HSV/CMV Real-TM. El Kitabı. Herper Simplex Virus (HSV) ve Cytomegalovirus (CMV) ün Eş Zamanlı Tespiti için Multiplex Real Time PCR Kiti

Transkript

1 In Vitro Tanısal Kullanım için Sadece Profesyonel Kullanım için HSV/CMV Real-TM El Kitabı Herper Simplex Virus (HSV) ve Cytomegalovirus (CMV) ün Eş Zamanlı Tespiti için Multiplex Real Time PCR Kiti REF V60-100FRT 100

2 İSİM HSV/CMV Real-TM GİRİŞ Herpesviridae insanlar ve hayvanlarda hastalık yapıcı geniş bir DNA virüsü ailesidir. Bu aileye üye olanlar ayrıca herpesvirusleri olarak bilinir. Herpesviridae ailesi 3 altaileye ayrılır: 1. Alphaherpesvirinae (Herpes simplex Virus, Varicella-zoster Virus); 2. Betaherpesvirinae (Cytomegalovirus); 3. Gammaherpesvirinae (virus di Epstein-Barr); Tip Eş anlam Altaile patofizyoloji Kuluçka HHV-1 Herpes simplex virus-1 (HSV-1) α (Alpha) Oral ve/veya genital herpes (predominantly orofacial), ayrıca diğer Nöron herpes simplex enfeksiyonları HHV-2 Herpes simplex virus-2 (HSV-2) α Oral ve/veya genital herpes (predominantly genital), ayrıca diğer Nöron herpes simplex enfeksiyonları HHV-3 Varicella zoster virus (VZV) α Suçiçeği ve zona Nöron HHV-4 Epstein-Barr virus (EBV), lymphocryptovirus γ (Gamma) Enfeksiyöz mononükleoz, Burkitt lenfoma, AIDS hastalarında MSS lenfoma, nakil sonrası lenfoproliferatif sendrom (PTLH), nazofarenks karsinomu, HIV ile ilişkili tüylü lökoplaki B hücresi HHV-5 Cytomegalovirus (CMV) HHV-6 Roseolovirus, Herpes lymphotropic virus HHV-7 Roseolovirus HHV-8 Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) β (Beta) β β γ Enfeksiyöz mononükleoz benzeri sendrom, retinitis, vb Altıncı hastalık (rozeol infantum veya ekzantem subitum) Altıncı hastalık (rozeol infantum veya ekzantem subitum) Kaposi sarkomu, primer efüzyon lenfoma, çok merkezli Castleman hastalığı bazı türleri Monosit, lenfosit T hücreleri T hücreleri B hücresi KULLANIMA AMACI HSV/CMV Real-TM kiti PCR kiti klinik materyallerdeki (ürogenital, rektal ve orak sürüntüler, idrar, tükürük, prostat bezi salgısı, tam kan ve beyin omurilik sıvısı ve kabarcıklar ve cilt ve mukoza eroziv-ülseratif lezyonlar) real-time hibridizasyon-floresans temeline dayanarak herpes simplex virus (HSV) ve cytomegalovirus (CMV) DNA sının tespit edilmesini sağlayan in vitro nükleik asit amplifikasyon testidir. TESTİN PRENSİBİ HSV/CMV Real-TM kiti iki temel prosese dayanır: numunelerden DNA izolasyonu ve Real Time amplifikasyonu. DNA numulerden ekstrakte edilir, Real-Time amplifikasyonu kullanılarak amplifiye edilir ve HSV DNA, CMV DNAsı ve iç kontrol için spesifik floresan haberci boya probları ile tespit edilir. İç Kontrol olası reaksiyon inhibasyonlarını tespit etmek için ve her örnek için amplifikasyon kontrolü olarak iş görür.

