Telomerleri Hedefleyen Terapiler Doç.Dr. Z.Günnur Dikmen Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı, XXVII. Ulusal Biyokimya Kongresi, Antalya, 3-6 Kasım 215
"how chromosomes are protected by telomeres and the enzyme telomerase" Carol Greider (Johns Hopkins University, Baltimore) Elisabeth Blackburn (University of California San Francisco) Jack W. Szostak (Harvard Medical School, Boston)
Telomeraz Telomerleri Nasıl Uzatır? Telomere htr template htert htert = human telomerase reverse transcriptase (expressed in cancer cells and some normal stem cells) htr/hterc = human telomerase template RNA (complementary to telomeric DNA, upregulated in cancer)
Telomerleri ve Telomerazı Hedefleyen Terapiler
O N H OH O P O O S - O B GRN163L HN P S - O O O B GRN163L (Imetelstat) HN O P S- O n O NH 2 B 16C palmitoil grubu ile konjuge 13 bazlık bir oligonükleotid Telomerazın RNA kalıbına komplementer (htr) htr subunitesine yüksek afinite ile bağlanarak telomeraz aktivitesini inhibe eder.
In vitro and in vivo effects of GRN163L on A549 (NSCLC) cells 24st 48st 72st Dikmen Z.G, Gellert G.C, Jackson S, Gryaznov S, Tressler R, Dogan P, Wright W.E, Shay J.W. Cancer Research 25, 65: 7866-7873 Control GRN163L treatment (IP 3mg/kg, 3 weeks)
Imetelstat telomeraz inhibisyonu yaparak progresif telomerik kısalmaya neden olur. A B C 1 2 3 4 5 6 7.7 6.2 4.3 3.5 2.7 19 7.7 6.2 4.3 3.5 2.7 ITAS 1.9 1.5 Weeks 8 12 16 2 8 12 16 2 H1299 H157 H287 H157 H287 1 week GRN163L treatment 1 μm GRN163L treatment 1.9 1.5 Weeks 4-2 -4-6 -8 H157 Removal of treatment (1 μm GRN163L)
Klinik Denemelerde Imetelstat (GRN163L) Farklı kanser türlerinde 17 klinik deneme 21 günlük tedavi siklusların 1. ve 8. günü uygulandı (9.4mg/kg) Başarısızlık nedenleri: Uzak metastazları bulunan Evre IV hastaların çalışmaya alınmış olması Hematolojik yan etkiler (trombositopeni, nötropeni, aptt uzaması vs) Karaciğer toksisitesi (GGT ) İdame döneminde telomerazın yeterince inhibe edilememesi nedeni ile telomerlerin yeniden uzaması Farklı kanser hücrelerinin farklı telomer uzunluklarına sahip olması
Calu-1 Calu-3 Calu-6 H1155 H1299 H1355 H1395 H1437 H1666 H1819 H1993 H29 H273 H287 H2122 H2126 Farklı Tip Akciğer Kanseri Hücrelerinin (NSC) Telomer Uzunlukları A MW (Kb) 19 B 7.7 6.2 4.3 3.5 2.7 1.9 1.5
Overall Survival Rate Imetelstat NSCLC Faz II çalışmaları Sağkalım Oranları 1.9.8.7.6.5.4.3 Median (95% CI) Survival Results (N=114) Imetelstat Control 14.3 11.5.2.1 Control Imetelstat 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 Months Since Randomization N at risk 114 14 91 84 69 5 41 25 18 11 5 1 1
Imetelstat ile Devam Etmekte Olan Klinik Denemeler Hematolojik myeloid maligniteler: EsansiyelThrombositemi Myelofibroz Myelodisplastik Sendromlar (MDS) Akut Myeloid Lösemi (AML) www.clinicaltrials.gov
Telomer uzunluğu Telomer uzunluğu Telomerazı Hedefleyen Terapiler Telomerleri Hedefleyen Terapiler -Uzun tedavi periyodu (uzun lag period) - Yan etkilerde artış - Tedavi maliyetinde artış - Kısa sürede yanıt alma - Kısa lag period - Düşük toksisite Lag Period Lag Period GRN163L (Imetelstat) 6-tiyo-2 -deoksiguanozin (6-tiyo-dG)
Telomeraz Aracılığı ile Telomerleri Hedefleyen Terapi Hipotez: 6-thioguanin in modifikasyonu ile elde edilen nükleosid analogu 6-thio-dG - Telomeraz tarafından tanınarak telomerlere inkorpore edilebilir. 6-thioguanine - Telomerik yapılarda ani bir değişiklik yaparak telomer fonksiyonlarını bozar ve telomerik DNA hasarına yol açar (Telomere Poisoning Approach) - Hızlı hücre ölümüne yol açarak lag fazı kısaltır. Amaç: 6-tiyodG nin in vitro ve in vivo etkilerini incelemek ve 6- tiyoguanin ile karşılaştırmak
İN VİTRO DENEYLER Hücre tipleri: HCT116 kolon ve Non-small cell akciğer kanseri hücreleri (A549, H2882, HCC2429, HCC827, HCC15, H287, HCC417, HCC515, H29) Normal BJ fibroblastları (htert - ) htert + BJ fibroblastları Kolon epitel hücreleri (HCEC1) 1 hafta süresince 3 günde bir (toplam 2 kez).5-1 μmol/l 6-tiyo-dG ve 6-tiyoguanin ile inkübe edildi.
