INNOTEST β-amiloid (1-42)

Transkript

1 KEY-KOD: FRI INNOTEST β-amiloid (1-42 ) v p 1/16 Türkçe INNOTEST β-amiloid (1-42) Üretici: Fujirebio Avrupa N.V. Technologiepark Gent Belçika BTW BE RPR Gent Dağıtıcı: Fujirebio Almanya GmbH Hans-Böckler-Allee Hannover Almanya Fujirebio Italya S.r.l. Via Vaccareccia 39/A Pomezia (Roma) Italya Fujirebio Avrupa N.V. Technologiepark Gent Belçika Fujirebio Fransa SARL Les Conquérants, Bât. Le Kilimandjaro 8/10, avenue des Tropiques Les Ulis Fransa Fujirebio Iberia S.L. Calle Tarragona 161, Planta Barselona İspanya Diğer dillere bakın / Autres langues voir / Andere Sprachen siehe / Altre lingue vedere / Ver otros idiomas / Outras línguas ver: AVRUPA GR IS LT RO SK TR LI MT AVRUPA olmayan US CA AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU :00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Avrupa N.V.

2 81576 INNOTEST β-amiloid (1-42) / v0 / KEY-KOD: FRI56750 p 2/16 İÇERİK TABLOSU Kullanılan semboller...2 Kullanım amacı...3 Test prensibi...3 Sağlanan materyaller...4 Saklama ve stabilite...5 Gereken ama sağlanmayan materyaller...5 Güvenlik ve çevre...6 Analitik önlemler...7 Numune toplama, kullanma ve saklama (16)...8 Test prosedürü...9 Kontrol prosedürü Sonuçlar Performans özellikleri Test prosedürü sınırlamaları Ticari markalar Literatür referansları Kullanılan semboller Üretici In Vitro Diagnostik Medikal Cihaz Grup kodu Katalog numarası Tarafından kullanılır Kullanım talimatlarına bakın Sıcaklık sınırlaması <n> test için yeterli Konjugat 1 100x Konjugat 2 100x Konjugat Seyreltici1 Konjugat Seyreltici 2 Kaplı Plak Örnek Seyreltici Durdurma Solüsyonu Substrat TMB 100x Substrat Buffer

3 81576 INNOTEST β-amiloid (1-42) / v0 / KEY-KOD: FRI56750 p 3/16 Kullanım amacı Yıkama Solüsyonu 25x INNOTEST β-amiloid (1-42) insan beyin omurilik sıvısında (CSF) β-amiloid (1-42) kantitatif tespiti için katı-faz enzim immunoassaydir. Bu test 1 st amino asit (AA) of N-terminal ekstremitede başlayan ve pozisyon 42 de biten ve APP(amiloid öncü protein) olgunlaşmasının β-sekretaz yolundan sonuçlanan Aβ olarak adlandırılan amiloid peptidi tespit etmek için tasarlanır. Bu peptid, hidrofobik ve nörotoksik, amiloid yataklarının ana bileşenidir. CSF-β-amiloid (1-42) ve CSF-Tau markır konsantrasyonlarının kombine kullanımı Alzheimer hastalığı (AD) ve normal yaşlanma veya depresyon gibi diğer nörolojik hastalıklar arasında ayırım imkanı sağlar (1). AD tanı markırı gibi, bu testle elde edilen sonuçlar diğer klinik ve diagnostik bilgilerle birlikte yorumlanmalıdır (ör, INNOTEST htau Ag ve INNOTEST FOSFO-TAU (181P) ile elde edilen sonuçlar kullanılarak). Lewy Bodies ile bunama gibi bunamanın AD olmayan tiplerinden AD ayırımı CSF-Fosfo- Tau (181) (2) kantifikasyonu kullanılarak daha fazla geliştirilebilir. Arkaplan AD, bunamanın en yaygın formu, kortikal ve limbik beyin bölgeleri boyunca hücre içi nörofibril yumakları ve hücre dışı amiloid lekelerinin birikimiyle histolojik olarak karakterize edilen nörodejeneratif bir hastalıktır. Eşleştirilmiş helical liflerden yapılan nörofibril yumaklarının ince yapısı esas olarak anormal şekilde hiperfosforillenmiş Tau proteinden (Fosfo-Tau) oluşur. Amiloid yataklarının ana bileşenleri integral membranbağlı amiloid öncü proteinden türeyen 40- ve 42-amino asit-uzun β-amiloid peptidleridir (3). Test prensibi INNOTEST β-amiloid (1-42) ilk monoklonal antikor tarafından yakalanan, 21F12 (IgG2a) amiloid peptid içinde katı-faz enzim immunoassaydir. CSF örnekleri eklenir ve biyotinli antikorla, 3D6 (IgG2b) inkübe edilir. Bu antijen-antikor kompleksi sonra peroksidaz etiketli streptavidin ile tespit edilir. Substrat çalışma solüsyonunun eklenmesinden sonra örnekler bir renk geliştirir. Bu renk yoğunluğu örnekteki insan β-amiloid (1-42) protein miktarı için bir ölçüdür.

