IVD. İSİM Ur. parvum/urealyticum Real-TM

Transkript

1 IVD REF TB19-100FRT VER in Vitro Diagnostik Kullanım için RotorGene 3000/6000 (Corbett Research), SmartCycler (Cepheid), iq icycler and iq5 (Biorad), Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR Systems (Applera) ile kullanılan Ureaplasma parvum/urealyticum Real-TM Kullanılan Semboller REF Liste Numarası 2-8 C de saklayın IVD in Vitro Diagnostik kullanım için Dikkat! LOT Lot Numarası VER Versiyon Son Kullanma Tarihi Kullanım Bilgileri Reaktif İçerir Üretici İSİM Ur. parvum/urealyticum Real-TM GİRİŞ STDs (cinsel yolla bulaşan hastalıklar) cinsel aktivite yoluyla elde edilen viral, bakteriyel ve paraziter enfeksiyonların bir çeşididir. Frengi ve gonorrhea gibi bazı STD ler yüzyıllardır bilinmektedir ve HIV gibi diğerleri ise son birkaç yılda tespit edilmiştir. STD'ler 25 organizmdan daha fazla enfeksiyonlardan kaynaklanmaktadır. Daha fazla organizma tanımlandığı için STD'lerin sayısı artmaya devam ediyor. STD'ler içerenler şunlardır: klamidya, gonorrhea, herpes, HIV, HPV, frengi, Ureaplasma, Mycoplasma, Gardnerella ve trichomoniasis. Nükleik asit amplifikasyon teknolojisine dayalı testlerin gelişmesi STD teşhis alanında en önemli ilerleme olmuştur. Nükleik asit amplifikasyon çok duyarlı ve yüksek derecede spesifik olduğu için normalde klinik bakıma ihtiyaç duyulmayan asemptomatik kişilerde enfeksiyonlar tarama için noninvaziv örnekleme teknikleri kullanmaya fırsat sağlar. KULLANIM AMACI Kit Ur. parvum/urealyticum Real-TM ürogenital swablar, idrar, prastatik sıvı ve diğer biyolojik materyallerde Ureaplasma parvum/urealyticum in kalitatif tespiti için bir testtir. TEST PRENSİBİ Kit Ur. parvum/urealyticum Real-TM iki temel aşamaya dayanır: örneklerden DNA izolasyonu ve Real Time amplifikasyon. Ureaplasma parvum/urealyticum DNA örneklerden ekstre edilir, Real-Time amplifikasyon kullanılarak amplifiye edilir ve Ureaplasma DNA ve Internal Kontrol için floresan reporter spesifik boya probları ile tespit edilir. İnternal Kontrol (IC) her biri tek tek işlenen örneğin amplifikasyon kontrolünü ve olası reaksiyon inhibisyonu tanımlanmasını sağlar. Ureaplasma parvum,

2 FAM (Yeşil) kanalında, Ureaplasma urealyticum JOE (Sarı)/Cy3/HEX kanalında ve IC DNA, ROX (Turuncu)/Texas Red kanalında tespit edilir. KİT İÇERİĞİ Part N 1 DNA-Sorb-A : örnek hazırlama; Part N 2 Neisseria gonorrhoeae TM : Real Time amplifikasyon. Part N 1 DNA-sorb-A : Lizis Solüsyonu, 30 ml; Sorbent, 2 x 1,0 ml; Yıkama Solüsyonu, 100 ml; DNA-eluent, 2 x 5 ml. Transport ortamı, 30 ml. 100 test için gerekli reaktifler içerir. Part N 2 Ureaplasma parvum/urealyticum TM : PCR-mix-1-FRT, 1,2 ml; PCR-Buffer-FRT, 2 x 0,35 ml; TaqF Polimeraz, 0,06 ml; Poz Kontrol Kompleks C+, 0,2 ml; Negatif Kontrol C-, 1,2ml;* Internal Kontrol IC, 1,0 ml;** DNA-buffer, 0,5 ml; 110 test için gerekli reaktifler içerir. * Ekstraksiyonun Negatif Kontrolü olarak izolasyon prosedüründe kullanılmalı. **Örnek/lizis karışımına (DNA-Sorb-A REF K-1-1/A protokol bakın) direk olarak DNA izolasyon sırasında 10 µl Internal Kontrol ekleyin. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Zone 1: örnek hazırlama: Biyolojik kabin eppendorf tipi tüpler için masa mikrosantrifüj (RCF max. 16,000 x g); Eppendorf 5415D ya da benzeri 60 C ± 2 C kuru ısı bloğu Vorteks mikser Aerosol bariyerli pipetörler ( 5-40 µl; µl; µl) 1,5 ml polipropilen steril tüpler (Sarstedt, QSP, Eppendorf) Tek kullanımlık eldiven, pudrasız Biyo tehlikeli atık konteynarı Buzdolabı Dondurucu Zone 2: Real Time amplifikasyon: Real Time Thermalcycler Workstation Aerosol bariyerli pipetörler ( 0,5-10 µl; 5-40 µl) Tüp rackları UYARILAR VE ÖNLEMLER 1. Lizis Solusyonu, guanidine tiyosiyanat içerir. Guanidine tiyosiyanat solunursa, deri ile temas ederse ya da yutulursa zararlıdır. Asitler ile teması toksik gaz oluşumuna neden olur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). 2. Örnekler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler, laboratuar giysisi ve göz koruyucu kullanın. Çalışmalardan sonra ellerinizi yıkayın.