HCC15 Cell Counts (x1) HCC15 HCT116 6-tiyo-dG nin kanser hücreleri üzerinde etkileri HCT116 Cell Counts (x1) 4 3 2 1 Control 6-thio-dG 2 15 1 5 Control 6-thio-dG 6-thio-dG için IC5 değerleri (.7-2.9 μmol/l) 1 M 3 M 1 M 1.week.5 M 1 M 3 M 1.week Control 6-thio-dG, 3 μm, 1 week 6-thioguanine, 3 μm, 1 week 6-thioguanin için IC5 değerleri (.7-3.5 μmol/l) Hücre öldürme etkisi çok hızlı başlar, hücrelerin telomerik uzunluğundan bağımsızdır!
HCEC1 BJ Normal BJ hücreleri ile kolon epitel hücreleri (HCEC) 6-thio-dG den etkilenmemektedir. A Control 6-thio-dG, 3 μm, 1 week 6-thioguanine, 3 μm, 1 week C IC5 değerleri Cell Type BJ HCEC1 6-thio-dG (μm) 1 1 B Cell Counts (x1) 8 6 4 2 BJ Control 6-thio-dG Cell Counts (x1) 25 2 15 1 5 HCEC1 Control 6-thio-dG 1 M 3 M 1 M 1.week 1 M 3 M 1 M 1.week Mender I, Gryaznov S, Dikmen ZG, Wright WE, Shay JW. Cancer Discovery, 215; 5(1); 82 95.
HCT116 Telomere Dysfunction Induced Foci (TIF): Telomerik DNA hasarının göstergesi Telomerik uçlara spesifik TRF2 + DNA hasarına spesifik Gamma- H2AX Kolokalizasyonu TIF (Telomere Dysfunction Induced Foci) 4 veya daha fazla TIF içeren hücreler, TIF (+) kabul edildi. Control 6-tiyo-dG 6-tiyoguanin TRF2 yh2ax 72 h, 3 μm 6-tiyodG uygulaması TIF oluşumuna neden olmaktadır! Mender I, Gryaznov S, Dikmen ZG, Wright WE, Shay JW. Cancer Discovery, 215; 5(1); 82 95.
% c e lls T IF s 4 D N A d a m a g e fo c i (G a m m a H 2 A X ) / c e ll 6-tiyo-dG ile indüklenen TIF oluşumu H C T 1 1 6 H C T 1 1 6 * * 4 C o n tro l * * 1 * * * 3 2 6 -th io g u a n in e 6 -th io -d G n s * * * * 8 6 4 6 -th io g u a n in e 6 -th io -d G * 1 2 3 m in 3 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h C o n tr o l 3 m in 3 h 1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h T im e p o in ts T im e p o in ts 6-Tiyo-dG tedavisi, 72 saat içinde telomerik DNA hasarını 6-tiyoguanine oranla 8 kat artırmaktadır. 6-Tiyo-dG, genomik DNA hasarını da 6-tiyoguanine göre artırmaktadır. Mender I, Gryaznov S, Dikmen ZG, Wright WE, Shay JW. Cancer Discovery, 215; 5(1); 82 95.
% c e lls T IF s BJ-hTERT BJ % c e lls T IF s 6-thiodG ile indüklenen telomerik DNA hasarı, telomeraza bağımlı mıdır? A Control 6-thio-dG 6-thioguanine yh2ax TRF2 48 h, 1 μm 48 h, 1 μm B C B J 8 C o n tro l 6 -th io g u a n in e 6 6 -th io -d G 4 2 5 T IF 6 T IF 7 T IF B J h T E R T 8 C o n tro l 6 4 6 -th io -d G * * * * 2 5 T IF 6 T IF 7 T IF 6-thio-dG, Normal BJ hücrelerinde TIF oluşumuna neden olmaz. BJ htert + hücrelerinde ise TIF oluşumunu indükler.
HCT116 (6-thio-dG) 6-thio-dG (μm) 1 1 1 1 1 1 Culture weeks 18.8 kb- 9.4 kb- 6.1 kb- 5.4 kb- 4.4 kb- 3.3 kb- 1.6 kb- 12 1 1 5 5 12 12 6-tiyo-dG, HCT116 hücrelerinde progresif olarak telomerik kısalmaya neden olur. HCT116 (6-thio-dG) 6-tiyo-dG,HCT116 hücrelerinde telomeraz aktivitesini inhibe etmez telomerik kısalma, telomeraz inhibisyonundan bağımsızdır. ITAS
HCT116 (6-tiyoguanin) 6-tiyoguanin, HCT116 hücrelerinde telomerik kısalmaya yol açmaz. 6-thio-G (μm) Culture weeks 18.8 kb- 9.4 kb- 6.1 kb- 5.4 kb- 4.4 kb- 1 1 1 1 1 1 1 1 1 5 5 1 1 3.3 kb- 1.6 kb- BJ (6-tiyo-dG) 6-thio-dG (μm) 1 1 1 1 1 1 Culture weeks 18.8 kb- 9.4 kb- 6.1 kb- 5.4 kb- 4.4 kb- 3.3 kb- 1.6 kb- 1 1 1 5 5 5 1 1 1 6-tiyo-dG, BJ hücrelerinde telomerik kısalmaya neden olmaz.
İN VİVO DENEYLER 6-tiyo-dG nin toksik etkilere neden olmadan kullanılabilecek optimal terapötik dozu nedir?
M ic e w e ig h t (g r ) 6-thio-dG (1.67mg/kg), WT farelerde kilo kaybına neden olmamaktadır. IP, daily for 28 days Mice weight (gr) 22 2 18 16 14 Control 5 mg/kg-6-thio-dg 5 mg/kg-6-thioguanine 2 4 2 2 2 1 8 1 6 1 4 C o n tro l 1.6 7 m g /k g -6 th io -d G 1.6 7 m g /k g -6 -th io g u a n in e 12 5 1 15 2 25 3 Days 1 2 5 1 1 5 2 2 5 3 D a y s 6-tiyoguanin uygulaması (5 mg/kg) ciddi kilo kaybı ve ölüm 6-tiyoguanin (1.67mg/kg) kilo kaybı 6-tiyo-dG düşük ve yüksek dozlarda iyi tolere edildi. Bu sonuçlara göre, ksenograft hayvan deneyleri için belirlenen optimal doz : 2mg/kg Mender I, Gryaznov S, Dikmen ZG, Wright WE, Shay JW. Cancer Discovery, 215; 5(1); 82 95.
m g /d L 6-tiyo-dG (2mg/kg), WT farede hematolojik, hepatik ve renal sistem üzerinde toksik değildir. Red Blood Cell Count (1 6 / L) 15 ns 1 5 Control 6-thioguanine 6-thio-dG White Blood Cell Count (1 3 / L) 1 ns 8 6 4 2 Control 6-thioguanine 6-thio-dG Hemoglobin (g/dl) 2 15 1 5 ns Control 6-thioguanine 6-thio-dG U/L 25 2 15 1 5 ns ns Control 6-thioguanine 6-thio-dG 4 3 2 1.2 n s n s C o n tro l 6 -th io g u a n in e 6 -th io -d G ALT AST. B U N C R E A KC Böbrek Dalak Kolon
Ksenograft Deney Modeli A549 hücreleri (3X1 6 ) nude farelerin flank bölgesine enjekte edildi. 6-tiyo-dG (2mg/kg), 17 gün boyunca, her 2 günde bir, IP uygulandı. Son injeksiyondan 24st sonra fareler sakrifiye edildi, tümörler rezeke edildi. A549 Kontrol 6-tiyoguanin Tumor volume (mm 3 ) 4 3 2 1 DMSO Control 6-thio-dG 6-tiyo-dG 2 4 6 8 1 12 14 16 18 Days Kontrol 6-tiyoguanin 6-tiyo-dG Mender I, Gryaznov S, Dikmen ZG, Wright WE, Shay JW. Cancer Discovery, 215; 5(1); 82 95.
İntratümoral 6-tiyo-dG injeksiyonu, tümor büyüme hızını kontrol ve 6-tiyoguanin grubuna göre düşürmektedir. A B İntratümoral injeksiyon: 2.5 mg/kg (16 gün boyunca hergün) Tumor volume (mm 3 ) 2 15 1 5 A549 5 1 15 2 Days Control 6-thioguanine 6-thio-dG Kontrol 6-tiyoguanin 6-tiyo-dG Mender I, Gryaznov S, Dikmen ZG, Wright WE, Shay JW. Cancer Discovery, 215; 5(1); 82 95.
ÖZET Nükleosid analogu olan 6-tiyo-2 -deoksiguanozin; Kanser hücrelerinin telomerik uzunluklarından bağımsız olarak hızlı hücre ölümüne neden olur. Kanser hücrelerinde progresif telomerik kısalığa neden olur. Sadece telomeraz ekspresyonu gösteren hücrelerde nükleer ve telomer spesifik DNA hasarına neden olur. In vivo ksenograft modellerde tümör büyüme hızını azaltır. 6-tiyoguanine oranla daha az toksiktir. 6-thio-dG, telomeraz aracılığı ile telomerleri hedefleyen yeni bir kanser tedavi yaklaşımı olarak umut vaad etmektedir.
Acknowledgements UT Southwestern Cell Biology Department, Dallas,TX, USA Jerry W. Shay, Ph.D. Woodring E. Wright, M.D., Ph.D. AuraSense Therapeutics,Illionis,USA Sergei Gryaznov, Ph.D. Hacettepe University, Faculty of Medicine, Department of Biochemistry : Ilgen Mender, Ph.D.