Transplantasyon İmmünolojisi Kimerizm

Transplantasyon İmmünolojisi Kimerizm Dr. Musa KARAKÜKCÜ Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Hematoloji-Onkoloji BD Erciyes Pediatrik KİT Merkezi

Transplantasyon İmmünolojisi Homing Engraftment Repopulasyon İmmün Tolerans HLA Antijenleri Graftın Yerleşememesi Graft Rejeksiyonu Kİmerizm İmmün Yeniden Yapılanma GVHH GVL Etkisi

Majör Histokompatibilite Kompleks (MHC) MHC hücre yüzeyinde bulunan bir grup proteini tanımlar. Bu proteinler Self ve non self ayrımı yaparlar. Yabancı antijeni tanırlar. Histokompatibilite = yabancı hücrenin kabul/rejeksiyon (host vs graft, graft vs host, graft vs lösemi) Antijen sunan hücrelerin (APC) yabancı Antijeni immün sistemin effektör hücrelerine tanıtmak için kullandığı hücre yüzey molekülleridir. İmmün cevabın başlamasında anahtar rolü var. Bu proteinler aynı zamanda bir diğer organizma için immunojeniktir. Yabancı Antijen olarak görev yaparlar.

Majör Histokompatibilite Kompleks (MHC) HLA = Human Leucocyte Antigen ise insanlarda lökositler üzerinde bulunan antijen grubuna verilen addır. 6. kromozomun kısa kolunda yer alır. MHC gen ürünleri yapı, fonksiyon ve alloreaktivite yönünden 3 bölgeye ayrılır: Class I HLA A,B,C Class II HLA DR, DQ, DP Class III Non - HLA proteinler ( Kompleman, sitokinler vb)

HLA Antijenleri *MHC Class-I endojen Ag leri, sitotoksik T (CD8 +) lenfositlere sunar. *MHC Class-II Ekzojen Ag i yardımcı T (CD4 +) lenfositlere sunar.

HLA Antijenleri MHC genleri Mendelian geçiş gösterir. Çocuklar bir haplotipi anneden diğerini babadan alırlar ve gruplar blok şeklinde geçer. Kardeşlerin MHC genleri ** %25 ihtimalle tam uyumlu, ** %25 ihtimalle tam uyumsuz, ** %50 ihtimalle bir haplotip uyumlu olacaktır.

Transplantasyon İmmünolojisi Tüm çekirdekli hücrelerde MHC Class I bulunur MHC Class II ise belirli hücrelerde bulunur Tissue MHC class I MHC class II T cells +++ +/- B cells +++ +++ Macrophages +++ ++ Other APC +++ +++ Thymus epithelium + +++ Neutrophils +++ - Hepatocytes + - Kidney + - Brain + - Erythrocytes - -

Klasik Olmayan HLA Antijenleri Klasik olmayan Class I HLA antijenleri MHC lokusunda kodlananlar HLA-E HLA-G MICA ve MICB HLA-H (Hemochromatosis gene) MHC Lokusu dışında kodlananlar CD1 FcRn (Fc receptor of the neonate) Klasik olmayan Class II HLA antijenleri DM DO

HLA E 1988 de bulunmuştur Çoğu doku ve hücrede bulunur NK hücrelerinin fonksiyonunu regüle eder Hücre yüzeyindeki HLA-E, NK hücrelerindeki hem CD94/NKG2A, B CD94/NKG2C reseptörünün ligandıdır.