3 SAĞLANAN MATERYALLER Reaktifler Açıklama Hacim, ml Miktar PCR-mix-1-FL HSV / CMV renksiz duru sıvı tüp PCR-mix-2-FRT renksiz duru sıvı tüp Polimeraz (TaqF) renksiz duru sıvı tüp Pozitif Kontrolcomplex (C+) renksiz duru sıvı tüp DNA-buffer renksiz duru sıvı tüp Negatif Kontrol(C )* renksiz duru sıvı tüp İç Kontrol-FL (IC)** renksiz duru sıvı tüp *Ekstraksiyon Negatif Kontrol olarak izolasyon prosedüründe kullanılmalıdır. ** 10 µl İç Kontrol DNA izolasyonu sırasında direk olarak örnek/lizis karışımına eklenir. (bkz DNA/RNA prep REF K-2-9) protocol). GEREKLİ AMA VERİLMEYEN MATERYALLER DNA ekstraksiyon kit. Pipetler (ayarlanabilir). Real Time PCR termocycler. Filtreli steril pipet uçları. Vortex karıştırıcı. 2 mllik reaksiyon tüpleri için masaüstü rotorlu santrifüj. Dondurucu, buzdolabı. ÜRÜN KULLANIM KISITLAMALARI Tüm Reaktif sadece in vitro tanısal olarak kullanılabilir. Bu ürünün kullanımı DNA amplifikasyonu (EN375) teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. Kullanım kılavuzu ile tam uyum en iyi PCR sonuçları için gereklidir. Tüm bileşenlerin kutuları üzerindeki etiketler üzerinde yazılı son kullanma tarihlerine dikkat edilmelidir. Kitleri son kullanma tarihinden sonra kullanmayın. KALİTE KONTROL Sacace s ISO Certified Kalite Yönetim Sistemi uyarınca, her lot tutarlı ürün kalitesini sağlamak için önceden belirlenmiş özellikleri karşı test edilir.

4 UYARI VE ÖNLEMLER In Vitro Tasıl Tıbbi Cihaz Sadece In Vitro Tanısal Kullanım 1. Numuneler e reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven ve göz koruması kullanın laboratuvar önlüğü giyin. Sonrasında ellerinizi güzelce yıkayın. 2. Ağızla pipetleme yapmayın. 3. Çalışma alannda yemek yemeyin, sıvı tüketmeyin, sigara içmeyin, makyaj yapmayın veya kontak lenslerinizi çıkarıp-takmayın. 4. Son kullanma tarihinden sonra bir kiti kullanmayın. 5. Tüm örnekler ve kullanılmayan reaktifleri yerel düzenlemelere uygun olarak atın. 6. Biyogüvenlik Seviyesi 2, bulaşıcı maddeler içeren veya içerdiğinden şüphelenilen malzemeler için kullanılmalıdır. 7. % 0,5 'lik sodyum hipoklorit ya da diğer uygun bir dezenfektan kullanılarak bütün numune veya reaktiflerin tüm döküntülerini temizleyin ve dezenfekte edin. 8. Deri, göz ve mukozanın örnek ve reaktiflerle temasından kaçının. Eğer özelti temas ederse, su ile yıkayınız ve hemen bir doktora başvurun. 9. Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) istek üzerine sağlanır. 10. Bu ürünün kullanımı DNA amplifikasyonunda eğitilmiş personel ile sınırlı olmalıdır. 11. PCR reaksiyonları kontaminasyona karşı hassastır. Iyi laboratuvar uygulamaları uyarınca laboratuvarda kontaminasyon riskini en aza indirmek için PCR sürecindaki uygulamaların fiziksel ayrımı gereklidir. 12. Labarotuvardaki çalışma akışı tek yönlü işlemelidir. Ekstraksiyon alanında başlamalı PCR ve ardından tespit alanına doğru devam etmelidir. Önceki basamakların gerçekleştirildiği alanlara örnek, ekipman ve reaktif taşımayın. Kitin bazı bileşenleri koruyucu olarak Sodyum azid içerir. Reaktifin taşınması sırasında metal tubing kullanmayın. PCR analizi, nakliye ve depolama için biyolojik maddelerin örneklemesi üreticinin el kitabında ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Bu el kitabının işin başlamadan önce okunması tavsiye edilir. KARARLILIK HSV/CMV Real-TM Test kit etiketinde belirtilen son kullanma tarihine kadar kararlıdır. Ürün, etiketin üzerinde belirtilen kontrol tarihine kadar işlemeye devam edecektir. Işık, ısı ve neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerini etkileyebilir. Bu durumdan kaçınılmalıdır. Reaktiflerin sürekli dondurulup-çözülmesinden kaçınılmalıdır. Bu durum reaktiflerin hassasiyetine zarar verebilir.

