_Yas_1_1_1_GOD Agr_Do_Gul_3_imul asyo_3.xls'); _legth=legth(t_im_do_kal_glu);t=t_im_do_kal_glu(1: _legth,1: im_do_glu=t_im_do_kal_glu(1:_legth,2:2); im_kal_glu=t_im_do_kal_glu(1:_legth,3:3); % Model Cozumu Degerleride imulasyo Grafigii Cizdirilmesi figure( hold o grid plot(t,im_do_glu,'m-', t,im_kal_glu,'b-', tyc, syc,'m*', tcc, scc,'b+'); title... ('mu=mumax*(e1*1^1/km1+1^1)*(e2*2^2/km2+2^2) -Vm=.62;Kmm=.3'); xlabel('ure (dak)'); ylabel('glukoz Derisimi (M)'); leg('douse-god-pod-.1-mumax=vm*a','kala - Km1=Kmm*b1 - Km2=Kmm*b2');grid; gtext('k=.1; a=3; b1=3; b2=4; 1=.5; 2=1.5; e1=1;e2=1;'); % ekil Dosyasii aklamasi ave... % C:\...\...\Ez_Mod_Yas_1_1_1_GOD Agr_Do_Gul_3 _imulasyo_ekil 1x sb=c; % imulasyo Degerlerii Deeysel Degerlere Uyum Optimizasyou %Baslagic kosatrasyouda Zama-Derisim degerlerii alimasi tcc;scc; %imulasyo kosatrasyouda Zama-Derisim degerlerii alimasi tcc_s; scc_s; tcc(1:1,1: scc(1:1,3: tcs(1,1)=t D_K_G(1, scs(1,1)=t D_K_G(1,3); for i=2:6 tcs(i,1)=t D_K_G((i-1)*1+1, scs(i,1)=t D_K_G((i- 1)*1+1,3); scc_top=;scs_top=; scc_top=scc_top+(scc(i)- scs(i))^2;scs_top=scs_top+(scc(i))^2; R2=(1-(sCc_Top^.5/sCs_Top^.5)); J=R2; '% Optimizasyo Ici Baslagic Degerleri' mumax_bas, K_Bas '% Basit Optimizasyo Taramasi' k, a, b1,b2, smi, mumax, Km1, Km2, 1, 2, J % ONUÇLAR VE TARTIŞMA uula çalışmada, Glukozoksidaz ve peroksidaz ezim sistemi çoklu ezim agregatı olarak setezlemiştir. Elde edile çiftli ezim sistemii glukozu idirgemesi sırasıdaki aktivitesi ölçülmüştür. Deemeler sırasıda farklı başlagıç ezim derişimleride çalışılmıştır. Bu kosatrasyolarda.1 M lık başlagıç ezim derişimide yapıla deemelerde döüşe glukoz ve hidroje peroksit miktarları ölçülmüş ve bu ölçüle deeysel değerler simule edilerek oluşa tepkime kietiğie ait parametreler optimize edilmiştir..1 M lık başlagıç ezim derişimide yapıla deemelerde ölçülmüş ola döüşe glukoz ve hidroje peroksit derişimleri Çizelge 1 de verilmiştir. Çizelge 1. Ölçüle Glukoz ve Hidroje Peroksit Derişimleri üre (dak) Toplam Döüşe Glukoz miktarı (M) Döüşe Glukoz miktarı (M) Döüşe H2O2 Miktarı (M)

5 Ezim Agregat istemleride Kietik Parametreleri Optimizasyou Optimizasyo souçları içi çizile simulasyo souçları Çizelge 2 de ayrıtılı olarak verilmiş olup e yüksek uyum göstere simulasyo grafiği de Şekil 3 de verilmiştir. Çizelge 2. Optimize edilmiş Michealis-Mete kietik parametreleri N v m Km1 Km2 1 2 J o [6] heldo, R.A, 27, Ezyme Immobilizatio: The Quest for Optimum Performace, Adv. yth. Catal Wiley-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA, Weiheim, s [7] LabTutorials/Carboxypeptidase/carboxypeptidase.ht ml, [8] Lübbert, A., imutis, R.; Volk, N.,.; Galvauskas, V., 2, Biochemical Process Optimizatio ad Cotrol, Hads-o Course, Marti Luther Uiversitat, Germay [9] Türker, M., 25, Biyoreaksiyo Mühisliği- Biyolojik Prosesleri Modellemesi ve Kietiği, u Vakfı Yayıları mu=mumax*(e1*1 1/Km1+1 1)*(e2*2 2/Km2+2 2)-Vm=.62;Kmm=.3.1 Douse-GOD-POD-.1-mumax=Vm*a.9 Kala -Km1=Kmm*b1 - Km2=Kmm*b2.8.7 Glukoz Derisimi (M) k=.1; a=3; b1=3; b2=4; 1=.5; 2=1.5; e1=1;e2=1; ure (dak) Şekil 3. Muhtelif optimizasyo sabitleri içi simulasyo eğrilerii uyumu (J =.9171) 4. KAYNAKLAR [1] Drousiotou A., Touma E.,Adreou N., Loiselet J., Agastiiotis M., Verrelli B., Tishkoff., 24, Molecular characterizatio of G6PD deficiecy i Cyprus, Blood cells, Molecules ad Diseases, 33:25-3 [2] Brahim., Nariesigh D., Guiseppi-Elie A., 22, Bio-smart hydrogels: co-joied molecular recogitio ad sigal trasductio i biosesor fabricatio ad drug delivery, Biosesors ad Bioelectroics 17: [3] Liu T., Yao Z., Dig L., 24, Developmet of a amperometric biosesor based o glucose oxidase immobilized through silica sol-gel film oto Prussia Blue modified electrode, esors ad Actuators B, 11: [4] Berg, J.M. Tymoczko, J.L. tryer, L., 22, Biochemistry, fifth ed., W.H. Freema, NewYork [5] pivey H.O., Ovadi J., 1999, ubstrate chaelig, Methods 19 (2) ()