HLA-G Sınırlı sayıda dokuda eksprese olan güçlü bir inhibitör molekül Plasenta, Timus, Kornea Hamilelikte önemli Sitotrofoblastlarda eksprese olur. Fötüsü maternal immun ataktan korur. Embriyoda eksprese olur İmplantasyonda rol oynar

HLA Antijenleri HLA Class I Alleles 10,730 HLA Class II Alleles 3,743 HLA Alleles 14,473 HLA Class I Gene A B C E F G Alleles 3,399 4,242 2,950 21 22 53 Proteins 2,396 3,131 2,089 8 4 18 Nulls 157 134 109 1 0 2 HLA Class II Gene DRA DRB DQA1 DQB1 DPA1 DPB1 DPB2 DMA DMB DOA DOB Alleles 7 2,018 69 911 43 644 6 7 13 12 13 Protein 2 1,470 33 622 21 529 0 4 7 3 5 Nulls 0 51 1 24 0 16 0 0 0 1 0

HLA terminolojisi Seolojik: HLA-A1 Seolojik: HLA-Cw1 (w işareti çalışmanın devam ettiğini gösterir) Moleküler (düşük çözünürlük): HLA-A*01 Moleküler (yüksek çözünürlük): HLA-A*0112

HLA Antijenleri HLA uyumsuzluğu Nakil için HLA uyumlu kardeş ilk tercih edilir: Ancak %25 oranında uyumluyu kardeş verici bulunur. HLA tam uyumlu kardeş veya akraba donor bulunamaz ise verici alternatifleri: Uyumlu akraba dışı donör, Tek antijen uyumsuz akraba dışı donör, Haploidentik donör, Uyumlu veya uyumsuz kordon kanı

HLA Antijenleri

İmmün Yapılanma Hazırlama rejiminde kullanılan kemoterapi ve radyoterapi proliferatif hücreleri etkiler. Sonuç immun sistemin ve bütün hematopoetik hücrelerinin ciddi deplesyonu; ÖZELLİKLE LENFOSİTLER Doğal immunitenin iyileşmesi genellikle ilk birkaç ayda meydana gelir. Kazanılmış bağışıklık sisteminin yapılanması 1-2 yıllık zaman alır.

Doğal İmmünite Doğal immunite doğumda mevcut olan, öğrenilmemiş, adapte olabilen, mikroorganizmalara maruziyet sonucu geçici olarak artabilen immun cevaptır. İki temel yapıdan oluşur: Non Hematopoetik kısmı: fiziksel bariyerler gibi; cilt ve mukozal yüzeyler Hematopoetik hücreler: nötrofiller, makrofajlar, natural killer (NK) hücreler

Doğal İmmünite Non hematopetik kısımda hazırlama rejiminden etkilenebilir, ancak nakil sonrası dönemde çok hızlı bir şekilde iyileşir. Eğer cilt ve mukozal yüzeyler GVHD tarafından etkilenir ise iyileşme gecikebilir.

Doğal Doğal immunite İmmünite Nötrofiller 2 4 hafta içinde normale döner; Nötrofil Engraftmanı Nötrofil fonksiyonlarının normale gelmesi 2 4 ay kadar sürer; kemotaksis, fagositoz, öldürme potansiyelleri..

Engraftman Doğal immunite Engraftman verilen hematopoetik hücrelerin konakçıda yerleşmesi olarak ta tanımlanır. - Nötrofil: Ardışık 3 gün boyunca desteksiz mutlak nötrofil sayısının (MNS)>0,5x10e9/L veya 1x10e9/L olduğu ilk gün - Trombosit: Ardışık 3 gün boyunca desteksiz trombositlerin > 20x10e9/L veya 50x10e9/L olduğu ilk gün olarak tanımlanır.

Doğal İmmünite Doğal immunite Benzer şekilde iyileşme monositlerde olur. Fonksiyonel olarak monositler 1 yıla kadar yeterli değildir. Makrofajlar: nispeten radyo/kemorezistan; önemli derecede baskılanmazlar ve tedrici olarak nakil sonrası ilk birkaç ay içinde donör kaynaklı makrofajlar ile yer değiştirir. Daha sonra Plateletler artar Platelet Engraftmanı

Doğal İmmünite Doğal immunite Naturel Killer hücreler: Sayı olarak nakil sonrası ilk birkaç hafta içinde subnormaldir. Lenfositler içinde ilk düzelen gruptur. Yeni çoğalan NK hücrelerinin fenotipi normal NK hücrelerden farklıdır: CD56 birght CD16 overeksprese olur. daha fazla IFN γ üretirler, daha az sitotoksiktirler immatür formları olduğu düşünülür KIR molekülleri zamanla eksprese edilir IL 15 nakil sonrası NK hücre maturasyonunda önemli rol oynar.