5 ÖRNEKLERİN TOPLANMASI, SAKLANMASI VE TAŞINMASI HSV/CMV Real-TM aşağıdaki materyallerden izole edilmiş DNA ile çalışabilir: ACD veya EDTA lı tüpte toplanmış tam kan; Eppendorf tüpte toplanmış beyin omurilik sıvısı; Idrar (sabahın ilk numunesinin); doku: 1,0 gr dokuyu mekanik homojenizatör veya neşter, cam çubukları, teflon havan ile homojenize edin 1,0 ml tuzlu su veya steril PBS de çözün. Hafifçe vorteksleyin ve 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Süpernatantı 1,5 ml yeni tüplere aktarın; "Eppendorf" tüp içinde depolanan prostatik sıvı; seminal sıvı: Bir polipropilen tüp (1,5 ml) içine için 30 μ l seminal sıvıyı ve 70 μ l steril serum fizyolojik ekleyin; sürüntü: sürüntü fırçasını nükleazsız 1,5 ml tüpe yerleştirin ve 0,2 ml transfer ortamı ekleyin. Transfer ortamındaki sürüntüyü sn boyunca şiddetle çalkalayın. Örnekler 2 8 C de 24 saatten uzun süreli olmamak şartıyla daha uzun süreli saklamak için 20/80 C de dondurun. Klinik örneklerin,etyolojik ajanların taşınması için ulaştırma ülke, federal, eyalet ve yerel yönetmeliklere uygun olmalıdır. DNA İZOLASYONU Aşağıdaki kitler önerilir: DNA-Sorb-A (Sacace, REF K-1-1/A): sürüntü, idrar DNA/RNA-Prep (Sacace, REF K-2-9): tam kan, beyin omurilik sıvısı örnekleri, dokudna ekstraksiyonunu üreticinin talimatlarına uygun olarak gerçekleştiriniz. DNA izolasyonu prosedürü sırasında direk olarak örneğe/lizis karışımına 10 µl İnternal Kontrol ekleyin. REAKTİF HAZIRLIĞI (REAKSİYON HACMİ 25 µl): Toplam reaksiyon hacmi 25 µl, DNA örneği hacmi 10 µl. 1. Tüpü PCR-mix-2-FRT ile çözün. Tüpü PCR-mix-1-FL HSV / CMV, PCR-mix-2-FRT, Polimeraz (TaqF) ile vorteksleyin sonra kısa süreliğine santrifüj edin (1 2 s). Tüpün çeperlerinde damla olmadığından emin olun. 2. Test ve kontrol numunelerinden DNA amplifikasyonu için gerekli sayıda tüp hazırlanması. 3. N reaksiyon için (amplifikasyonun 2 kontrolü dahil ), yeni bir tüpte karıştırın: 10*(N+1) µl PCR-mix-1-FL HSV / CMV;

