CMV Real-TM Quant. El Kitabı. Sitomegalovirüs (CMV) Kalitatif Tespiti için Real Time PCR Testi REF V7-100FRT. In Vitro Kullanım için

Transkript

1 In Vitro Kullanım için Sadece Profesyonel Kullanım için CMV Real-TM Quant El Kitabı Sitomegalovirüs (CMV) Kalitatif Tespiti için Real Time PCR Testi REF V7-100FRT 100

2 1. KULLANIM AMACI CMV Real-TM Quant PCR kiti klinik materyallerdeki (periferik kan plazma, amniyotik sıvı, beyin omurilik sıvısı (likör), tükürük, orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri, bronkoalveoler lavaj, tam insan kanı, beyaz kan hücreleri ve iç organlar biyopsi) real-süre hibridizasyon-floresans temeline dayanarak insan sitomegalovirüs DNA sının tespit edilmesini sağlayan in vitro nükleik asit amplifikasyon testidir. PCR analizinin sonuçları hastalığın kompleks tanısı beraberinde dikkate alınır. 2. PCR TESPİTİNİN İLKELERİ Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve hibridizasyon floresans tespit ile CMV tespiti üç aşama içerir: klinik örnekten DNA ekstraksiyonu, pathojen genom spesifik bölgenin PCR-amplifikasyonu ve real- Süre hibridizasyon floresans tespit. DNA periferik kan plazma, amniyotik sıvı, beyin omurilik sıvısı (likör), tükürük, orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri, bronkoalveoler lavaj, tam insan kanı, beyaz kan hücreleri ve iç organlar biyopsi materyallerinden her örnek analizinin görüntülenmesine izin veren iç kontrol (IC Glob- -globin gen DNA sı) varlığında ekstrakte edilir. Endojen iç kontrol (IC Glob - globin gen DNA) PCR analizi, malzeme örnekleme ve depolama yeterliliği aşamalarının izlenmesini sağlar (DNA izolasyonu ve PCR amplifikasyonu). Ardından, CMV DNA sı spesifik primerler ve polimeraz (TaqF) kullanılarak amplifiye edilir. Globin geni DNA sı insan genomu DNA sının bir parçasıdır ve hücrelerden elde edilen DNA örneklerinde eşit miktarlarda bulunmalıdır. Her örnekte genomdan az olmamalıdır ( hücreden DNA). Plazma, liquor, amniyotik sıvı, balgam, bronş lavaj ve diğer DNA kontent materyali içermeyen veya az miktarda içeren hücreler için Iç kontrol (IC) eklenir, her numune için amplifikasyon kontrol olara iş görür, endojen IC (-globin geni) hücrelerden elde edilen bütün örneklerde (tam kan, lökosit, biyopsi ve otopsi malzeme, tükürük, bezlerden) bulunur ve sadece analiz basamaklarını kontrol etmeye değil aynı zamanda örneklerin işlenmesi ve depolanmasının kontrolünü de sağlar. Real-time PCR da amplifiye ürün floresans boya kullanılarak tespit edilir. Bu boyalar, termal döngü sırasında amplifiye ürüne spesifik olarak bağlanan oligonükleotidlere bağlıdır. Real time döngüsü boyunce floresans şiddetinin Real time görüntülemesi biriken ürünün PCR dan sonra reaksiyon tüplerini açma gerekliliği yaratmadan tespit edilmesi sağlanır. CMV Real-TM Quant PCR kiti spesifik olmayan prime reaksiyonların büyük ölçüde sıklığını azaltan hot-start kullanır. "Hot-start" kimyasal olarak modifiye polimeraz (TaqF) kullanarak nükleotidler ve Taq-polimeraz ayrılmasını ile güvence altına alınmıştır. Kimyasal olarak modifiye edilmiş polimeraz (TaqF) 15 dakika boyunca 95 C'de ısıtma ile aktive edilir.

3 3. İÇERİK Reaktif Açıklama Hacim (ml) Miktar PCR-mix-1-FL CMV renksiz berrak sıvı tüp PCR-mix-2-Flu renksiz berrak sıvı tüp Polimeraz (TaqF) renksiz berrak sıvı tüp RNA-tamponu renksiz berrak sıvı tüp DNA kalibratör QS1 renksiz berrak sıvı tüp DNA kalibratör QS2 renksiz berrak sıvı tüp RNA- tamponu renksiz berrak sıvı tüp Negatif Kontrol(C )* renksiz berrak sıvı tüp Pozitif Kontrol DNA CMV/ İnsan DNA** renksiz berrak sıvı tüp İç Kontrol(IC)*** renksiz berrak sıvı tüp * Ekstraksiyon prosedüründe Ekstraksiyon Negatif Kontrolü: 100 µl C (Negatif Kontrol) NCE etiketli; ** Ekstraksiyon prosedüründe Pozitif Kontrol Ekstraksiyon olarak kullanılmalı (PCE): 90 µl C (Negatif Kontrol) ve 10 µl DNA CMV/İnsan DNARec Poz kontrol PCE etiketli tüpe; *** DNA Ekstraksiyon prosedürü sırasında 10 µl İç Kontrol STI-87 direk olarak örnek/lizis karışımına ekleyin. (bkz DNA/RNA Prep REF K2-9 ve DNA-sorb-В REF K-1-1/B protokolleri). 4. EK GEREKLİLİKLER DNA ekstraksiyon kit. Tek kullanımlık tozsuz eldiven ve laboratuvar önlüğü. Pipetler (5 den 20 µlye ve 20 den 200 µlye ayarlanabilir). Aerosol bariyerli steril pipet uçları ( 100 µl veya 200 µl). Tüp rakları. Vortex karıştırıcı/masaüstü santrifüjü. 2 mllik reaksiyon tüpleri için masaüstü rotorlu santrifüj. PCR kutusu. Real Süre PCR cihazı PCR veya PCR-plaka için tek kullanımlık polipropilen mikrotüp. 2-8 C için buzdolabı. -16 C için derin dondurucu. Kullanılan pipet uçları için atık kutusu.

4 5. GENEL ÖNLEMLER In Vitro Tanısal Tıbbi Cihaz Sadece In Vitro Tanısal Kullanım için Kullanıcı aşağıdakilere her zaman dikkat etmelidir: Aerosol bariyerli pipet ucu kullanın ve her prosedür için farklı pipet ucu kullanın. Amplikonları diğer reaktif ve ajanlardan uzakta ele alın. Tespit prosedürüne başlamadan önce bütün reaktifleri oda sıcaklığına getirin. Çözdükten sonra bileşenleri karıştırın ve kısaca santrifüj edin. Numuneler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven ve göz koruması kullanın laboratuvar önlüğü giyin. Sonrasında ellerinizi güzelce yıkayın. Çalışma alannda yemek yemeyin, sıvı tüketmeyin, sigara içmeyin, makyaj yapmayın veya kontak lenslerinizi çıkarıp-takmayın. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. Tüm örnekler ve kullanılmayan reaktifleri yerel düzenlemelere uygun olarak atın. Örnekler uygun biyogüvenlik uygulamalarına uygun olarak potansiyel bulaşıcı olarak kabul edilmeli ve bir biyolojik kabin içinde ele alınmalıdır. % 0,5 'lik sodyum hipoklorit ya da diğer uygun bir dezenfektan kullanılarak bütün numune veya reaktiflerin tüm döküntülerini temizleyin ve dezenfekte edin. Deri, göz ve mukozanın örnek ve reaktiflerle temasından kaçının. Eğer özelti temas ederse, su ile yıkayınız ve hemen bir doktora başvurun. Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) istek üzerine sağlanır. Bu ürünün kullanımı DNA amplifikasyonunda eğitilmiş personel ile sınırlı olmalıdır. Labarotuvardaki çalışma akışı tek yönlü işlemelidir. Ekstraksiyon alanında başlamalı PCR ve ardından tespit alanına doğru devam etmelidir. Önceki basamakların gerçekleştirildiği alanlara örnek, ekipman ve reaktif taşımayın. Kitin bazı bileşenleri koruyucu olarak Sodyum azid içerir. Reaktifin taşınması sırasında metal tubing kullanmayın. PCR analizi, nakliye ve depolama için biyolojik maddelerin örneklemesi üreticinin el kitabında ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Bu el kitabının işin başlamadan önce okunması tavsiye edilir. 6. ÖRNEKLERİN HAZIRLANMASI VE İŞLENMESİ CMV Real-TM Quant aşağıdakilerden ekstrakte edilmiş DNA lar ile çalışabilir: Plazma: CMV Real-TM Quant ile EDTA tüpleri kullanılabilir. Örnek tüpü üreticisinin talimatlarını takip edin. EDTA da toplanan tam kan altı saat içerisinde plazma ve hücresel komponentlere ayrılması için x g de 20 dakika santrifüj edin. zole edilmiş plazma, steril bir polipropilen tüp içine transfer edilmek zorundadır. Plazma ek 3 gün boyunca 2-8 C'de saklanabilir. Alternatif olarak, plazma bir aya kadar - 18 C de ve bir yıla kadar da - 70 C de saklanabilir. Tam kanı dondurmayın.

5 Antikoagülan olarak heparin kullanılan kanlar bu teste uygun değildir. Donmuş numuneleri kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin. OTam kan 2-25 C de transfer edilmeli ve toplandıktan sonra 6 saat içinde işlenmelidir. Plazma 2-8 C veya donmuş olarak transfer edilebilir. Liquor (CSF) Eppendorf tüpe toplanması: Liquor 2-8 C de 1 gün saklanabilir. Alternatif olarak, -18 C de bir aya kadar, -70 C de bir yıla kadar saklanabilir. Amyonik sıvı Eppendorf tüpte toplanır: 1,0 ml örneği x g de 10 dakika santrifüj edin. Süpernatantı atın 200 µl çözelti bırakın. Tüpü vorteksleyin, 100 µl DNA Ekstraksiyonu kullanın. Beyaz kan hücreleri. Antikoagülant içeren tüplere standart prosedürüne uygun olarak ml kan örneği toplayın ( önerilen antikoagülan EDTA dır). Örnekleri ~ X g de dakika santrifüj edin. Bu kanı üst plazma katmanı orta kırmızı kan hücreleri katmanı ve buffy coat olarak da adlandırılan ince bir ara yüzey halinde beyaz kan hücreleri katmanı olarak ayıracaktır. Plazmayı bir pipet ile ayırın, bunu yaparken beyaz kan hücrelerini dağıtmamaya dikkat edin. Beyaz kan hücresi sayısı yüksek olan örneklerde buffy coat daha kalın olacaktır. Açığa çıkmış beyaz kan hücrelerinden 0.5 ml veya daha az almak için bir pipet kullanın. Görünen bütün buffy coal materyalini yavaşça aspire edin. Beyaz kan hücrelerinin altta yatan kırmızı kan hücreleri ile kontamine olması olasıdır. Elde edilen lökosit örneği tüpüne 300 µl Lizis çözeltisi ekleyin (DNA/RNA- Prep protokolü için). Numuneler +2-8 C de 12 saate kadar veya -20 C ile -80 C aralığında dondurularak saklanabilir. Klinik örneklerin etyolojik ajanların taşınması işi için ülke, federal, eyalet ve yerel yönetmeliklere uygun olmalıdır. 7. ÇALIŞMA KOŞULLARI CMV Real-TM Quant PCR kit C de kullanılmalıdır. 8. PROTOKOL 8.1. DNA Ekstraksiyonu Aşağıdaki nükleik asit ekstraksiyon kitlerinin kullanılması önerilir: DNA/RNA-prep, REF K-2-9. DNA-sorb-В, REF K-1-1/B. DNA yı üreticinin talimatlarına uygun olarak ekstrakte edin. DNA, bütün örneklerden iç kontrol varlığında ekstrakte edilmiştir (İç Kontrol

6 IC (her örneğe 10 µl IC eklenmiştir)). C ile etiketlenmiş tüpe 100 µl Negatif Kontrol ekleyin. PCE ile etiketlenmiş tüpe 90 µl Negatif Kontrolve 10 µl DNA CMV/İnsan DNAekleyin PCR Hazırlığı Toplam reaksiyon hacmi 25 µl, DNA örneği hacmi 10 µl dir PCR için Tüp Hazırlığı 1. PCR-mix-2-Flu ve polimeraz (TaqF) karışımını hazırlayın. Polimeraz (TaqF) (30 µl) içeren tüpün içeriğini PCR-mix-2-FRT (300 µl) içeren tüpe transfer edin ve köpüklenmesine izin vermeden karıştırın. Hazırlanan karışım 60 numune analizi için tasarlanmıştır. Karışım 2 ºC ile 8 ºC de 3 aya kadar saklanabilir. İhtiyaç olduğunda kullanın. Karışım 3 aya kadar kullanılamazsa daha küçük miktarlarda hazırlayın. Örneğin, 150 µl PCR-mix-2-FRT ve 15 µl polimeraz (TaqF) karıştırın. Hazırlanan karışım 30 numune analizi için tasarlanmıştır. 2. Reaksiyon karışımını hazırlayın. Nitel biçiminde bile bir klinik DNA örneği analizi için, bu PCR Amplifikasyon aşamasında iki kontrolü de çalışmanın gerekli olduğunu unutmayın: Pozitif Kontrol (DNA kalibratörü QS2) ve Amplifikasyon Negatif Kontrolü (RNA-tamponu). Bir klinik DNA örneğinin kantitatif formatı için dahi PCR Amplifikasyonunda 5 kontrol çalışılmalıdır: Iki kalibratör (QS1 ve QS2) ikişer halde ve Amplifikasyon Negatif Kontrolü (RNA-tamponu). Buna ek olarak, ekstra bir reaksiyon için reaktifler almalıdır. 3. Bileşim aşağıdaki oranlara yeni bir tüp içinde önceden hazırlanmış PCR-mix-1-FL CMV ve PCR-mix-2-Flu karışımını ve polimeraz (TaqF) I karıştırın. 10 µl PCR-mix-1-FL CMV, 5 µl PCR-mix-2-FRT ve polimeraz (TaqF). Klinik ve kontrol örnekleri için gerekli reaksiyon sayısını hesaplayın. Bkz ek 1. Eğer 60 örnek eş zamanlı analiz edilirse, karışım hazırlanmasının basitleştirilmiş bir versiyonu kullanılabilir: PCR-mix-2-Flu ile dolu olan ve Polimeraz (TaqF) ile dolu olan tüplerin içeriğini PCR-mix-1-FL CMV screen/monitor içeren tüpe boşaltın. 4. Klinik ve kontrol DNA örneklerinin Amplifikasyonu için gerekli miktarda tüp alın. Her tüpe 15 µl karışım koyun. 5. Klinik veya kontrol örneklerinden elde edilen 10 µl DNA reaksiyon karışımı bulunan tüplere ekleyin. 6. Kalitatif analiz için:

7 NCA - 10 µl RNA-buffer NCA (Amplifikasyon Negatif Kontrol) etiketli tüpe ekleyin. C µl DNA kalibratörü QS2, C+ (Pozitif Kontrol Amplifikasyon) etiketli tüpe ekleyin. Kantitatif analiz için: NCA Standartlar QS1 & QS2-10 µl RNA-tamponu NCA (Negatif Kontrol Amplifikasyon) etiketli tüpe ekleyin µl QS1 iki tüpe ve 10 µl QS2 diğer iki tüpe ekleyin Amplifikasyon 1. Termocyclerı üretici manueli, rehberler ve Tablo 1 ve 2 ye göre programlayın. 2. Cihazınızda ısı profilini aşağıdaki gibi oluşturun:

8 Tablo 1 Sıcaklık, Döngü Basamaklar Süre Floresans tespiti С tekrarı Bekle dak s Döngü s s 95 5 s Döngü s FAM/Yeşil, JOE/Sarı, ROX/Orange s Tablo 2 Step Sıcaklık, Döngü Süre Floresans tespiti С tekrarı dak s s s 95 5 s s FAM, HEX/JOE/Cy3, ROX/Texas Kırmızısı s Floresans FAM/Yeşil, HEX/JOE/Cy3 Sarı ve ROX/Orange/Texas Kırmızısı florometre kanallarında ikinci basamakta (60 C) tespit edilir. 1 For example, Rotor-Gene 6000/Q (Qiagen), or equivalent. 2 For example, iq5 (BioRad); Mx3005P (Stratagene), ABI 7300/7500/StepOne (Applied), SmartCycler (Cepheid), LineGeneK (Bioer) or equivalent.

9 9. VERİ ANALİZLERİ β-globin geni DNA (IC Glob) FAM/Yeşil kanalda tespit edilir, CMV DNA (Pozitif Kontrol DNA CMV ve insan DNA), JOE/HEX/Sarı kanalında, İç Kontrol STI-87 (IC) DNA, ROX/Orange kanalında tespit edilir.hücre süspansiyonundan (tam kan, beyaz kan hücreleri, iç organlar biyopsi) toplam DNA izole edilirse, sonuçlar iki kanalda tespit edilir - β-globin gene DNA (IC Glob) FAM/Yeşil kanalında, CMV DNA, JOE/HEX/Sarı/Cy3 kanalında. Eğer periferik kan plazma, amniyotik sıvı, beyin omurilik sıvısı (likör), tükürük, orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri ve bronşalveol lavajdan izole edilen toplam DNA İç kontrol örnekleri ile izole edilmişse sonuçlar iki kanalda tespit edilir: CMV DNA, JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında, İç Kontrol(IC) DNA, ROX/Orange/Texas Red kanalında. Sonuçların Yorumlanması Sonuçlar eşik hattı ile floresan eğrisinin çakışmasına göre (ya da çakışmamasına ) aygıtın yazılımı tarafından yorumlanır. Hücre süspansiyonundan (tam kan, beyaz kan hücreleri, iç organlar biyopsi) toplam DNA ekstrakte edilir ise sonuçlar aşağıdaki şekilde yorumlanır: 1. CMV DNAsı için örneklerin pozitif sayılması: JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalındaki bir Ct değeri pozitif sonuç Ct değerini aşmaz ise (Ct< 38). Floresans eğrisi eşik çizgisi ile üstel büyüme bölgesindenda çakışmalıdır. 2. Kalitatif analiz için, CMV DNA nın Ct değeri JOE/HEX/Sarı/Cy3 kanalında sonuç sisteminde tanımlanmamışsa ve FAM/Yeşil kanalındaki Ct değerlri 38 I geçmemiş ise örnek negatif sayılır. Kantitatif analiz için, CMV DNA nın Ct değeri JOE/HEX/Sarı kanalında sonuç sisteminde tanımlanmamışsa ve IC Glob DNA miktarı reaksiyon başına 2000 kopyadan fazla ise reaksiyon negatif sayılır. 3. Kalitatif analiz için, Ct değeri JOE/HEX/Sarı kanalında sonuç sisteminde tanımlanmamışsa ve FAM/Yeşil kanalındaki Ct değerlri 38 I geçmemiş ise örnek geçersiz sayılır. Kantitatif analiz için, Ct değeri JOE/HEX/Sarı/cy3 kanalında sonuç sisteminde tanımlanmamışsa ve IC Glob DNA miktarı reaksiyon başına 2000 kopyadan az ise reaksiyon geçersiz sayılır. Bu durumda örneğin PCR amalizi tekrarlanmalıdır. 4. JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Ct değeri sınır Ct değerini geçen (> 38), örnekler belirsiz sayılır. Bu DNA örnekleri ikişer adet çalışılmalıdır. Eğer tekrarlanabilir bir Ct değeri elde edilirse sonuç pozitif sayılılr. Eğer sonuçlar iki çalışmada onaylanmazsa geçersiz sayılır. Kalitatif analiz için, FAM/Yeşil kanalındaki Ct değeri 38 I aşarsa, negatif sonuç geçersiz sayılır. Kantitatif analiz için, IC Glob DNA miktarı is 2000 kopya/reaksiyondan az ise kantitatif negatif veya pozitif sonuç geçersiz sayılır. Kalitatif analiz için, analizin sonuçları sadece amplifikasyon için hem pozitif hem negatif kontroller ve ekstraksiyon negatif kontrol doğru ise güvenilir sayılır. Kantitatif analiz için, C+ daki sonuçlar bu CMV Real-TM Quant bilgi formunda belirtilen aralıkta olmalıdır. Toplam DNA'nın hücre süspansiyonu ( insan tam kan, beyaz kan hücreleri ve iç organ biyopsisi ) izole edilmesi halinde sonuçlar;

10 Kontrol NCE PCE Kontrol için yer DNA Ekstraksiyon, Amplifikasyon DNA Ekstraksiyon, Amplifikasyon Kalitatif format FAM/Yeşil Kantitatif format Kanalda Ct JOE/HEX/Sarı Kalitatif format Kantitatif format Yorumlama Neg Neg Neg Neg OK Ct değeri veri formunda belirtilen aralıkta NCA Amplifikasyon Neg Neg Neg Neg OK C+ Amplifikasyon OK QS1,QS2 Amplifikasyon Ct değeri ve hesaplanan konsantrasyon belirlenmiş Ct değeri ve hesaplanan konsantrasyon belirlenmiş OK OK Kantitatif analizlerde, toplam DNA İnsan bütün kanı, beyaz kan hücreleri ve biyopsi malzemeden ekstrakte edildi ise, kontrol ve test örneklerinde standart hücre miktarı başına CMV DNA (105) bir log konsantrasyonu aşağıdaki formülle hesaplanır: log { PCR örneğindecmv DNA kopyaları x 2*105}= log {CMV DNA kopya/105 hücre}. Glob DNA kopyaları PCR örneğinde Standart hücre miktarı (örneğin, 105 için) başına CMV DNA konsantrasyonu ifade etmek için, aşağıdaki hesaplama oranı kullanın: 105 hücre = 2*105 insan genomik eşdeğeri

11 Toplam DNA, Periferik kan plazmasından, amniyotik sıvı, beyin omurilik sıvısı (likör), tükürük, orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri ve bronkoalveoler lavajdan izole ise, sonuçlar aşağıdaki gibi yorumlanır: 1. Ct değeri JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında sonuç sisteminde tanımlanan pozitif sonuç Ct değerini (< 38) aşmaz ise, örnek CMV DNA için pozitif sayılır. Floresan eğrisi eşik çizgisi ile katlanarak büyüme bölgesinde çakışmalıdır. 2. Ct değeri JOE/HEX/Sarı/Cy3 kanalında sonuç sisteminde tanımlanmaz ve ROX/Orange /Texas Red kanalındaki sonuç sisteminde Ct değeri < 38 ise örnek CMV DNA için negatif sayılır. 3. Ct değeri JOE/HEX/Sarı/Cy3 kanalında sonuç sisteminde tanımlanmaz ve ROX/Orange /Texas Red kanalındaki sonuç sisteminde Ct değeri > 38 ise Analiz sonuçları geçersiz sayılır. Bu tip klinik örnekler için PCR analizi tekrarlanmalıdır. 4. JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Ct değeri sınır Ct değerini geçen (> 38), örnekler belirsiz sayılır. Bu DNA örnekleri ikişer adet çalışılmalıdır. Eğer tekrarlanabilir bir Ct değeri elde edilirse sonuç pozitif sayılılr. Eğer sonuçlar iki çalışmada onaylanmazsa geçersiz sayılır. Kalitatif analiz için, analizin sonuçları sadece amplifikasyon için hem pozitif hem negatif kontroller ve ekstraksiyon negatif kontrol doğru ise güvenilir sayılır. Kantitatif analiz için, C+ daki sonuçlar bu CMV Real-TM Quant bilgi formunda belirtilen aralıkta olmalıdır. Tablo. Toplam DNA nın periferik kan, amniyon sıvısı, beyin omurilik sıvısı (likör), tükürük, orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri ve bronşalveol lavaj örneklerinden iç kontrol ile birlikte izole edildiği durumda kontroller için sonuçlar: Kanalda Ct Kontrol NCE Kontrol içi yer DNA Ekstraksiyon, Amplifikasyon JOE/HEX/Sarı/Cy3 Kalitatif format Neg Kantitatif format Neg ROX/Orange/Texas Red Kalitatif Kantitatif format format Yorumlama OK PCE DNA Ekstraksiyon, Amplifikasyon Ct değeri Veri Kartında belirtilen aralığındadır NCA Amplifikasyon Neg Neg Neg Neg OK C+ Amplifikasyon OK QS1,QS2 Amplifikasyon Ct değeri ve hesaplanan, konsantrasyon belirlenen Ct değeri ve hesaplanan, konsantrasyon belirlenen OK OK Kantitatif analizlerde, toplam DNA periferik kan, amniyon sıvısı, beyin omurilik sıvısı (likör), tükürük, orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri ve bronşalveol lavaj örneklerinden ekstrakte edildi ise, örnek başına CMV DNA (КP CMV DNA) bir log konsantrasyonu aşağıdaki formülle hesaplanır: КP CMV DNA = КCMV DNA/ КIC х IC katsayı (kopya/ml) КCMV DNA, DNA örneğindeki CMV DNA kopya sayısıdır; Кic DNA örneğinde IC DNA kopya sayısıdır;

12 IC katsayısı DNA örneğindeki IC DNA sı kopyası ile ilgilidir. Reaktif kitinin her lotu ile verilen Veri Formu CMV Real-TM Quant için belirtilir. Bu katsayı her bir lot için özeldir. CMV Real-TM Quant PCR kiti İç Kontrol IC (insan beta- globine gen) içerir, hücresel materyalin varlığını kontrol eder. Eğer örnek doğru şekilde hazırlanmamışsa veya epitel hücre miktarı yetersizse İç Kontrol tespit edilmez. Ekstraksiyonun Negatif Kontrolü (NCE), Ekstraksiyonun Pozitif Kontrolü (PCE), Negatif Amplifikasyon Kontrol (NCA), Pozitif Amplifikasyon Kontrol (C+) her çalışmada bulunmalıdır. Eğer kontroller beklenen aralığın dışında ise ( Kontroller için sonuçlar tablosuna bakın) bütün numune ve kontroller örnek hazırlığı aşamasından itibarren yeniden işlenmelidir. 10. PROBLEMLERİN GİDERİLMESİ Analiz sonuçları aşağıdaki durumlarda dikkate alınmaz: 1. JOE/Sarı/HEX/Cy3 FAM/Yeşil, ve ROX/Orange/Texas kanallarında Negati Kontrol Amplifikasyon (NCA) sonuçları için elde edilen tabloda herhangi bir Ct varlığı ve JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Negatif Kontrol Ekstraksiyon (C ) için gözlenen herhangi bir Ct varlığı reaktif veya örneklerde kontaminasyon olduğunu gösterir. Bu durumda, CMV DNA nın tespit edildiği yerde PCR analizi bütün örnekler için DNA ekstraksiyon basamağından başlanarak tekrarlanmalıdır. 2. Kalitatif analiz için, (QS2) in JOE/Sarı/HEX/Cy3 (CMV), FAM/Yeşil, veya ROX/Orange/Texas Red kanallarında Pozitif Kontrol Amplifikasyon (QS2) sonuç tablosunda Ct değeri yoksa, CMV DNA nın tespit edilemediği yerde bütün örnekler için amplifikasyonu tekrarlamak gereklidir. 3. JOE/Sarı/HEX/Cy3 (CMV), FAM/Yeşil, veya ROX/Orange/Texas Red kanallarında Pozitif Kontrol Ekstraksiyon (Pozitif Kontrol DNA CMV ve insan DNAsı) için sonuç tablosunda Ct değeri yoksa, analiz bütün örnekler için geçersiz sayılır. PCR analizinin bu sonuçlar için tekrarlanması gerekir. 4. JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Ct değeri yok ise veya sınır Ct değerinin üzerinde ise is ve FAM/Yeşil and ROX/Orange kanalları için örnek için Ct değeri IC için maximum Ct değerinden fazla ise, analizin DNA ekstraksiyon basamağından başlanarak tekrarlanması gereklidir. Bu hata klinik materyallerin yanlış muamele görmesi sebebiyle DNA kaybından veya PCR inhibitörü varlığı sebebiyle olabilir. 5. JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Örnek için Ct değeri yoksa veya eşik Ct değerini (> 38) aşmış ise ve FAM/Yeşil ve ROX/Orange kanalında örnek için Ct değeri eşik Ct değerinde aşağı ise, sonuç belirsiz sayılır. Bu örneklerin analizi çiftler halinde tekrarlanmalıdır. Eğer tekrarlanabilir Ct değeri elde edilir ise, sonuç pozitif sayılır; aksi durumda, sonuç belirsizdir. JOE/Sarı/HEX/Cy3 kanalında Ct değeri yok ise veya sınır Ct değerinin üzerinde ise is ve FAM/Yeşil and ROX/Orange kanalları için örnek için Ct değeri IC için maximum Ct değerinden fazla ise, analizin DNA ekstraksiyon basamağından başlanarak tekrarlanması gereklidir. Bu hata klinik materyallerin yanlış muamele görmesi sebebiyle DNA kaybından veya PCR inhibitörü varlığı

13 sebebiyle olabilir. 11. TRANSFER CMV Real-TM Quant PCR kit 2 8 ºC de 5 günden uzun sürmeyecek şekilde transfer edilmelidir. 12. KARARLILIK VE DEPOLAMA CMV Real-TM Quant PCR kitinin bütün bileşenleri kullnılmadıkları zaman -20ºC de saklanmalıdır. CMV Real-TM Quant PCR kitinin bütün bileşenleri etiketlerinin üzerinde yazan son kullanma tarihine kadar kararlıdır. Aksi belirtilmediği sürece, reaktiflerin ilk kullanımdan önce ve sonraki raf ömrü aynıdır. PCR-mix-1-FL CMV screen/monitor ışıktan korunmalıdır. 13. ÜRÜN KULLANIM KISITLAMALARI Tüm reaktifler sadece in vitro diagnostik olarak kullanılabilir. Bu ürünün kullanımı DNA amplifikasyon teknikleri konusunda eğitim personeli (EN375) ile sınırlı olmalıdır. Kullanım kılavuzu ile tam uyumlu PCR çalışması en iyi sonuçlar için gereklidir. Bileşenlerin kutu ve etiketleri üzerinde yazılı son kullanma tarihlerine dikkat edilmelidir. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. 14. KALİTE KONTROL Ürün kalitesinden emin olmak için Sacace s ISO Sertifikalı Kalite Yönetim Sistemi ile uyumlu olarak, her lot önceden belirlenmiş özelliklere uygun olarak test edilmiştir. 15. ÖZELLİKLER 15.1 Hassasiyet CMV Real-TM Quant PCR kitin doğrusal aralığı kopya/ml dir. Eğer sonuçlar kopya/ml den büyük ise, bu sonucun CMV DNA kopya/ml den fazla olduğunu gösterir. Eğer sonuç 500 kopya/ml den az ise, bu the result is less than 500 CMV DNA copy/ml şeklinde belirtilecektir. CMV Real-TM Quant PCR kitinin analitik hassasiyeti aşağıdaki tabloda verilmiştir: Klinik materyalin tipi Nükleik asit ekstraksiyon kiti Hassasiyet Periferik kan plazması, amniyotik sıvı, beyin omurilik sıvısı (likör), tükürük, orofaringeal sürüntü, idrar örnekleri, bronşalveol lavaj DNA/RNA-prep 400 kopya/ml Tam insan kanı, beyaz kan hücreleri, iç organ biyopis materyali DNA/RNA-prep 105 hücre başına5 CMV DNA kopya

14 15.2 Özgünlük CMV Real-TM Quant PCR kiti insan sitomegalovirüs (CMV) DNA sı tespiti için kullanılır. CMV Real-TM Quant PCR kiti spesifik aktivitesi, CMV referans suşu AD 169 ve amplifikasyon fragmanlarının diziliminden elde edilen sonuçlar ile onaylanır. Diğer virülerin DNA sı (Epstein-Barr virüsü, herpes simpleks virüsü tip 1 ve 2, insan herpes virüsü tip 6 ve 8, Varisella Zoster Virüs, Parvovirus B19, ve diğerleri) ve bakteriyel patojenler (Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogene, Streptococcus agalactiae, ve diğerleri), ile ilgili olarak PCR kit içeriğinin aktivite göstermez. REFERANSLAR PCR detection of cytomegalovirus DNA in serum as a diagnostic test for congenital cytomegalovirus infection. C T Nelson, A S Istas, M K Wilkerson, and G J Demmler. J Clin Microbiol December; 33(12): Detection of Cytomegalovirus DNA in Peripheral Blood of Patients Infected with İnsan Immunodeficiency Virus. D. Shibata, W. John Martin, Maria D. Appleman, Dennis M. Causey, J. M. Leedom, N. Arnheim. J Infect Dis. (1988) 158 (6): Multiplex PCR for six herpesviruses after hematopoietic stem cell transplantation. Sawada A, Koyama-Sato M, Yasui M, Kondo O, Ishihara T, Takeshita Y, Okamura T, Nishikawa M, Inoue M, Kawa Pediatr Int Aug 2. doi: /j X Cytomegalovirus Infections in Non-immunocompromised and Immunocompromised Patients in the Intensive Care Unit. Florescu DF, Kalil AC. Infect Disord Drug Targets Jun 16. Comparison of PCR, Antigenemia Assay, and Rapid Blood Culture for Detection and Prevention of Cytomegalovirus Disease after Lung Transplantation. Adriana Weinberg, Tony N. Hodges, Shaobing Li, Guanyung Cai, M. R. Zamora. Journal of Clinical Microbiology, February 2000, p , Vol. 38, No. 2 Optimization of Quantitative Detection of Cytomegalovirus DNA in Plasma by Real-Süre PCR. Michael Boeckh, MeeiLi Huang, James Ferrenberg, Terry Stevens-Ayers, Laurence Stensland, W. Garrett Nichols, and Lawrence Corey. Journal of Clinical Microbiology, March 2004, p , Vol. 42, No. 3 Quantification of İnsan Cytomegalovirus DNA by Real-Süre PCR. Elyanne Gault,Yanne Michel, Axelle Dehée, Chahrazed Belabani, Jean-Claude Nicolas, Antoine Garbarg-Chenon. J Clin Microbiol February; 39(2): 772 Definitions of Cytomegalovirus Infection and Disease in Transplant Recipients. Per Ljungman, Paul Griffiths, Carlos Paya, Clin Infect Dis. (2002) 34 (8):

15 KULLANILAN SEMBOLLER İÇİN ANAHTAR Liste Numarası Dikkat! Lot Numarası <n> test için yeterli içerik In Vitro Tanısal Kullanım için Versiyon Saklama Koşulları NCA Negatif Kontrol Amplifikasyon Üretici C Negatif Kontrol Ekstraksiyon Kullanım Klavuzuna bkz C+ Pozitif Kontrol Amplifikasyon Son Kullanma Tarihi IC İç Kontrol NOT *iq5, Bio-Rad Laboratories in ticari markasıdır. * Rotor-Gene Technology,Qiagen in ticari markasıdır. * MX3005P,Agilent Technologies in ticari markasıdır. *ABI,Applied Biosystems in ticari markasıdır. * LineGeneK,Bioer in ticari markasıdır. * SmartCycler,Cepheid in ticari markasıdır. Sacace Biotechnologies Srl via Scalabrini, Como Italy Tel Fax mail: info@sacace.com web:

16