Kazanılmış immünite Hücresel immünite: Antijen sunan hücreler tarafından başlatılır (dendritik hücreler gibi) ve fonksiyonel T hücrelerin aktivasyonu gerekir. Humoral immunite: Antikorlar tarafından yürütülür ve Fonksiyonel T ve B hücreleri gereklidir.

Kazanılmış immünite Kazanılmış immün sistem nakil sırasında naif T hücrelerin kaybı ve mevcut T hücrelerin fonksiyonunun azalması nedeni ile büyük oranda bozulur. CD4/CD8 oranı tersine döner: CD4 düşük normal CD 8 seviyesi Nakli takiben donör kaynaklı T ve B lenfositler hücresel ve humoral immün sistemi yeniden oluştururlar.

Kazanılmış immünite Kazanılmış immunitenin yapılanması: T Hücreler CD 8+ T Hücreler: ilk artan grup, 2 aydan sonra artmaya başlar ve 6-8 aydan sonra normal değerlerinin üstüne çıkabilirler CD4+ T Hücreler: geç düzelirler, 3-4. aydan itibaran artmaya başlarlar ve 18-24. aylarda normal değerlerine ancak ulaşırlar. Allojenik Nakillerde; CD4 ilk 3 ay 200 altında, 3. aydan sonra 300 üzeri ve 1. yıl sonunda 450 üzeri

Kazanılmış Hücresel İmmünite T hücre immünitesinin iyileşmesi 2 bağımsız yol ile olabilir: Timus bağımsız yol: İnfüze edilen donör memory T hücrelerinin periferik çoğalması; Dar bir T hücre repartuarı Timus bağımlı yol: İnfuze edilen donör hematopoietik progentörlerin timusa yerleşmesi ve takiben farklı naif T hücre reseptör repertaurının oluşması Geniş bir T hücre repartuarı

Kazanılmış Hücresel İmmünite

Kazanılmış Hücresel İmmünite T hücre replete nakillerde; infüze edilen memory T hücrelerin periferal ekspansiyonu başlangıçta dar T hücre repartuarı ile sonuçlanır takibinde timusa T hücrelerin yerleşmesi ile birlikte timüs naif T hücrelerini oluşturur. T deplete nakillerde: Timus dışı yol baskın T hücre gelişim yolu olur ve teorik olarak T hücre iyileşmesinin tek yoludur. Timus dışı yol fonksiyonel timusu olmayan bireylerde baskın olacaktır. Erişkinlerde KT/RT sonrası timusun iyileşmesi önemli derecede bozulmuştur. Yaş ilişkili timüs involüsyonu nedeni ile Orta yaşa kadar tam immun iyileşme mümkün iken İleri yaşta periferik naif T hücre reseptör repartuarı hiçbir zaman tam restore olamaz

Kazanılmış Humoral İmmünite B Hücreler Nakil sonrası 2-3 aylarda artmaya başlar ve otolog nakillerde 6-9. aylardai allojenik nakillerde 9-12. aylarda normal düzeylerine ulaşırlar. T Hücre bağımlıdır 2 yıl kadar subnormaldir. Ig G ve A düzeyleri çok düşük değildir bunun sebebi KT/RT dirençli plazma hücreleri Yeni B hücreler naif hücrelerdir, çok az sayıda memory B hücre vardır B hücre Ab repartuarı önemli derece azalmıştır ve düzelmesi uzun sürer, Antikorlar büyük ölçüde alıcı orjinlidir. Bu nedenle tekrar aşılama gerekir ve aşıya cevap humoral immünitenin yapılanmasını gösterir.