6 5.0*(N+1) µl PCR-mix-2-FRT; 0.5*(N+1) µl Polimeraz (TaqF). Hazırlanan karışım karıştırın ve ardından kısa bir süre santrifüj edin (1 2 s). tüpün çeperlerinde damla olmadığından emin olun. Hazırlanan karışımdan her tüpe 15 µl koyun. 4. Aerosol bariyerli pipet ucu kullanarak, klinik veya kontrol örneklerinden DNA ekstraksiyonu aşamasında elde edilmiş 10 µl DNA hazırlanmış tüplere ekleyin. 5. Kontrol amplifikasyonu reaksiyonları: NCA - NCA (Amplifikasyonun Negatif Kontrolü) ile etiketli tübe 10 µl DNA-buffer ekleyin. C+ - C+ (Amplifikasyonun Pozitif Kontrolü) ile etiketli tübe 10 µl Pozitif Kontrol kompleks ekleyin. C C (Negatif Kontrolof Extraction) ile etiketli tüpe 10 µl örnek Negatif Kontrolden ekstrakte edilmiş, koyun HSV DNA, FAM/Green kanalında; CMV DNA, JOE/Green/Cy3/Hex kanalında; İç Kontrol DNA, ROX/TexasRed floresans kanalında tespit edilir. Tablo.1 Sıcaklık profili Rotor-tip cihazlar1 Plate veya modüler tip cihazlar 2 Basamakl Sıcaklık, С Süre Döngü Sıcaklık, С Süre Döngü Hold dak min s 95 5 s Cycling s s s s s 95 5 s 20 s 30 s Cycling 60 floresan sinyal floresan sinyal 2 tespiti tespiti s s 1 Örneğin Rotor-Gene 3000/6000/Q (Corbett Research, Qiagen) 2 Örneğin, iq5 (BioRad); Mx3005P (Agilent), ABI 7300/7500/StepOne Real Time PCR (Applied), SmartCycler (Cepheid), LineGeneK (Bioer) CİHAZ AYARLARI Rotor-tipi cihaz Kanal Eşik Diğer Ayarlar/ Aykırı Kaldırma Doğru Eğimi FAM/Green % Off JOE/Yellow % Off ROX/Orange % Off

7 Plate veya modüler tip cihaz Sonuç analizi için, eşik çizgisini son amplifikasyon döngüsü sırasında Poz C + numune için elde edilen maksimum floresans sinyalinin % karşı gelen bir seviyede ayarlayın. SONUÇ YORUMLANMASI Sonuçlar eşik hattı ile floresan eğrisinin çakışmasına göre (ya da çakışmamasına ) aygıtın yazılımı tarafından yorumlanır. Analiz sonuçları sadece Pozitif ve Negatif Kontroller için elde edilen sonuçların doğru olması halinde geçerli sayılır. HSV DNA, FAM/Green kanalında tespit edilir; CMV DNA, JOE/Green/Cy3/Hex kanalında tespit edilir; İç Kontrol DNA, ROX/Orange/TexasRed floresans kanalında tespit edilir. Yorumlamanın prensibi 1. Örneğin HSV DNA pozitif sayılması için Ct değerinin sonuç sisteminde (floresans eğrisi eşik çizgisi ile belirgin floresans artması bölgesinde çakışır) FAM/Green kanalında tanımlanması gerekir. 2. Örneğin CMV DNA pozitif sayılması için Ct değerinin sonuç sisteminde (floresans eğrisi eşik çizgisi ile çakışır) JOE/Green/Cy3/Hex kanalında tanımlanması gerekir. 3. Örneğin HSV ve CMV DNA negatif sayılması için Ct değerinin sonuç sisteminde (floresans eğrisi eşik çizgisi ile çakışmaz) FAM/Green, JOE/Green/Cy3/Hex kanalarında tanımlanmaması gerekir ve ROX/Orange/TexasRed kanalında Ct değeri sınır değeri aşmaz (Ct < 33). 4. Analiz sonuçları ROX/Orange/TexasRed kanalında sonuç sisteminde Ct değeri tanımlanmaz ve FAM/Green ve JOE/Green/Cy3/Hex kanallarında sonuç sisteminde negatif ise veya sınır değerini aşarsa geçersiz sayılır. Bu durumda PCR tekrarlanmalıdır. Analizin sonuçları sadece eğer amplifikasyonun hem pozitif hem negatif kontrolleri ile beraber ekstraksiyonun negatif kontrolü doğru ise güvenilirdir. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol ün yeri Ct FAM (Green) Ct JOE(Yellow)/HEX/Cy3 Ct Rox/Orange/TexasRed Yorumlama NCE Poz C+ DNA Izolas. PCR - - Poz (< 36) OK Poz (< 33) Poz (< 33) Poz (< 33) OK NCA PCR OK KALİTE KONTROL PROSEDÜRÜ