4 81576 INNOTEST β-amiloid (1-42) / v0 / KEY-KOD: FRI56750 p 4/16 Şekil 1 Test prensibi INNOTEST β-amiloid (1-42) ; dahil olan sentetik peptid dizisi (SV= streptavidin; HRP= horseradish peroksidaz) Sağlanan materyaller Sağlanan reaktifler: Bileşen Miktar Ref. Tanım Kaplı plak 1x x 8 kaplı test kuyusu ve kurutucu olarak silika çantası ile strip tutucu içeren 1 kapalı çanta. Örnek Seyreltici 1x 30 ml Stabilize proteinler ve koruyucu olarak Konjugat 1 100x Konjugat 2 100x Konjugat Seyreltici 1 Konjugat Seyreltici 2 Substrat TMB 100x 1x 0.2 ml x 0.3 ml x 30 ml x 20 ml x 0.3 ml % MIT/<0.1% CAA ile fosfat buffer. Kullanımdan önce Konjugat Seyreltici 1 ile 100x seyreltilecek, stabilize proteinler ve koruyucu olarak 0.04% MIT/<0.1% CAA ile fosfat buffer içinde biyotinle etiketli fare anti-β-amiloid (1-42) IgG. Kullanımdan önce Konjugat Seyreltici 2 ile 100x seyreltilecek, MIT ve koruyucu olarak 0.02% bromonitrodioxan içeren peroksidaz-etiketli streptavidin. Konjugat 1 seyreltmek için kullanılan, stabilize proteinler ve koruyucu olarak 0.01% MIT/<0.1% CAA ile renk-kodlu (kırmızı) fosfat buffer. Konjugat 2 seyreltmek için kullanılan koruyucu olarak 0.05% Proclin 300, stabilizatör olarak bovin casein ve proteaz inhibitörü olarak bovin aprotinin içeren renk-kodlu (yeşil) fosfat buffer. Dimetil sulfoksit (DMSO) içinde çözünen tetramethyl benzidin (TMB). Kullanımdan önce Substrat Buffer içinde 100x seyreltin (reaktiflerin hazırlanmasına bakın). Konsantre TMB kristalleşebilir ve bu nedenle kullanımdan önce tamamen çözülmelidir (erime noktası 18 C). Substrat Buffer 1x 30 ml Substrate TMB seyreltmek için kullanılan %0.02 hidrojen peroksit içeren fosfat-sitrat buffer. Durdurma Solüsyonu 1x 30 ml N sülfürik asit

5 81576 INNOTEST β-amiloid (1-42) / v0 / KEY-KOD: FRI56750 p 5/16 Bileşen Miktar Ref. Tanım Yıkama Solüsyonu 25x 1x 60 ml Distile veya deiyonize su ile kullanımdan önce 25x seyreltilecek, 0.01% MIT/<0.1% CAA içeren fosfat buffer. Her test stribi için en az 40 ml seyreltilmiş yıkama solüsyonu hazırlayın. Tuz kristalleri 2-8 C de saklama sonrası konsantre Yıkama Solüsyonunda oluşabilir. Bu kistaller Kaplamasız polipropilen plak tamamen yeniden çözülmelidir. 1 - Reaktivite kaymasını önlemek için kaplı plağa aktarımdan önce örneklerin dağıtılması için Plak kapatıcıları Minigrip çanta 1 - Kullanılmamış striplerin saklaması için. Ayrı bir kutuda, farklı saklama koşulları nedeniyle: Aβ (1-42) KAL-RVC paket REF Bileşen Miktar Tanım Aβ (1-42) 2 x 6 şişe 12 KAL şişe, seyreltici içinde tutturulmuş analit Kalibratörleri (0.2 ml) içerir. Kullanın ve atın. Aβ (1-42) Çalışma Validasyon Kontrolleri Saklama ve stabilite 2 x 2 şişe (0.2 ml) 4 RVC şişe, yapay CSF-like matriks içinde tutturulmuş analit içerir. Kullanın ve atın C de tutulduğunda ve orijinal şişelerde saklandığında reaktifler, açılmış veya açılmamış, kitin son kullanma tarihine kadar stabildir. Son kullanma tarihi geçmiş reaktifleri kullanmayın. - Stripleri içeren alüminyum folyo çantasını açtıktan sonra kullanılmamış test stripleri silika ile kapalı plastik minigrip çantasında 2-8 C de saklandığında 8 hafta stabil kalır. - Kullanıma hazır kalibratörler (KAL) ve Çalışma Validasyon Kontrolleri (RVC) varış üzerine -20 C veya daha altında saklanmalıdır. KAL ve RVC test kitinden ayrı paketlenir. - Seyreltilmiş Yıkama Solüsyonu 2-8 C de saklandığında 4 hafta stabildir. - Konjugat çalışma solüsyonu 1 ve 2, 24 saat oda sıcaklığında stabildir. - Substrat çalışma solüsyonu karanlıkta saklanırsa 24 saat oda sıcaklığında stabildir. Kalibratörlerin tanımı pg/ml hedeflenen konsantrasyon aralığında bir kalibratör seti sağlanır. Gereken ama sağlanmayan materyaller - Distile veya deiyonize su µl aralığında hacimler dağıtmak için tek kullanımlık uçlara sahip kalibre hassas pipetler. 25 µl, 75 µl ve 100 µl dağıtmak için kalibre çok kanallı pipet örnekler, Konjugat çalışma solüsyonu 1 ve 2, Substrat çalışma solüsyonu ve Durdurma Solüsyonu eklenmesi için önerilir. - Vorteks karıştırıcı veya eşdeğeri