İmmün Yapılanmanın Ölçümü Nakil sonrası Ig seviyelerinin rutin olarak ölçülmesi ile ilgili bir konsensüs vardır. Kazanılmış immun fonksiyonun değerlendirilmesi için nakli takiben 1 yıl CD4 hücre sayısı ölçülmelidir. Önemli olarak lenfosit veya immungobulin seviyelerinin normale dönmesi daima normal immun fonksiyona işaret etmez. Klinik çalışmalarda kullanılan göstergeler: Toplam ve hastalıksız sağkalım Klinik veya kültürde gösterilmiş enfeksiyon Mutlak lenfosit sayısı CD4 sayısı CD4/CD8 oranı Ig düzeyleri ve aşılama sonrası cevap Akım sitometri ile T hücre alt tiplerinin belirlenmesi (ör CD45RA; naif CD4+ T hücre belirteci)

İmmün yapılanmayı etkileyen faktörler İmmün yapılanmayı etkileyen ana faktörler Konak faktörler Genetik farklılıklar HKH kaynağı Nakil sonrası olaylar Yaş (Verici, Alıcı-Timus), Cinsiyet, Hazırlama rejimi (myeloablatif veya RIC, ATG gibi lenfosit deplete edici antikorlarıın kullanımı), GVHD profilaksisi. Başlangıçtaki patoloji Donor ve alıcı arasındaki genetik farklılıkların derecesi; HLA, minör uyumluluk antijenleri ve mikroorganizmalara cevapla ilişkili genler HKH kaynağı: kemik iliği, PBSC, MUD, haploidentik KHN Nakil maniplasyonu: TCD, double ve multiple kordon kanı Hücre dozu: agvhd, kgvhd, Relaps, İnfeksiyöz komplikasyonlar (EBV, CMV, fungal infeksiyonlar, tokso) Biyoterapilerin etkisi (CD20 spesifik tedavileri)

İmmün yapılanmayı etkileyen faktörler Periferik kanın öncü=progentör hücreleri: Mobilize perferik kök hücreler Kİ kaynaklı kök hücreler ile karşılaştırıldığında 1 log daha fazla T hücre içerir > Kronik GVHD riskinde artış Periferik kanda comitted multipotent progenitörlerin sayısı daha fazla > Daha hızlı nötrofil ve platelet engrafmanı

İmmün yapılanmayı etkileyen faktörler T hücre deplesyonu: GVHD önlenmesinde etkili iken, T hücrelerin uzaklaştırılması: Engrafman yetmezlik riskinde artış, İmmün yapılanmayı geciktirir, Lösemik relaps riskini artırır ve İnfeksiyon görülme oranlarını negatif oranda etkileyebilir. Hem gençlerde hem de yaşlılarda mortalite ve morbidite artışı Grafttaki yüksek sayıdaki T reg İyileşmiş immun yapılanma Azalmış GVHD ve CMV infeksiyonu ile birliktedir. Gaidot A, Blood 2011; 117:2975.

İmmün yapılanmayı hızlandırıcı tedaviler Çok sayıda deneme Sitokin ve hormonlarının ekzojen kullanımı Keratinosit growth factor, Büyüme Hormonu, IL 2, 7, 15, 12, 22 IGF-1, PTH, Retinoik asit, Seks steroid ablasyonu (SSA), Timik rejenerasyon, timopoez, lenfopoez Hücresel Tedaviler Prekürsör lenfoid hücrelerin infüzyonu, NK hücre infüzyonu Patojen spesifik T hücre T reg infüzyonu Ektopik timüs dokusunun oluşturulması

Alfa Beta Depleted haploidentik Nakillerde İmmün Yapılanma

Alfa Beta Depleted haploidentik Nakillerde İmmün Yapılanma Allojenik Nakillerde; CD4 ilk 3 ay 200 altında, 3. aydan sonra 300 üzeri ve 1. yıl sonunda 450 üzeri