3 3. Ağızla pipetleme yapmayın. 4. Laboratuar çalışma alanında yemek yemeyin, bir şey içmeyin, kozmetik uygulamayın ya da kontak lenslerini ellemeyin. 5. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. 6. Tüm örnekleri ve kullanılmayan reaktifleri yasal düzenlemelere göre yok edin. 7. Örnekler potansiyel enfeksiyon faktörü olarak kabul edilmeli ve biyolojik kabinlerde Biyo güvenlik Seviye 2 ya da diğer uygun biyo güvenlik pratiklerine göre çalışılmalıdır. 8. Dökülen tüm örnekler ya da reaktifleri 0,5% sodyum hipoklorit ya da uygun diğer dezenfektanlar ile temizleyin. 9. Örnekler ve reaktiflerin deri, gözler ve mukoz membranlar ile temasından kaçının. Eğer bu solüsyonlar ile temas ederse bol su ile yıkayın ve doktorunuza başvurun. 10. Material Safety Data Sheets (MSDS) istenildiğinde verilebilir. 11.Bu kit DNA-Sorb ekstraksiyon kiti ile kullanılmak için dizayn edilmiştir. Eğer DNA-Sorb dan başka bir kit ile DNA ekstraksiyonu yapılıyorsa bu kullanıcı sorumluluğundadır. 12. Bu kiti ancak DNA amplifikasyon tekniği bilgisi olan kişiler kullanmalıdır. 13. Laboratuardaki iş akışı Ekstraksiyon alanından başlayıp Amplifikasyon ve Belirleme alanlarına doğru tek bir kişinin yönetiminde olmalıdır. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri bir önceki çalışma alanına geri götürmeyin. SAKLAMA KOŞULLARI Ur. parvum/urealyticum Real-TM +2-8 C de saklanabilir. TaqF Polimeraz -20 C de saklanmalıdır. Bu kit 2-8 C de taşınır fakat -8 C ve -20 C de saklanmalıdır. KARARLILIK Ur. parvum/urealyticum Real-TM etiketi üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. Ürünün performansı etiket üzerinde yazılı kontrol tarihi ile sağlanacaktır. Işık, ısı ya da neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerin raf ömrünü etkileyebilir. Tekrarlanan çözdürme ve bu reaktiflerin dondurulması duyarlılığı azaltabildiği için bu durumdan kaçınılmalıdır. ÖRNEK SAKLAMA, TOPLAMA VE TRANSPORT Ur. parvum/urealyticum Real-TM aşağıdaki materyallerden DNA-Sorb-A (REF K-1-1/A)lı ekstre edilmiş DNA lar ile analiz edilebilir: servikal, üretral, konjonktival swablar: nükleaz-free 1,5 ml tüpe swabı ekleyin ve 0,2 ml Transport medyum ekleyin saniye boyunca ortamda swabı yavaşça sallayın. İdrar sediment( ilk akıntıyı kullanın); prostatik sıvı Eppendorf tüpte saklanan; seminal sıvı: yaklaşık 30 μl seminal sıvıyı polipropilen tüplere (1,5 ml) aktarın ve 70 μl steril tuz solusyonu ekleyin; Toplamadan hemen sonra örneklerin çalışılması önerilir. 24 saatten daha uzun olmamak kaydıyla örnekleri 2 8 C de ya da daha uzun saklamak için 20/80 C de saklayın. Klinik örneklerin transportu, etiyolojik ajanların transportu için ülkesel, federal, lokal ve yasal düzenlemelere göre yapılmalıdır. KALİTE KONTROL Tamamen kit, RotorGene 6000 (Corbett Research) de test edilir. Daha fazla bilgi için: info@sacace.com. ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA 1. Lizis Solüsyonu ve Yıkama Solüsyonu (diğerleri +2-8 C de saklanmasına rağmen) buz kristalleri çözülene kadar C ye kadar ısıtılır. Negatif Kontrol Ekstraksiyonu için bir tüp içeren 1,5 ml polipropilen tüplere gerekli miktarda hazırlayın. 2. Her bir tüpe 300 μl Lizis Solüsyonu ve 10 µl Internal Kontrol ekleyin. 3. Uygun tüplere 100 μl örnek ekleyin. 4. Aşağıdaki gibi Kontrolleri hazırlayın: Cneg işaretli tüpüne 100 μl C Negatif Kontrol ekleyin.