6 81576 INNOTEST β-amiloid (1-42) / v0 / KEY-KOD: FRI56750 p 6/16 - Mikroplak yıkayıcı; alternatif olarak, yıkama 400 µl hacim dağıtan tekrarlayıcı pipet ve aspirasyon cihazı kullanılarak yapılabilir. - Zamanlayıcı - Emici dokular ± 5 nm filtreye sahip mikroplak okuyucu; isteğe bağlı olarak çift dalgaboyu analizi için 620 nm veya 690 nm filtre ve veya daha yüksek lineer emicilik aralığı ile. - Çalışma solüsyonlarının hazırlanması için tek kullanımlık şişeler - Olası kontamine materyaller için uygun biohazard atık konteynerleri - Mikroplak çalkalayıcı (1000 rpm); alternatif olarak, karıştırma plağın vurulan tarafıyla yapılabilir ± 2 C de inkübatör Güvenlik ve çevre Olası tehlikeli bileşenler hakkında bilgi için lütfen Güvenlik Veri Kağıdına (SDS) ve ürün etiketlenmesine bakın. En son SDS versiyonu website da mevcuttur. Tehlike ifadeleri H314 H315 H317 H319 H335 Önlem ifadeleri P260 P261 P280 Uyarı: 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one ve 2-methyl-2Hisothiazol-3-one karışımı içerir: KONJ DIL 2 H317 P261 P280 P363 P333+P313 P302+P352 SUBS TMB 100x H315 H319 H335 P280 P261 P362 P312 P302+P352 Tehlike: DURDURMA SOL H314 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P310 P363 Ciddi cilt yanıkları ve göz hasarına sebep olur. Cilt tahrişine sebep olur. Alerjik cilt reaksiyonuna sebep olabilir. Ciddi göz tahrişine sebep olur. Solunum sistemi tahrişine sebep olabilir. Duman/buhar/sprey solumayın. Duman/buhar/sprey solumaktan kaçının. Koruyucu eldivenler/koruyucu giysi/göz koruyucu/yüz koruyucu kullanın. P302+P352 CİLTTE: Bol sabun ve su ile yıkayın. P303+P361+P353 CİLTTE (veya saç): Bütün kontamine giysileri hemen çıkarın/kaldırın. Su/duş ile cildi durulayın. P305+P351+P338 GÖZLERDE: Birkaç dakika su ile dikkatli durulayın. Varsa ve kolaysa kontakt lensleri çıkartın. Durulamaya devam edin. P310 P312 P333+P313 Hemen bir ZEHİR MERKEZİ veya doktor/hekime başvurun. İyi hissetmiyorsanız bir ZEHİR MERKEZİ veya doktor/hekime başvurun. Cilt tahrişi veya kaşıntı oluşursa: Tıbbi yardım/tavsiye alın.

7 81576 INNOTEST β-amiloid (1-42) / v0 / KEY-KOD: FRI56750 p 7/16 P362 P363 Kontamine giysiyi çıkarın ve tekrar kullanmadan önce yıkayın. Tekrar kullanmadan önce kontamine giysiyi yıkayın. Numuneler her zaman potansiyel bulaşıcı gibi kullanılmalıdır. Tüm biyolojik materyaller potansiyel bulaşıcı olarak düşünülmelidir ve öyle kullanılmalıdır. Sadece yeterince eğitimli personel test prosedürünü yapmak için izinli olmalıdır. Tüm biyolojik materyaller belirtilen güvenlik prosedürleri ile uyumlu olarak atılmalıdır C de en az 15 dk otoklavlayın. - Tek kullanımlık materyali yakın. - Sodyum hipoklorit ile sıvı atığı karıştırın böylece son konsantrasyon ± 1% sodyum hipoklorittir. Atmadan önce bir gece boyunca bekletin. DİKKAT: sodyum hipoklorit eklemeden önce asit içeren sıvı atığı nötralize edin. Açıklama: Transmissible Spongiform Encephalopathy (TSE)/Prion kontamine materyaller için özel önlemler: - Örneklerin inaktivasyonu Klinik örnekler, ör. CSF, yakma ile son atım öncesi 1 saat için otoklavlanmalı veya 20,000 ppm free klorinle sonuçlanan sodyum hipoklorit solüsyonuna daldırılmalıdır. - Atık atımı Klinik atık olarak sınıflandırılan tüm materyaller yetkili yakma alanında yakmayla imha edilmelidir. Klinik atığın güvenlik kullanımı için, güvenlik sızıntı geçirmeyen konteynerler kullanın, ör. uygun olduğu yerlerde çift paketleme. Konteynerin dış kontaminasyonundan kaçının. - Referans: Advisory Committee on Dangerous Pathogens (UK) - Spongiform Encephalopathy Advisory Committee - Transmissible Spongiform Encephalopathy Agents: Safe Working and the Prevention of Infection World Health Organization (WHO): WHO Infection Control Guidelines for Transmissible Spongiform Encephalopathies. Karışımlardaki tehlikeli maddeler hakkında bilgi için Sağlanan reaktifler kısmına bakın. Kişisel koruyucu ekipman kullanımı gereklidir: tehlikeli veya bulaşıcı maddeleri işlerken eldivenler ve emniyet gözlükleri. Atık kurumun atık atma kurallarına göre kullanılmalıdır. Ayrıca tüm federal, eyalet ve yerel çevre düzenlemelerini dikkate alın. Analitik önlemler - Aşağıdaki reaktifler tüm INNOTEST Abeta(s) ve Tau(s) testleri arasında geneldir (aynı bileşim): Örnek Seyreltici, Yıkama Solüsyonu, Substrat, Substrat Buffer ve Durdurma Solüsyonu. Kullanılan reaktiflerin doğru izlenebilirliğini sağlamak için aynı kutudan bu genel reaktiflerin bir setinin kullanılması ve kullanılan her bileşen için grup numarasının kaydedilmesi önerilir. - Konjugat ve Substrat çalışma solüsyonları hazırlamak için kullanılan tüm kaplar kontaminasyondan kaçınmak için iyice temizlenmelidir. - Kuyuların kontaminasyonundan kaçınmak için kenarlara ELISA plaklarını tutun. - Reaktiflerin mikrobiyel kontaminasyonundan kaçının. - RVC ve KAL homojen halde örneklerin sağlanması için kullanımdan önce 10 saniye vorteksleyin.