8 Her örneğin ekstraksiyon prosesini kontrol etmek ve olası reaksiyon inhibasyonlarını belirlemek için örnek hazırlığının başında belirlenmiş miktar Internal Kontrol (IC) her örneğe ve kontrole katılır. Örnek hazırlığını, Amplifikasyonu ve tespit basamaklarının doğru şekilde işlendiğinin doğrulanması için ekstraksiyonun Negatif Kontrolü (NCE), Negatif Amplifikasyon Kontrol (NCA), pozitif Amplifikasyon Kontrol (C+) gereklidir. Kontroller beklenen aralığın dışında ise (Kontroller için sonuçlar tablosuna bkz), bu çalışmada kullanılan bütün örnekler ve kontroller örnek hazırlık aşamasından başlanarak tekrarlanmalıdır. ÖZELLİKLER Özgünlük HSV/CMV Real-TM PCR kitin analitik özgünlüğü spesifik primerler ve probların seçimi ve sıkı reaksiyon koşulları ile sağlanır. Primer ve problar dizi karşılaştırma analizi ile gen bankalarında yayınlanan tüm dizilere olan mümkün benzerlikleri için kontrol edildi. İnsan DNA ve aşağıdaki mikroorganizmaların DNA örneklerinin testlerinde spesifik olmayan yanıtlar görülmemeiştir: Gardnerella vaginalis, Lactobacillus spp., Escherichia coli, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Candida albicans, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Mycoplasma genitalium, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Neisseria spp., Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, HSV tipleri 1 ve 2, CMV, ve HPV. Analitik duyarlılık ve tekrarlanabilirlik HSV/CMV Real-TM kitin analitik duyarlılığı HSV ve CMV nin standart DNA ları kullanılarak belirlenmiştir. Bu standart DNA-tamponu ile seri halinde dilüe edilmiştir. Aşağıdaki tablo bu deneylerin sonuçlarını özetler. HSV/CMV Real-TM kitinin analitik duyarlılığı 1000 kopya/ml den az değildir. SORUN GİDERİLMESİ 1. IC (ROX/Orange/TexasRed) kanalında ekstraksiyonun Negative Kontrolü için zayıf sinyal olması veya sinyal olmaması. PCR inhibe edilmiştir. Önerilen bir DNA ekstraksiyon yöntemi kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarına uygun olduğundan emin olun. Ekstrakte DNA yı pipetlemeden önce bütün tüpleri maksimum hızda ( g) 2 dakika boyunca yeniden santrifüj edin ve supernatantı dikkatle alın. Pelleti dağıtmayın, sorbent reaksiyonu inhibe eder! Reaktiflerin saklama koşulları talimatlara uygun değildir. Depolama koşullarını kontrol edin. PCR koşulları talimatlara uygun değildir. PCR koşulları kontrol edin ve IC tespiti için protokolde bildirilen floresan kanalı seçin.

9 Reaktiflerin pipetlenmesi sırasında örneğe IC eklenmemiştir. DNA ekstraksiyon işlemi sırasında dikkat edin. 2. Pozitif Kontrol sinyali zayıftır veya yoktur. PCR koşulları talimatlara uygun değildir Amplifikasyon protokolünü kontrol edin ve manuelde belirtilen floresans kanalını seçin. 3. Fam/Green ve/veya JOE/Yellow/HEX/Cy3 kanallarında Ekstraksiyonun Negatif Kontrolü ile herhangi bir sinyal. DNA ekstraksiyon işlemi sırasında kirlenme. Tüm numuneler sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol ile tüm yüzeyleri ve aletleri dezenfekte edin. Ekstraksiyon prosedürü boyunca sadece filtreli pipet ucu kullanın. Tüpler arası pipet uçlarını değiştirin. DNA ekstraksiyonunu yeni bir set reaktif ile tekrarlayın. 4. Negatif PCR Kontrol ün herhangi bir sinyal vermesi. PCR prosedürü sırasında kirlenme. Tüm numuneler sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol veya özel DNA dekontaminasyon reaktifleri ile tüm yüzeyleri ve aletleri dezenfekte edin. Positive Kontrolleri sonda pipetleyin. PCR hazırlığını yeni bir set reaktif ile tekrarlayın.