4 5.Tüpleri vorteksleyin ve 65 C de 5 dakika inkübe edin. 5-7 saniye santrifüj edin. Eğer örnek tamamen çözülmezse, maksimum hızda ( g.) 5 dakika tüpleri tekrar santirifüj edin ve DNA ekstraksiyonu için yeni bir tüp içine supernatantı aktarın. 6. Sorbenti şiddetlice vorteksleyin ve her bir tüpe 20 μl ekleyin saniye vorteksleyin ve tüm tüpleri oda ısısında 3 dakika inkübe edin. Bu adımı tekrar edin. 8. Tüm tüpleri 5000g de 30 sn santrifüj edin ve aerosol bariyerli mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 9.Her bir tüpe 500 μl Yıkama Solüsyonu ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 8000g de 30 saniye santrifüjleyin. Her bir tüp için alın ve supernatantı atın. Tüpler arası geçişte pipet uçlarını değiştirin. 10. Adım 9 tekrar edin ve 65 C de 5-10 dakika açık kapakla bütün tüpleri inkübe edin. 11.Pelleti 100 μl DNA-eluent içinde yeniden suspense edin. 65 C de 5 dakika inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin g da 1 dakika tüpleri santrifüj edin. 13. Supernatant amplifikasyon için hazır DNA içerir. Eğer amplifikasyon aynı gün çalışılmayacaksa, işlenen örnekler 2-8 C de 5 güne kadar yada 20 /-80 C de dondurularak saklanabilir. PROTOKOLU: 1. Örnekler (N) ve kontroller (+2) için gerekli miktarlarda reaksiyon tüpleri hazırlayın *N µl PCR-mix-1-FRT, 5*N µl PCR-Buffer-FRT ve 0,5*N µl TaqF DNA Polymerase her örnek için steril yeni tüpte hazırlayın. Vokteksleyin ve kısaca santrifüjleyin. 3. Uygun tüplere 15 μl Reaction Mix ve 10 µl extracted DNA örneği ekleyin. Pipetleyerek karıştırın. 4. Her bir panel için 2 kontrol hazırlayın: Amplifikasyon Negatif Kontrol işaretli tüpe 10 µl DNA-buffer ekleyin; Amplification Pozitif Kontrol işaretli tüpe 10 µl Positive Control Kompleks C+ ekleyin; 5. Termacycler içine tüpleri ekleyin. Sonuçlar, threshold line (eşik çizgisi) ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada yorumlanır. Rotor-Gene 3000/6000 ile Real Time Amplifikasyonu 1. Advanced sistemini programlayıp New Run penceresinde etkinleştirerek Urogenital Assays için bir şablon oluşturun. Dual Labeled Probe/Hydrolysis probes seçin ve New düğmesini tıklayın. 2. Yeni bir pencerede karusel tipini 36-Well Rotor ya da 72-Well Rotor ve Reaction Volume (μl) 25 olarak seçin. 3. Edit Profile penceresinde STD RG-TaqF programını ayarlayın (bu program bütün Sacace Urogenital testleri için evrenseldir): 1. Bekleme: 95 С - 15 dk. 2. Döngü: 95 С - 20 sn. 65 С - 20 sn. 72 С - 20 sn. Döngü tekrarı 10 kez 3.Döngü 2: 95 С - 20 sn. 60 С -30 sn.-fam (Yeşil), Joe (Sarı) da tespit 72 С - 15 sn. Döngü tekrarı 35 kez 2ci geçişte (60 C) 4x Rotor-Gene için Fam (Yeşil), Joe (Sarı) and Rox (Turuncu) kanalarında flüoresans tespit edilir. 4. Floresan kanal duyarlılık düzenlemesi yapın: Channel Setup (Kanal Kurulum) Calibrate (Kalibrasyon) (RG6000 için optimizasyon sağlayın) Auto Gain Calibration (Otomatik Kalibrasyon Ayarı) (Optimizasyon) Setup (Kurulum) Calibrate Acquiring (Kalibrasyon Elde edilmesi) (Optimizasyon Elde edilmesi) ve Perform Calibration (Perform Kalibrasyon) (Optimizasyon) 1. devralmadan önce seçin. Fam/Sybr (Yeşil) kanal için Min Okuma 5, Max Okuma 10, Joe (Sarı) kanalı için Min Okuma 4, Max Okuma 8 ve 4x Rotor-Gene Rox (turuncu) için Min Reading 1, Max Reading 5 görünür. Tüp pozisyon kolonunda Rotor-Gene 2000/3000/6000 karuselinde tüp

5 pozisyonunu programlayın (1ci pozisyon reaktifli reaksiyon tüpü içerir) Auto Gain Calibration Setup (Otomatik Kalibrasyon Ayarı Kurulumu) penceresini kapatın. ANALİZ SONUÇLARI: 1. Sonuçlar, threshold line (eşik çizgisi) ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada Rotor-Gene 3000/6000 software ile yorumlanır. Ur.parvum, FAM (Yeşil) kanalında, Ur.urealyticum, JOE (Sarı) kanalında ve İnternal KontrolROX (Orange) kanalında tespit edilir. 1. Analysis bastıktan sonra Quantitation (Kantitasyon) düğmesini seçin. Fam(yeşil) kanalı (Cycling A FAM) için, sonra JOE (Sarı) kanalı (Cycling A JOE ) ve ROX (Cycling A ROX) için işlemi gerçekleştirin. 2. Fam(Yeşil) kanalı için Dynamic Tube, More Setting (Outlier Removal for RG6000) 0%, and Threshold: 0,1 seçin. 3. JOE (Sarı) kanalı için Dynamic Tube, More Setting (Outlier Removal for RG6000) 5%, Threshold: 0,1 seçin. 2. Rox kanalı için Dynamic Tube, Slope Correct, More Setting (Outlier Removal) 5%, Threshold: 0,1 seçin. 4. Fam (Yeşil) kanalında (Quant. Resultes Cycling A. FAM/Green) Ct 32 değerli örnekler Ureaplasma parvum için pozitif olarak yorumlanır. 5. JOE (Sarı) kanalında (Quant. Resultes Cycling A.JOE/Yellow) Ct 32 değerli örnekler Ureaplasma urealyticum için pozitif olarak yorumlanır. 6. Eğer Fam ve Joe kanalında Ct değeri tespit edilemezse (flüoresans eğrisi eşik çizgisinde çakışmaz) ve Rox kanalında sonuç tablosunda Ct değeri 30 dan daha düşük ise, örnek negatiftir. Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol adımı Ct kanal Fam (Yeşil) Ct kanal Joe Ct kanal Rox Yorumlama (Sarı) (Turuncu) Neg Poz (<30) Geçerli sonuç NCS DNA izolasyonu Neg DNA-buffer Amplifikasyon Neg Neg Neg Geçerli sonuç Poz Kompleks C+ Amplifikasyon Poz (<30) Poz (<30) Neg Geçerli sonuç Örnek 4x RotorGene için 632, 648, 668, 690, 701, 707, 716, 721, 724 U.parvum için pozitif örnek 672, 678, 698, 708, U.urealyticum için Pozitif örnek 706 U.parvum ve U.urealyticum için pozitif örnek

6 SmartCycler (Cepheid) ile Real Time Amplifikasyonu SmartCycler aşağıdaki gibi programlayın: 1. Mini santrifüj rotorunun içine SmartCycler tüplerini koyun ve kısa bir süre santrifüj edin(5-7 sn). 2. Ana menüde Define Protocols (Protokoller tanımla) seçin ve sol alt köşedeki New Protocol (Yeni protokol) seçeneğini seçin. Protokol için bir isim belirleyin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: 3. Save Protocol (Protokol kaydet) seçin. 