8 81576 INNOTEST β-amiloid (1-42) / v0 / KEY-KOD: FRI56750 p 8/16 - Her numune için yeni bir pipet ucu kullanın. - Numunenin mikrokuyuya eklenmesini sağlayın. - Kontaminasyondan kaçınmak için örnek veya Konjugate çalışma solüsyonu eklerken pipet uçlarıyla kuyuların kenarına dokunmayın rpm de 1 dakika mikrotitre plağa hafifçe vurarak veya plak çalkalayıcı üstünde karıştırarak hava kabarcıklarını yok edin. - İnkübasyon veya saklama boyunca Substrat çalışma solüsyonunun güçlü ışığa maruz kalmasını önleyin. Substrat çalışma solüsyonu kullanıldığında renksiz olmalıdır. Renksiz değilse yeni Substrat çalışma solüsyonu hazırlanmalıdır. - Durdurma Solüsyonu, Substrat çalışma solüsyonu veya Konjugat çalışma solüsyonları istenmeyen renk oluşumlarını önlemek için metaller veya metal iyonlanlarıyla temas etmemelidir. - Kuyular yıkamadan hemen sonra Konjugat veya Substrat çalışma solüsyonu ile doldurulamazsa stripleri en fazla 15 dakika Yıkama Solüsyonunda ıslatılmış emici bir doku üzerinde başaşağı koyun. - Reaktif çalışma solüsyonlarının hazırlanması için kan toplama tüplerini kullanmayın. Numune toplama, kullanma ve saklama (16) Uygun örnek kullanma doğru sonuçlar elde etmek için çok önemlidir. Örneklerin toplanması, saklanması ve işlenmesi için sadece polipropilen tüpler kullanın (4). Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için örnek kullanma prosedürünün tüm aşamalarının standardize edilmesi önerilir. Bu test post-mortem CSF, ventriküler CSF, kan örnekleri (serum, plazma), beyin dokusu veya hücre kültür supernatantlarının test edilmesi için valide edilmez. CSF toplama (5, 6, 7) Lumbar delinmesi tercihen sabah yapılmalıdır. Lumbar delinmesi L3/L4 veya L4/L5 seviyesinde yapılmalıdır. İlk 20 CSF damlasını atın sonra polipropilen toplama tüpünde yaklaşık 2 ml CSF toplayın. Örneklerin ön işlemi tercihen lumbar delinmesinden sonra 4 saat içinde yapılmalıdır. CSF kullanma (8) Hemorajik CSF örneklerini hariç tutun. Hücreleri veya diğer çözünmeyen materyalleri hariç tutmak için kontrollü oda sıcaklığında ± 2000 g da 10 dakika CSF santrifüj edin. CSF polipropilen tüplere porsiyonlayın. Tüp içinde çok fazla hava boşluğu olmasından kaçının, ör. 500 µl tüpte tercihen 400 µl CSF dağıtın. Sevkiyat şartlarına uygun olarak porsiyonları kullanın. Uzaktaki test laboratuvarına gönderme Donmamış: ortam sıcaklığında 48 saat içinde örnekleri gönderin. Donmuş: kuru buz üstünde örnekleri gönderin; örneklerin ısınmasında kaçının. CSF porsiyonlarının saklanması Test edilene kadar tercihen -80 C de örnekleri saklayın. 2 ay içinde test edilirse örnekler -20 C de saklanabilir.

9 81576 INNOTEST β-amiloid (1-42) / v0 / KEY-KOD: FRI56750 p 9/16 Örneklerin ısınmasından kaçının; tekrarlanan dondurma/çözdürme döngüsü yanlış konsantrasyonlarla sonuçlanır (9). Yıkama için talimatlar Otomatik yıkama için önerilen protokol aşağıdaki gibidir: - Seyreltilmiş Yıkama Solüsyonu ile yıkayıcıyı ön durulama yapın. - Aşağıdakileri sağlamak için 5 yıkama döngüsü yapın: doldurma hacmi 400 µl/kuyu dur. dağıtım yüksekliği kuyu tamamen dolacak şekilde ayarlanmalıdır. bir aspirasyon/yıkama/ıslatma döngüsünü tamamlamak için alınan süre yaklaşık 30 saniyedir. yıkama prosedüründen sonra plak ters çevrilir ve emici doku üzerinde kuru dokunulur. Manuel yıkama aşağıdaki gibi yapılabilir: 1. Plak kapatıcısını çıkartın. 2. Solüsyonu atın, emici doku üzerinde plağı ters çevirin ve kuru dokunun. 3. Her kuyuya 400 µl Yıkama Solüsyonu dağıtın, yaklaşık 30 saniye ıslatın. 4. Solüsyonu atın. 5. Aşama 3 ve 4 ü 4 kez tekrarlayın. 6. Yıkama prosedüründen sonra plak ters çevrilir ve emici doku üzerinde kuru dokunulur. Tamamlanmayan yıkama test sonucunu olumsuz etkiler. Yıkama Solüsyonu ve yıkayıcının kontaminasyonu kapsamlı sorunlara sebep olabilir. Sorun oluşması halinde uygun dezenfektan solüsyonu ile yıkama şişelerini ve yıkayıcıyı bir gece dezenfekte edin ve suyla durulayın. Reaktiflerin hazırlanması Konjugat çalışma solüsyonu 1 ve 2 ve Substrat çalışma solüsyonu hazırlanması # kuyu KONJ 1 µl KONJ DIL 1 ml KONJ 2 µl KONJ DIL 2 ml SUBS µl SUBS BUF ml Seyreltilmiş Yıkama Solüsyonunun hazırlanması Her test stribi için en az 40 ml seyreltilmiş Yıkama Solüsyonunda hazırlayın. # kuyu YIKAMA SOL 25x ml H 2 O ml Test prosedürü Testi yapmadan önce lütfen Analitik Önlemler kısmını okuyun. Not:

10 81576 INNOTEST β-amiloid (1-42) / v0 / KEY-KOD: FRI56750 p 10/16 - Her test çalışması dikkate alınarak gereken kuyuların toplam sayısını belirleyin, 6 kullanıma hazır kalibratörün çift kuyusu, 2 Çalışma Validasyon Kontrolü ve CSF örnekleri öngörülmelidir. - Örnek inkübasyonu 60 dakika aldığı için, dağıtma süresi en aza indirilmelidir. Reaktivite kaymasını azaltmak için, kaplı olmayan polipropilen mikroplak bekleme yeri olarak kite eklenmiştir. 6 stripten fazlasının kullanılması gerektiğinde bu hazırlama plağının kullanılmasını öneririz. Hazırlama plağının kuyularına 60 µl örnek/kal/rvc dağıtın. - Tüm reaktifleri ve stripleri içeren alüminyum folyo çantasını kullanmadan önce yaklaşık 60 dakika oda sıcaklığına (18-30 C) getirin ve kullanımdan hemen sonra buzdolabına koyun. Kuyuların içine suyun yoğunlaşmasını önlemek için alüminyum folyo çantası stripler oda sıcaklığına erişene kadar kapalı tutulmalıdır. - Kullanmadan önce yaklaşık 60 dakika KAL, RVC ve CSF örneklerinin oda sıcaklığına erişmesine izin verin (18-30 C) - Tüm reaktiflerin, KAL, RVC ve CSF örneklerinin teste başlamadan önce hazır olduğundan emin olun. Test başladığında en güvenilir ve tutarlı sonuçların elde edilmesi için kesintisiz yapılmalıdır. - CSF örnekleri, RVC ve KAL testten önce 10 saniye vortekslenmelidir. 1. Gereken sayıda stribe sahip strip-tutucuyu alın. Silika kurutucuya sahip plastik minigrip çantasında kullanılmamış stribi koyun. 2. Kullanım için hazırlama yöntemlerine göre Konjugat çalışma solüsyonu 1 hazırlayın. 3. Antikor kaplı plağın her kuyusuna 75 µl Konjugat çalışma solüsyonu 1 ekleyin. 4. a) Test edilmesi gereken sınırlı sayıda örnek durumunda: antikor kaplı plağın çift kuyularına 25 µl her örnek/kal/rvc ekleyin. b) Test edilmesi gereken çok sayıda örnek durumunda (6 stripten fazla): çok kanallı pipet kullanarak antikor kaplı plaktaki çift kuyulara polipropilen plağın her kuyusunda 25 µl transfer edin. 5. Kalibratörler, Çalışma Validasyon Kontrolleri ve CSF örneklerinin strip tutucuya dikkatli dokunarak veya 1000 rpm de 1 dakika çalkalayarak yeterince karıştırıldığından emin olun. Yapışkan kapatıcı ile stripleri kapatın. 25 ± 2 C de inkübatör içinde 60 ± 3 dakika inkübe edin. 6. Aşama beşin bitiminden hemen önce kullanım için hazırlama yöntemlerine göre Konjugat çalışma solüsyonu 2 hazırlayın. 7. Her kuyuyu 5 kez yıkayın ( Yıkama için talimatlar kısmına bakın) 8. Her kuyuya 100 µl Konjugat çalışma solüsyonu 2 ekleyin. Yeni yapışkan kapatıcı ile stripleri kapatın ve 25 ± 2 C de inkübatör içinde 30 ± 3 dakika için inkübe edin. 9. Aşama sekizin bitiminden hemen önce Substrat çalışma solüsyonu hazırlayın. 10. Her kuyuyu 5 kez yıkayın ( Yıkama için talimatlar kısmına bakın). 11. Her kuyuya 100 µl Substrat çalışma solüsyonu ekleyin. Karanlıkta 25 ± 2 C de 30 ± 3 dakika için inkübe edin. 12. Reaksiyonu durdurmak için aynı dizi içinde ve Substrat Solüsyonu gibi aynı zaman aralıklarında her kuyuya 50 µl Durdurma Solüsyonu ekleyin. Optimum karışım sağlamak için dikkatlice strip tutucuya vurun.

11 81576 INNOTEST β-amiloid (1-42) / v0 / KEY-KOD: FRI56750 p 11/ nm de (tek dalgaboyu) absorbans okuyun (aşama 12 den sonra 15 dakika içinde). Çift dalgaboyu analizi için, 620 nm referans dalgaboyu olarak kullanılabilir. Kontrol prosedürü İç kontrol Akredite edilmiş laboratuvarlar her çalışmada bir iç kontrol dahil etmelidir. Lütfen akreditasyonunuzun uygulanabilir kalite standardını izleyin. Sonuçlar Validasyon - KAL 6 nın 450 nm deki absorbansı den düşük olmalıdır. - Kal 1 in 450 nm deki absorbansı den büyük olmalıdır. - RVC, Aβ (1-42) KAL-RVC paketinin ekli etiketinde belirtilen tanımlı konsantrasyon aralığında olmalıdır. Not: Çift dalgaboyu (450 nm ve 620 nm) analizi için absorbans değerleri tek dalgaboyu değerlerinden yaklaşık 50 mod farklıdır. Bu testin son sonucunu etkilemez. Sonuçların hesaplanması KAL, RVC ve bilinmeyen CSF örnekleri için ortalama absorbansı hesaplayın. Tek tek OD değerleri arasındaki % farklılık (( abs (V 1 - V 2 )) / ((V 1 + V 2 )/2) * 100 v = değer) %20 den fazlaysa testi tekrarlayın. Yatay (X) eksenindeki ilgili β-amiloid(1-42) konsantrasyonlarına karşı dikey (Y) eksenindeki β-amiloid(1-42) kalibratörlerinin her biri için elde edilen ortalama absorbans değerlerini çizerek kalibrasyon eğrisini oluşturun. Bu noktalarla en uygun eğriyi çizin. Not: Sigmoidal 4 parametre eğri fitting önerilir. Bir blank çalışma içinde dahil edilmişse, eğri fitting içinde onu kullanmayın. Kalibrasyon eğrisinden pg/ml de β-amiloidin(1-42) ilgili konsantrasyonunu belirlemek için her bilinmeyen CSF örneğinin ortalama absorbans değerini kullanın. Örneklerin konsantrasyonu sadece absorbans kalibrasyon eğrisinin sınırları içindeyse belirlenebilir. En yüksek kalibratörden daha yüksek veya en düşük kalibratörden daha düşük, OD değerlerinden sonuçların ekstrapolasyonu yanlış sonuçlara sebep olabilir. Performans özellikleri Analitik performans özellikleri Seçicilik ve özgüllük Aβ 42 peptidine karşı N-terminal spesifik mab 3D6 epitop haritası antikor tespiti için biyotinli 21F12 kullanılarak sandviç immunoassaylerle yapıldı. 3D6 antikoru asetilasyonlar tarafından veya fare dizisine (5, 10, ve 13 pozisyonlarında modifiye edilmiş) sahip Aβ peptidleriyle N-terminusta bloke edilen Aβ peptidleriyle inkübe edildiğinde antijen reaktivitesi bulunmadı. 3D6 çözünebilir amiloid öncü protein veya tam boy β-app tanımlamaz (9).

12 81576 INNOTEST β-amiloid (1-42) / v0 / KEY-KOD: FRI56750 p 12/16 21F12 ve 3D6 kombine kullanımının antikor özgüllüğü farklı sentetik insan Aβ peptileri ve sıçan Aβ (1-42) kullanılarak sonra onaylandı. 21F12/3D6 ELISA amino asit 1 de başlayan ve amino asit 42 veya 43 te carboxyterminus ta biten amiloid peptidleri için son derece spesifiktir. Aβ 43 kıyasla 50x daha yüksek affinite Aβ 42 için elde edilir. Aβ (1-38), Aβ (1-39), Aβ (1-40), Aβ (2-42), ve Aβ (8-42) ile test formatında çapraz reaktivite yoktu. Fare dizisi (5, 10, ve 13 pozisyonlarında modifiye edilmiş ) sahip Aβ peptidleriyle 3D6 antikoru inkübe edildiğinde antijen reaktivitesi bulunmadı. Peptidler 4 3 OD mean of 2 values Amiloid peptid (pg/ml) A 1-43 A 1-42 A 1-40 A 1-39 A 1-38 A 2-42 A 8-42 Şekil 2 Farklı Aβ peptidlerinin tespiti için kaplı plağın özgüllüğü Analitik duyarlılık Blank örnek (= örnek seyreltici) Tespit Sınırını (LoD) test etmek için farklı çalışmalar üzerinden 28-kat test edildi. Blank örneğin Ortalama + 2*Standart Sapma (SD) hesaplandı ve sonra ters sigmoid ilişkisi aracılığıyla bir konsantrasyona dönüştürüldü. Elde edilen LoD 65 pg/ml idi. Test aralığı Bu test aralığı kesinlik ve tahmini sapmanın %20 geçmediği yerlerde alt ve üst noktalar olarak belirlenen Kantitasyon Alt Sınırı (LLoQ) ve Kantitasyon Üst Sınırı (ULoQ) ile belirlenir. Toplam 15 CSF örneği ve 2 RVC örneği iki kez (2 raporlanan değer) ve farklı günler üzerinden 2 operatör tarafından test edildi. Bu örnek seti kullanılarak elde edilen test aralığı 225 pg/ml (LLoQ) (ör. en düşük konsantrasyonla CSF ) pg/ml dir (ULoQ) (ör. RVC1 örneği, en yüksek konsantrasyonla değerlendirilen örnek). Doğruluk Günümüzde, AD biyomarkırlarının tespiti için doğruluğun referans materyal (uluslararası tanımlı altın standart) şu anda mevcut olmadığı için araştırılması zordur. Farklı kaynaklardan proteinler üretim ve/veya arıtma süreçlerinden dolayı immunoreaktivitelerinde değişebilir. Ek olarak referans materyal post-translasyonel modifikasyonlardaki farklılıklardan dolayı doğal protein için doğru temsilci olmayabilir (ör. fosforilasyon, dimerizasyon, glikosilasyon, deamidasyon, izomerizasyon). Dünya Sağlık Örgütü (WHO) veya Amerika Birleşik Devletleri Farmakopesi (USP) gibi herhangi organizasyonla şu anda yerleştirilmiş standart yoktur.

13 81576 INNOTEST β-amiloid (1-42) / v0 / KEY-KOD: FRI56750 p 13/16 Kesinlik Kesinlik (intra-test ve inter-test değişkenlik) değerlendirildi. Toplam 16 CSF örneği, 2 RVC ve 6 RTU kalibratörü iki kez (2 raporlanan değer) ve farklı günler üzerinden 2 operatör tarafından test edildi. CSF örnekleri ve RVC örneklerinin kesinliği Tablo 1 de gösterilmiştir. Tablo 1: CSF ve RVC örnekleri üstünde kesinlik genel bakış CSF örneği (n=15*) RVC 1 (yüksek konsantrasyon) Intra--test 4.6% 4.7% varyasyonu (aralık 0.8% 11.0%) (aralık 3.0% 6.6%) Inter--test 7.8% 3.8% varyasyonu (aralık 1.4% 18.0%) n.a. *Bir örnek blank örnek olduğu için hariç tutuldu RVC 2 (düşük konsantrasyon) 2,5% (aralık 1.0% - 4.9%) 4.3% n.a. 6 RTU kalibratörü üstünde değişkenlik kesinlik profilinde şematik olarak gösterilmiştir (Şekil 3). 40 RTU kalibrasyon eğrilerinin tek tek reaktivite seviyesi ortalama kalibrasyon eğrilerine karşı analiz edildi. Kalibratörlerin her biri için arka hesaplanan konsantrasyonları üzerinden değişkenlik tespit edildi. RTU kalibratörlerinin her seviyesinde %CV (kombine inter- ve intra-test varyasyonu) en düşük ve en yüksek kalibratör noktası için hariç %15 geçmez (= anchor noktaları). kons. pg/ml %CV KAL >25% KAL ,2 KAL ,3 KAL ,9 KAL ,8 KAL 6 62,5 21,9

14 81576 INNOTEST β-amiloid (1-42) / v0 / KEY-KOD: FRI56750 p 14/16 Şekil 3: Tanımlı kalibratör konsantrasyonunun fonksiyonundaki değişkenlik. Kalibratörlerin ortalama reaktivite seviyeleri sol Y eksenine karşı çizilir, % CV değerleri sağ Y eksenine karşı çizilir. KAL1 şekilde yoktur (%CV > 25%). Müdahale eden maddeler Deneyler, kullanılan deney koşulları altında heparin, EDTA, hemoglobin, globulinler, vitamin C, fibrinojenlerin albuminleri (9) için test formatında müdahale olmadığını göstermiştir. Biyolojik referans aralığı Bir dış çalışma (12), 231 nörolojik ve psikiyatrik olarak sağlıklı bireyden elde edilen biyolojik referans aralıklarında INNOTEST β-amiloid (1-42) ve INNOTEST htau Ag ile yapıldı. Aşağıdaki referans değerleri yaşa göre bölünmüş olarak belirlendi (ortalama ± SD): Yaş CSF Aβ (1-42) (pg/ml) yaş 792 ± yaş 790 ± 228 >71 yaş 797 ± 230 Her laboratuvarın başka bir laboratuvarda elde edilen bir referans aralığının aktarımının kabul edilebilirliğini değerlendirmesinin şiddetle önerildiği unutulmamalıdır; yukarıda verilen referans aralıkları sadece in- house validasyonu başlatmak için rehber değerler olarak düşünülmelidir. Klinik sonuçlar Bir dış validasyon çalışması CSF araştırmasında yer alan sekiz Avrupa ve iki ABD üniversite merkezinde yapıldı (1). β-amiloid (1-42) ve Tau protein CSF seviyeleri 150 AD hastası (AD), 79 AD tipi olmayan bunamaya sahip hasta (NAD), 84 başka nörolojik bozukluğu olan hasta (ND) ve 100 sağlıklı gönüllü veya beynin patolojik durumlarıyla ilişkili olmayan bozukluklara sahip hastanın (CON) araştırma amacıyla saklanan artık CSF içinde belirlendi. β-amiloid (1-42) kantifikasyonu INNOTEST β-amiloid (1-42) kullanılarak yapıldı. Tau protein konsantrasyonları INNOTEST htau Ag kullanılarak ölçüldü. β-amiloid (1-42) medyan seviyeleri AD (487 pg/ml) içinde CON (849 pg/ml; p=0.001), ND (643 pg/ml; p=0.001), ve NAD (603 pg/ml; p=0.001) içinde olduğundan önemli ölçüde daha düşüktü. CON ve ND den AD ayırımı β-amiloid (1-42) ve Tau proteinin kombine değerlendirilmesiyle önemli ölçüde geliştirildi (ayrım hattı Aβ42 = ,18 Tau). %85 duyarlılıkta, kombine testin özgüllüğü sadece β-amiloid (1-42) için %55 (95% CI [47%, 62%]) ve sadece Tau protein için %65 (95% CI [58%, 72%]) ile kıyaslandığında %86ydı (95% CI [81%,91%]). %85 duyarlılıkta kombine test NAD için %58 (95% CI [47%, 69%]) spesifikti. β-amiloid (1-42), Tau protein ve CSF-fosfo-Tau (181) klinik değeri sürekli %80ni aşan duyarlılık, özgüllük ve diagnostik doğruluk seviyeleri sağlayarak otopsi-onaylı bunama vakalarında gösterilmiştir (10). Sonuç olarak, β-amiloid (1-42) ve Tau protein konsantrasyonlarının kombine ölçümü normal yaşlanma ve depresyon gibi spesifik nörolojik bozukluklardan AD ayırımı için Consensus kurallarından gelen gereklilikler grubunu karşılar: yararlı bir biyomarkır %80 den fazla duyarlılık ve özgüllüğe sahip olmalıdır (11).

15 81576 INNOTEST β-amiloid (1-42) / v0 / KEY-KOD: FRI56750 p 15/16 Test prosedürü sınırlamaları INNOTEST β-amiloid (1-42) test prosedürü insan beyin omurilik sıvısında β- amiloid (1-42) ölçmek için tasarlanmıştır. Diğer vücut sıvıları veya beyin dokusu örneklerinde yapılan testleri yorumlamak için yeterli veri yoktur. Bu nedenle bu test protokolüyle bu tip numunelerin test edilmesi önerilmez. Tedavinin izlenmesi için testin olası kullanımı, test tasarımına müdahale edebilecek tedavinin türüne büyük ölçüde bağlıdır (ör. antikor işlem prosedürleri). Yasal Uyarı US ve EP patentleri altında bu üründe bulunan Amiloid beta antikorları ile ilgili bir lisans Takeda İlaç Limited Şirketinden elde edilmiştir. Ayrıca US 5,593,846A, US 5,766,846A, US 5,837,672A, US 6,284,221B1, US 6,610,493B1, US 5,441,870A, US 5,721,130A, US 5,605,811A ve US 6,114,133A patentleri altında bu üründe bulunan Abeta monoklonal antikorlarının kulanımı için bir lisans Eli-Lilly ve Şirketten elde edilmiştir. Daha fazla bilgi da bulunabilir. Ticari markalar INNOTEST Avrupa, ABD, Japonya, Çin de olduğu gibi dünya çapında tescilli markadır Literatür referansları 1. Hulstaert et al. Improved discrimination of AD patients using beta-amyloid (1-42) and tau levels in CSF. Neurology ;52: Vanderstichele et al. Analytical performance and clinical utility of the INNOTEST PHOSPHO-TAU (181P) assay for discrimination between Alzheimer's disease and dementia with Lewy bodies. Clin Chem Lab Med.2006;44: Wiltfang et al. Consensus Paper of the WFSBP Task Force on Biological Markers of Dementia: The role of CSF and blood analysis in the early and differential diagnosis of dementia. The World Journal of Biological Psychiatry 2005; 6(2): Andreasen et al. Cerebrospinal fluid beta-amyloid (1-42) in Alzheimer disease: differences between early- and late-onset Alzheimer disease and stability during the course of disease. Arch Neurol. 1999;56: Peskind et al. Safety of lumbar puncture procedures in patients with Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2009;6: Peskind et al. Cerebrospinal fluid: when is it worthwhile to do a lumbar puncture? CNS Spectr. 2008;13: Peskind et al.

16 81576 INNOTEST β-amiloid (1-42) / v0 / KEY-KOD: FRI56750 p 16/16 Safety and acceptability of the research lumbar puncture. Alzheimer Dis Assoc Disord. 2005;19: Schoonenboom et al. Effects of processing and storage conditions on amyloid beta (1-42) and tau concentrations in cerebrospinal fluid: implications for use in clinical practice. Clin Chem. 2005;51: Vanderstichele et al. Standardization of measurement of β-amyloid (1-42) in cerebrospinal fluid and plasma. Amyloid: Int J Exp Clin Invest 2000; 7: Engelborghs et al. Diagnostic performance of a CSF-biomarker panel in autopsy-confirmed dementia. Neurobiol Aging. 2008;29: Consensus report [no authors listed] Neurobiol Aging 1998;19: Sjögren et al. Tau and Abeta42 in cerebrospinal fluid from healthy adults years of age: establishment of reference values. Clin Chem. 2001; 47: Andreasen et al. Evaluation of CSF-tau and CSF-Abeta42 as diagnostic markers for Alzheimer disease in clinical practice.arch Neurol. 2001;58: Jaworski et al. Total-tau and phospho-tau(181thr) in cerebrospinal fluid of neurologically intact population increase with age. Folia Biol (Praha). 2009;55: Vanmechelen et al. Quantification of tau phosphorylated at threonine 181 in human cerebrospinal fluid: a sandwich ELISA with a synthetic phosphopeptide for standardization. Neurosci Lett.2000;285(1): Vanderstichele et al. Standardization of preanalytical aspects of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer s disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer s Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer s & Dementia 8 (2012);65-73