Alfa Beta Depleted haploidentik Nakillerde İmmün Yapılanma

Kimerizm

Kimerizm Organizmada kendine ait olmayan hücrelerin bulunması COMPLETE / TAM KİMERİZM Nakil sonrasında %95-100 verici hücrelerinin tespiti Tüm hematopetik hücrelerin replasmanı tam

Kimerizm Monitörizasyonu MIXED / KARMA KİMERİZM Nakil sonrası genellikle lenfositlerde %5-95 verici hücrelerinin tespiti Geçici MK- Alıcı orjinli hücreler %1-5, nakil sonrası ilk 6 ayda görülür, kısa sürede tam donör kimerimine geçiş Stabil MK- %1-20 oranında alıcı hücresi, bu oranda stabil olarak uzun süre kalabilir Progresif MK- Zaman içerisinde >%10 fazla alıcı hücresi lehine artış varsa SPLIT / BÖLÜNMÜŞ KİMERİZM Bazı hematopoetik hücre gruplarında alıcı, bazı gruplarda verici kökenli hücrelerin tespit edilmesi AUTOLOGOUS RECOVERY

Kimerizm Monitörizasyonu Engrafman başarısını görmek Relapsı öngörmek ve kökenini tanımlamak Graft reddini değerlendirebilmek için

Kimerizm Yöntemleri Eritrosit enzim polimorfizm Kan grubu fenotipleri Sitogenetik Moleküler Sitogenetik (FISH) PCR temelli analizler SRT-PCR Fragman analizi Kantitatif gerçek zamanlı PCR Droplet PCR Yeni nesil dizileme Kimerizm takiplerinde genellikle periferik kan kullanılması önerilmektedir Lösemilerde hastalık çok hızlı klonal değişikliğe uğrayabilir, bu nedenle kemik iliği örneklerinin kullanımı önerilmekte Nakil öncesine ait örnek yoksa GVHH yok ise bukkal epitel GVHH olması halinde köklü saç örnekleri kullanılabilir

Kimerizm Tandem DNA bölgeleri Bir DNA motifinin birbiri ardına tekrarlandığı bölgeler

Kimerizm

Kimerizm Takibi

Kimerizm Yöntemleri Tam kan analizleri %1-5 ortalama hassasiyete sahip Eğer hücre grupları ayrıştırılıp analiz yapılırsa hassasiyet 10-100 kat artar B-hücreleri, T-hücreleri ya da progenitor hücreler ayrıştırılıp/ zenginleştirilirse olgun granulositlerden gelen sonuçlar elimine edilir.

Kimerizm Yöntemleri

Kimerizm Kimerizm analizleri için STR-PCR ya da gerçek zamanlı kantitatif PCR analizleri yüksek hassasiyette ve bilgilendiricidir. Periferik kan ya da kemik iliğinde analiz bilgi vericidir Ancak farklı hücrelerde analiz kimerizm kökeninin anlaşılması ve tedavinin buna göre zamanında yönlendirilmesinde yardımcı olur.

Kimerizm

ERCİYES ÜNİVERSİTESİ DENEYİMLERİ TT, 7 yaşında Kız, Erken Relaps ALL, Tam uyumlu kardeşinden nakil (MSD), ÇH 4.7X108 CD34 8.5x106, +22. gün Myeloid ve trombosit engraftmanı, +28.gün Kimerizm %100

ERCİYES ÜNİVERSİTESİ DENEYİMLERİ FK, 11 yaşında Erkek, ALL İdame tedavisinde Çok Erken Relaps ALL REZ BFM S2 Kolu ve 1. Nakil Kadeşinden MSD, 2.Relaps 2. Nakil Anneden TcRαß(+) Depleted Haploidentik, CD34: 11,4x106/kg ve TCR α/ß 26000 cell/kg İmmün süpresyon yok +12. gün myeloid+trombosit engraftmanı (+) +28. gün kimerizm %100 +66. gün kimerizm %25 3. Relaps

ERCİYES ÜNİVERSİTESİ DENEYİMLERİ