4. Define Graphs (grafik tanımla) butonuna basın. Açık pencerede New Graph (Yeni Grafik) tıklayın. Ur parvum ureal olarak yeni pencerede grafik adını girin. Automatically added to new Runs tercih edin, Graph Type(Grafik tipi) penceresinde Optics seçin ve Ch1, Ch2, Ch3 kanallarını tercih edin. Save Graph (Grafik kaydet) tıklayın. 5. Ana menüden Create Run (Çalışma Oluştur) seçeneğini seçin ve Run Name (Çalışma ismi) penceresinde deney için bir isim girin. 6. Dye Set (Boya Ayarı) düğmesini tıklayın ve FCTC25 seçin. 7. Add/Remove Sites (Ekle/Çıkar Site) seçin ve analiz için yeni bir pencerede Protokol ve Sites seçin. OK tıklayın. 8. SmartCycler içine reaksiyon tüplerini koyun ve Start Run (Çalışmayı başlat) düğmesine basarak deneyi başlatın. 9. View Results (Sonuçları gör) menüsünde Results Table (Sonuç tablosu) basın ve Sample ID (örnek ID) kolonuna örnek isimlerini ekleyin. SONUÇ ANALİZİ 1. Analysis settings (Analiz ayarları) basın ve Manual Thresh Fluor Units kolonunda Fam, Cy3 ve Texas Red kanalları için 30 a threshold (eşik) çizgisinin değerini ayarlayın. Update Analysis ( Analiz güncelleme) tıklayın. 2. Results Table (Sonuç Tablosu) menüsünde Save Run (Çalışmayı Kaydet) tıklayın. 3. Eğer FAM Std/Res kolonunda sonuçlar POZ (FAM Ct değeri sıfırdan farklıdır) olarak görünürse, Ureaplasma parvum için örnek Pozitif olarak düşünülür. Eğer IC in Ct değeri 35 dan yüksekse, numunenin tekrar test edilmesi gerekir. 4. Eğer Cy3 Std/Res kolonundaki sonuçlar POZ (Cy3 Ct in değeri sıfırdan farklıdır) olarak görünürse, örnek Ureaplasma urealyticum için örnek Pozitiftir. Eğer IC in Ct değeri 35 dan yüksekse, numunenin tekrar test edilmesi gerekir. 5. FAM Std/Res ve СY3 Std/Res sonuç kanalında NEG (FAM vecy3 Ct değeri = sıfır) olarak ve TxR Std/Res sonuç kanalında POS (Eğer kalan numune Ct > 40 gerekirse) olarak görünürse, örnek Negatiftir. 6. Eğer FAM Std/Res, СY3 Std/Res ve TxR Std/Res sonuç kanalında NEG (Ct = 0) olarak görünürse, sonuç geçersizdir. Aynı hazırlama ve amplifikasyon içeren testlerin girişini tekrar edin. 7. Amplifikasyonun Pozitif ve Negatif Kontrolleri ve DNA izolasyonunun geçerli olduğunda, sonuç kabul edilir. Tablo 2. Kontroller için sonuçlar

7 Kontrol Kontrol adımı Ct kanal Fam Ct kanal Cy3 Ct kanal TxR Yorumlama NCS DNA izolasyon NEG NEG POZ Geçerli sonuç DNA-buffer Amplifikasyon NEG NEG NEG Geçerli sonuç C+ Amplifikasyon POZ POZ NEG Geçerli sonuç iq icycler ve iq5 (Bio-Rad) ile Real Time Amplifikasyonu 1. Edit Plate Setup of Workshop modül penceresinde Fam ve Hex kanallarında bütün tüplerdeki flüoresans sinyal tespitini ve tüp pozisyonlarını programlayın. Run with selected protocol (Seçilmiş protokol ile çalışma) düğmesini etkinleştirerek bu şemayı kullanın ve kaydedin. iq5 cihazı için Whole Plate loading (Tüm plakaları yükleme) sisteminde şemayı düzenleyin. Sample Volume 25: μl, Seal Type: Domed Cap, Vessel Type: Tubes seçin. Save &Exit Plate Editing (Kayıt ve çıkış plaka düzenleme) düğmesini tıklayın. 2. iqicycler ya da iq5 da program STD iq-taqf başlatın, View Protocols (protokol görüntüleme) modülünde programı seçin veya oluşturun ve Run with selected plate setup (Seçilen plaka ayarı ile çalıştırma) düğmesini etkinleştirerek başlatın. 95 C 13 dakika 30 sn. 10 Döngü: 95 C 10 sn, 65 C 20 sn, 72 C 20 sn 35 Döngü: 95 C 10 sn, 60 C 30 sn, 72 C 20 sn 2ci adımda (60 C) Fam ve HEX kanallarında flüoresans tespiti 3. Dynamicwf için aşağıdaki iq icycler ayarlarının seçili olduğundan emin olun: 4. Önceden oluşturulmuş modele göre termalcycler içine tüpleri transfer edin. 5. Select well factor source çizgisi altında Experimental Plate seçin ve reaksiyon hacmini 25 µl olarak tercih edin (iq icycler için) 6. Run düğmesine basın. ANALİZ VERİLERİ Sonuçlar, eşik çizgisi ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada iq icycler ya da iq5 software ile yorumlanır. Ureaplasma parvum, FAM kanalında, Ureaplasma urealyticum, HEX kanalında ve IC DNA, ROX kanalında tespit edilir. Flüoresans eğrisinin doğrusal olduğu düzeylerde eşik çizgisine (farenin sol tuşu ile) yerleştirin. Fam (Select a Reporter penceresinde FAM-490 ) kanalında Ct değeri (Ct < 33) sıfırdan farklı ise, örnekler Ureaplasma parvum için pozitif olarak yorumlanır. HEX (Select a Reporter penceresinde HEX-530 ) kanalında Ct değeri (Ct < 33) sıfırdan farklı ise Ureaplasma urealyticum için pozitif olarak yorumlanır. ROX (ROX-575 in the window Select a Reporter) kanalında Ct 33 değerli örnekler ve FAM ve HEX kanalında sinyal vermeyen flüoresans (N/A değeri) negatif olarak yorumlanır.

8 Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR System Programı aşağıdaki gibidir: 1. Ana menü seçeneğinde New (Yeni) seçeneğini seçin ve yeni belgenin verilerini ayarlayın: Assay (Test) penceresinde Absolute Quantitation (Mutlak kantitasyonu) seçeneğini, Template (Kalıp) penceresinde Blank Document (Boş Belge) seçeneğini seçin. OK tuşuna basın. 2. Tools (Araçlar) menüsündeki yeni pencerede Detector Manager (Dedektör Yöneticisi) düğmesini tıklayın. 3. Pencerenin sol alt köşesindeki File (Dosya) tıklayın ve New (yeni) seçin. New detector (Yeni dedektör) penceresinde probların özelliklerini ayarlayın: U.parvum tespit: Name (isim) ve Description (açıklama) çizgileri POZ gösterir; Reporter Dye Fam ve Quencher Dye None çizgisinde. Color (renk) (örneğin kırmızı) seçin. Create Another (Başka oluşturma) düğmesini tıklayın. U.urealyticum tespiti: Name (isim) ve Description (açıklama) çizgileri POZ gösterir; Reporter Dye Fam ve Quencher Dye None çizgisinde. Color (renk) (örneğin kırmızı) seçin. Create Another (Başka oluşturma) düğmesini tıklayın. New detector (Yeni dedektör) penceresine karşı açıldı. İnternal Kontrol için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Name (isim) ve Description (açıklama) çizgileri IC gösterir; Reporter Dye Joe ve Quencher Dye None çizgisinde. Color (renk) (örneğin mavi) seçin. 4. Prob bilgileri ile Detector manager (Dedektör yöneticisi) penceresini kapatın. 5. Instrument (Cihaz) penceresini seçin. 6. Thermal profile (Termal profil) aktif edin ve aşağıdaki amplifikasyon programını ayarlayın: Aşama Profile Replikasyon 1 95 C 15: C 0:20 65 C 0:20 72 C 0:20 95 C 0:25 60 C 0:50* 72 C 0:15 *Fam, Joe, Rox kanalında flüoresans belirlenir. 7. Reaksiyon hacmini 25 μl olarak seçin Emulation seçin. 8. Oluşturulmuş dokümanı kaydedin: File menüsünde Save as... seçin, File type çizgisinde SDS Templates (*.sdt) seçin ve Save tıklayın. 9. Pencerenin sağ üst köşesinde Set up (Kur) seçin. Açılan Plate penceresinde planlanmış amplifikasyon hücreleri mouse ile seçin. View (Görüntüle) menüsünde Well inspector (Kuyu kontrolör) düğmesini tıklayın

9 10. Add Detector (Dedektör ekle) düğmesini tıklayın ve Detector manager penceresinden POS ve IC probları seçin. Bunu yapmak için, mouse ile çizgileri seçin ve Add to Plate Document (Plaka dokümanı ekle) ve Done (Bitti) düğmesini tıklayın. 11. Well inspector (Kuyu kontrolör) penceresinin kullanılan sütununda POS ve IC probları seçin. 12. Passive Reference (Pasif Referans) çizgisinde pencerenin sağ alt köşesinde none (hiçbiri) ayarlayın. 13. Sample Name (Örnek ismi) alanına örneklerin isimlerini ekleyin. ANALİZ SONUÇLARI Sonuçlar, eşik çizgisi ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR Systems software ile yorumlanır. Ur.parvum, FAM kanalında, Ur.urealyticum JOE kanalında ve IC DNA, ROX kanalında tespit edilir. a. Fam kanalında Ct < 35 değerli örnekler Pozitif Ureaplasma parvum olarak yorumlanır. b. Joe kanalında Ct < 35 değerli örnekler Pozitif Ureaplasma urealyticum olarak yorumlanır. c. Rox kanalında Ct ( Undet. ) değeri olmayan örnek yoksa ve Joe kanalında Ct < 40 ise örnekler Negatif olarak yorumlanır. Amplifikasyonun Pozitif ve Negatif Kontrolleri ve DNA izolasyonu geçerli olduğunda sonuçlar sadece önemli olarak kabul edilir. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Analitik özgüllük Primerler ve probların analitik özgüllüğünü negatif örnekler ile doğrulanmıştır. Bu örnekler spesifik Ureaplasma parvum/urealyticum primerler ve probları ile sinyal vermezler. Ur. parvum/urealyticum Real-TM kitin özgüllüğü 100% dir. Kit Ur. parvum/urealyticum Real-TM ın potansiyel çaprazreaktivitesi kontrol grubuna karşı test edilmiştir. Diğer patojenler ile herhangi bir çapraz-reaktivite gözlenmez. Analitik hassasiyet Kit Ur. parvum/urealyticum Real-TM, 500 kopya/ ml den az olmayan % 100 duyarlılıkla testlerin Ureaplasma parvum/urealyticum DNA tespitini sağlar. Tespit, negatif numuneler tarafından kontrol standardını ve dilüsyonlarını gerçekleştirir. Hedef bölge: urease complex component gene *icycler and iq5 are trademarks of Bio-Rad Laboratories * Rotor-Gene Technology is a registered trademark of Corbett Research *MX3000P and MX3005P are trademarks of Stratagene *Applied Biosystems is trademarks of Applera Corporation * SmartCycler is a registered trademark of Cepheid Sacace Biotechnologies Srl 18 San Carlo str., Caserta, Italy *PCR: The Polymerase Chain Reaction (PCR) process is covered by patents owned by Hoffmann-La Roche and applicable in certain countries. Sacace does not encourage or support the unauthorized or unlicensed use of the PCR process. Use of this kit is recommended for persons that either have a license to perform PCR or are not required to obtain a license