10 REFERANSLAR PCR detection of cytomegalovirus DNA in serum as a diagnostic test for congenital cytomegalovirus infection. C T Nelson, A S Istas, M K Wilkerson, and G J Demmler. J Clin Microbiol December; 33(12): Detection of Cytomegalovirus DNA in Peripheral Blood of Patients Infected with Human Immunodeficiency Virus. D. Shibata, W. John Martin, Maria D. Appleman, Dennis M. Causey, J. M. Leedom, N. Arnheim. J Infect Dis. (1988) 158 (6): Multiplex PCR for six herpesviruses after hematopoietic stem cell transplantation. Sawada A, Koyama-Sato M, Yasui M, Kondo O, Ishihara T, Takeshita Y, Okamura T, Nishikawa M, Inoue M, Kawa Pediatr Int Aug 2. doi: /j X Cytomegalovirus Infections in Non-immunocompromised and Immunocompromised Patients in the Intensive Care Unit. Florescu DF, Kalil AC. Infect Disord Drug Targets Jun 16. Comparison of PCR, Antigenemia Assay, and Rapid Blood Culture for Detection and Prevention of Cytomegalovirus Disease after Lung Transplantation. Adriana Weinberg, Tony N. Hodges, Shaobing Li, Guanyung Cai, M. R. Zamora. Journal of Clinical Microbiology, February 2000, p , Vol. 38, No. 2 Optimization of Quantitative Detection of Cytomegalovirus DNA in Plasma by Real-Time PCR. Michael Boeckh, MeeiLi Huang, James Ferrenberg, Terry Stevens-Ayers, Laurence Stensland, W. Garrett Nichols, and Lawrence Corey. Journal of Clinical Microbiology, March 2004, p , Vol. 42, No. 3 Quantification of Human Cytomegalovirus DNA by Real-Time PCR. Elyanne Gault,Yanne Michel, Axelle Dehée, Chahrazed Belabani, Jean-Claude Nicolas, Antoine Garbarg-Chenon. J Clin Microbiol February; 39(2): Definitions of Cytomegalovirus Infection and Disease in Transplant Recipients. Per Ljungman, Paul Griffiths, Carlos Paya, Clin Infect Dis. (2002) 34 (8): A comparison of PCR with virus isolation and direct antigen detection for diagnosis and typing of genital herpes. M. J. Slomka1,L. Emery, P. E. Munday, M. Moulsdale, D. W. G. Brown. Journal of Medical Virology Volume 55, Issue 2, pages , June 1998 Rapid quantitative PCR assays for the simultaneous detection of herpes simplex virus, varicella zoster virus, cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, and human herpesvirus 6 DNA in blood and other clinical specimens. I. Engelmann1,D.R. Petzold, A. Kosinska, B.G. Hepkema, T.F. Schulz, A. Heim. Journal of Medical Virology Volume 80, Issue 3, pages

11 İŞARET LİSTESİ Liste Numarası DİKKAT! Lot Numarası <n> test için yeterli içerik In Vıtro Tanısal Kullanım için Sürüm Saklama sıcaklığı NCA Negatif Kontrol (Amp) Üretici C Negatif Kontrol (Ekst) Kullanım için talimatlara danışın. C+ Pozitif Kontrol (Amp *iq5, Bio-Rad Laboratories ın ticari markasıdır. * Rotor-Gene Technology,Qiagen ın ticari markasıdır * MX3005P,Agilent Technologies ın ticari markasıdır *ABI,Applied Biosystems ın ticari markasıdır * LineGeneK,Bioer ın ticari markasıdır * SmartCycler,Cepheid ın ticari markasıdır Sacace Biotechnologies Srl via Scalabrini, Como Italy Tel Fax mail: info@sacace.com web: