NIPD ve Tek Gen Hastalıkları. Fetal RHD Tayini Dr. Ayça Aykut Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik AD

Transkript

1 NIPD ve Tek Gen Hastalıkları Fetal RHD Tayini Dr. Ayça Aykut Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik AD

2 NIPT/ NIPD

3 cfdna kullanım alanları Kalitatif Kantitatif Maternal ve Fetal DNA polimorfizm/ değişimleri tanır Normal ile karşılaştırma esasına dayanır TANI NIPD NIPT TARAMA/TEST

4 Fetal cfdna kullanım alanları 1997 : Lo et al. Maternal dolaşımda fetal nükleik asitler 2001 : Fetal Rh(D) genotipleme 2006 : Cinsiyet Tayini X-e bağlı kalıtılan hastalıklar Duchenne Hemofili KAH Cinsiyet seçimi-çin 2011 : Anöploidiler-Trizomi 21/18/13 Gebelikle ilşkili hastalıklar Preeklampsi Preterm doğum İntrauterin büyüme kısıtlılığı Tek Gen Hastalıkları

5 Fetal cfdna 20 yıldaki gelişmeler Maternal doşalımda cfdna Down Sendromu için ilk test Hemofili için dpcr ve RMD csmart Wilson Hastalığı Beta Talasemi için Taqman assay Fetal cinsiyet Rhesus Grup Anöoploid iler için tarama Talasemi için MPS ve RHDO Konjenital sensorinöral sağırlık için pikodroplet dijital PCR Kistik Fibroz için MEMO

6 Tek Gen Hastalıkları

7 Yöntemler Bowns et al Curr Opin Obstet Gynecol Apr;29(2):73-79

8 Tek Gen Hastalıkları Otozomal Resesif Otozomal Dominant Otozomal Dominant A mutasyonu B mutasyonu mutant paternal paternal de novo De novo Babadan kalıtılan dominant hastalıklar Farklı mutasyon taşıyan resesif hastalıklarda babadan kalıtılan mutasyonun dışlanması

9 OD ve de novo hastalıklar için PCR CFTR Gonzales-Gonzales et al PCR-RED(restriction enzyme digest) FGFR3 Bilinen Mutasyonu içeren DNA bölünme bölgesi %8 yorumsuz Akondroplazi Tanatorofik displazi NGS Chitty et al Panel test 29 FGFR3 mutasyon Farklı resesif mutasyon taşıyan aileler CF/ Talasemi Bespoke amplikon-tabanlı

10 Tek Gen Hastalıkları Otozomal Resesif X e bağlı Resesif Otozomal Dominant A mutasyonu A mutasyonu mutant maternal Aynı mutasyonu taşıyan resesif aileler Anneden kalıtılan dominant hastalıklar X e bağlı kalıtılan hastalıklar

11 OR ve X e bağlı hastalıklar için Haplotip Tabanlı Analiz Relatif mutasyon dozaj -RMD Relatif haplotip dozaj analizi -RHDO

12 RMD RHDO Fetal cfdna/maternal plazma Wild tip/ mutant tip oranı maternal plazmada Allelik denge var N Allelik denge yok M Fetal DNA varlığı için Erkek SRY Kız Universal markır RASSF1A fetüs da hipermetile annede hipometile SNP ve küçük delesyonların tespiti Tek bir mutasyonu dizayn edilmiş bir assay ile basit bir cihazda analiz Sık gözlenen mutasyonları saptamak için Büyük yapısal varyantları ve tekrar dizi içeriği olan bölgeleri tespit edemez Mutasyona özel assay hazırlanmalı Anneden hangi haplotip bloğunun kalıtıldığına bakılmakta SNP ve büyük delesyon, psödogen, yapısal varyant, tekrarlayıcı dizi içeriği olan bölgeleri Panel yapma imkanı Bir çok hasta bir çok gen Parental haplotip analizi gerektirir Etkilenmiş probanda spesifik SNP seçimi De novo mutasyonalar için uygun değil Sadece bir mutasyona özgü değil

13 RMD RHDO

14

15 SNP kategori Parental genomik DNA analizi Paternal Maternal Maternal Plazma DNA dizilemesi ve Analizi Analiz Olası Fetal Genotip Ek bilgi gerekmekte 1 AA CC Paternal allelin tespiti ve kalite kontrol Heterozigot 1. Fetal genomun coverage 2. Fetal fraksiyon 3. Sekanslama hata oranı 2 AA AA Kalite kontrol Parental allel için homozigot Sekanslama hata oranı 3 AC AA Paternal spesifik allelin tespiti 1. Heterozigot/Paternal spesifik allel tespit edildiyse 2. Homozigot /paternal spesifik allel tespit edilmediyse Fetal DNA fraksiyon konsantrasyonu 4 AA AC Rölatif haplotip dozaj analizi 1. Heterozigot/Dozaj imbalansı tespit edilmediyse 2. Homozigot /Dozaj imbalansı tespit edildiyse 5 AC AC Analiz edilmemekte

16 Denis Lo et al 2010

17 Genel Prensipler İlk aşamada babaya ve anneye haplotip analizi haplotip bloklarını RHDO analizi ve maternal plazmada alelik oranları hesaplamak

18 Yüksek mokelül ağırlıklı genomik DNA Barkod ve Amplifikasyon linked-read dizileme Hui et al. Çünkü maternal plazma <200 BP uzunluğunda haplotip bilgisi olamaz Bunun yerine genomikten türetilmiş ebeveyn haplotip bilgisi Ebeveynlerin (hücresel) DNA atamaları için bir iskele görevi görür Küçük barkod okumaları Barkodlama Wild-tip okumalar Mutant-tip okumalar

19 DMD Paternal haplotip gerekmemekte Distrofin geni heterozigot SNPs SNP haplotip blok Probandın SNP leri dikkate alınarak

20 DMD Fetal fraksiyon >%4 Tanı oranı %100

21

22 β-thalasemi NIPD N/IVS1-110 N/IVS1-110 SNP1 SNP2 SNP3 SNP4 110 SNP1 SNP2 SNP3 SNP4 110 βtal a c g t a a c c g a ND Normal - t c g g - c c g g ND Mat. plasma Her iki ebeveyn aynı mutasyonu taşıyor SNP1 SNP2 SNP3 SNP4 110 (a/-) c c g (a/g) t c g ND Normal Mutasyon saptanması- tek nokta analizi saptayamaz- NIPD kullanılamaz SNPs ve haplotip analizi çoklu nokta analizi- fetusda paternal alleleri saptayabilir

23 β-thalasemi NIPD N/IVS1-6 N/IVS1-110 SNP1 SNP2 SNP3 SNP4 SNP1 SNP2 SNP3 SNP4 βhal c g t c c g ND Normal t c g c c g ND Mat plasma SNP1 SNP2 SNP3 SNP4 c c g t c g ND Normal SNP1 (-/a) SNP2 (c/t) SNP3 (c/g) SNP4 (g/t) Mat plasma CVS Mat plasma CVS Mat plasma CVS Mat plasma CVS NA NA c/t c/t c/c c/c g/g g/g

24 SMA Direkt mutasyon analizi psödogeni olduğu için zor SNPs from dbsnp(144) 40% heterozigozite-6 Mb bölgede Probandın SNP leri dikkate alınarak

25 SMA

26 VALİDASYON

27 Sınırlamamalar Düşük fetal cfdna konsantrasyonu Maaliyet Ismarlama test-bespoke Test Haftada 2-3 olgu De novo ve paternal dominant mutasyonlar tanısı ya da dışlanması$$<invaziv $$$$ Resesif mutasyonlar için RHDO analizi 100 pahalı Psödogeni olanlar için durum daha da karışık pahalı False negatif/pozitif Vanishing twine bağlı false pozitif-erken gebelik haftası-usg de boş kese Düşük düzey mozaisim false pozitif-maternal DNA bak Düşük fetal cfdna konsantrasyonu-false negatif- fetal DNA belirteçleri bak Çoğul gebelikler Probanda ihtiyaç duyulmakta

28 RHD

29 RH uygunsuzluğu

30 RH uygunsuzluğu Annenin primer immunizasyonu için 0,05 ile 0,1 ml fetal eritrosit yeterli Sensitizasyon sıklıkla doğum sırasındaki fetomaternal kanama sonucu Gebelik takibinde annenin kanında normalde olmaması gereken anti- Rh (anti-d) indirek coombs testi (İCT) Doğum sonrası bebekte anneden geçen antikorların aranması direk coombs testi (DCT) Yenidoğanın hemolitik hastalığını önlemek amacıyla RhD (-) olan tüm gebelere rutin olarak anti-d immünoglobini uygulanmakta

31 RH uygunsuzluğu Kan transfüzyonu Gebelik veya doğum sırasında Rh (-) bebekten anneye kan hücresi geçmesi Kendiliğinden ya da istemli düşük Küretaj Dış gebelik Plasentanın erken ayrılması Anne karnına gelebilecek darbe ve travmalar Amniyosentez CVS (Koryon villus biyopsisi) Kordosentez Eksternal sefalik versiyon

32 RH uygunsuzluğu RhD (-) annelerin bebeğinin RhD (+) olma olasılığı yaklaşık %60 Bu annelerin %40 ında bu uygulamanın gereksiz (Teitelbaum ve ark., 2015) İnsan immünglobulin preparatlarına karşı sistemik alerjik reaksiyon hikayesi İntramüsküler yol ile kullanılan tüm preparatlarda olduğu gibi kanama komplikasyonları İnsan plazmasından yapılan ürünler, virüsler ve teorik olarak, Hepatit C, Creutzfeldt-Jakob ajanı gibi, çeşitli hastalıklara yol açabilen infeksiyonlar

33 Fetal RHD tayini Prenatal dönemde fetal RhD durumunun belirlenmesi sayesinde, yenidoğanın hemolitik hastalığı riski göze alınmaksızın, RhD (-) annelerin gereksiz immünizasyonu engellenebilir Girişimsel Olmayan Girişimsel %1 abortus riski Gebe annelerin genomunda Y kromozomununa DNA dizilerinin varlığı Amniyosentez İşlemin kendisiait fetal kaçağa yol açarak benzer immunizasyon riski CVS mekanizma D (-) annelerin genomunda genellikle RHD geni hiç bulunmadığından maternal Kordosentez Anti-D nin, insan kan ürünü olması nedeniyle kanda fetal RHD geninin bulunmasıyüksek fetusun kesinlikle D (+) olduğunu maliyet ve infeksiyon riski gösterir

34 RH uygunsuzluğu-profilaksi

35 RHD GENETİĞİ Kan grupları içerisinde Rh kan grubu bilinen en karmaşık, en polimorfik kan grubu-400 kan grubu içinde İçlerinde en önemlileri D, C, c, E ve e antijeni olmak üzere, tanımlanmış toplam 50 kan grubu antijeni Pratikte sıkça kullanılan bir terim olan Rh faktörünü belirleyen ve tüm antijenler içinde en güçlü immünojenik özelliğe sahip olan D antijeni 3 farklı antijenik yapı her 2 gen allelinde DE/cde CDe/Cde Cde/cDe

36 RHD GENETİĞİ 45% 55% Rh antijenleri RHCE ve RHD gibi 2 homolog gen tarafından kodlanır 1p36.13-p34.3 RHD geni D antijenini, RHCE geni ise C ve E antijenlerini kodlar Her biri 10 ar exon içermekte olup %94 sekans benzerliğine sahip RHD ve RHCE nin her ikisi de 417 aminoasitten oluşmuştur -36 nükleotid fark RHD baskın gen olup, RhD (-) olabilmek için homozigot negatif olmak gerekmektedir

37 RHD GENETİĞİ Genellikle D negatifliği beyaz ırkta (%15 17) RHD nin total delesyonu Siyah Afrikalılarda (%5) inaktif ve sessiz RHD Asyalılarda (%3) inaktif ve sessiz RHD Kuzey Afrikalılarda %66 sında moleküler neden, 37bp lik bir duplikasyonun prematür stop kodon oluşturarak fonksiyonel proteinin üretilmesindeki engel %15 inde hibrid RHD-CE-D geni Bu hibrid gen D antijenini kodlayamamakta ve farklı bir C antijeni kodlar

38 2010 Ege Üniversitesi-Doktora Tezi ikili ve üçlü tarama testinde risk artışı nedeni ile CVS ve ASI analizine gönderilen ya da doğuma alınan 9 39 gebelik haftası arasındaki 30 Rh (-) gebede RHD tayini Ortalama gebelik haftası 25 hafta

39 Materyal Metot 10 ml periferik kan Real-Time PCR Analizi Light Cycler 1.5 TaqMan Ekzon 7 Ekzon 10 SRY Housekeeping gen

40 Öncelikle tüm örnekler en az iki kez Ct değeri 40 dan küçük olanlar pozitif amplifikasyon Eğer her iki reaksiyonda RhD (+) olarak değerlendirildiyse, fetusun RHD genini paternal olarak taşıdığı Eğer her iki reaksiyon negatif ya da her iki reaksiyondan biri pozitif olarak değerlendirildiyse örnek iki kez daha tekrar edildi

41 Olgu no Plazma RhD Plazma Fetal RhD Fetal Cinsiyet Cinsiyet 1 RhD + XX RhD + XX 2 RhD + XX RhD + XX 3 RhD - XX RhD - XX 4 RhD - XY RhD - XY 5 RhD + XY RhD + XY 6 RhD + XX RhD + XX 7 RhD + XY RhD + XY 8 RhD + XX RhD + XX 9 RhD - XX RhD - XX 10 RhD - XX RhD - XX 11 RhD + XX RhD + XX 12 RhD + XX RhD + XX 13 RhD - XX RhD - XX 14 RhD - XX RhD - XX 15 RhD + XX RhD + XX 16 RhD + XY RhD + XY 17 RhD + XX RhD + XX 18 RhD + XY RhD + XXY 19 RhD - XY RhD - XY RhD + XY RhD + XY 21 RhD + XY RhD + XY 22 RhD + XY RhD + XY 23 RhD + XY RhD + XY 24 RhD + XY RhD + XY 25 RhD + XX RhD + XX 26 RhD + XX RhD + XX 27 RhD + XX RhD + XX 28 RhD + XX RhD + XX 29 RhD + XY RhD + XY 30 RhD - XX RhD - XX 12 E, 17 K Karşılaştırma yapılan erkek fetuslardan birinde XXY ve birinde XY+21 Maternal plazmadan fetüsün cinsiyeti %100 duyarlılıkta tespit edilmiş Ayrıca fetüsün cinsiyetinin doğru olarak belirlendiği en erken gebelik yaşı 9 hafta Gebelik Haftası Plazma RHD/Fetal RHD Pozitif Negatif Konkordans Birinci tirmester 0/0 1/1 %100 İkinci tirmester 12/12 4/4 %100 Üçüncü tirmester 9/9 3/3 %100

42 RHD Yanlış negatif sonuçlardan kaçınmak amacıyla RHD varyantlarının test sonuçlarını etkileyebilmesi nedeniyle RHD ye spesifik farklı bölgeleri içeren primerler kullanılmalı Ekzon 7 deki spesifik nükleotidlerin kontrol edilmesinin yanı sıra mutlaka ikinci bir bölgenin daha kontrol edilmesi ekzon 4 intron 4 ekzon 10 RhD (+) fetusların %3,9 u ekzon 5 ya da ekzon 10 un çalışmalara dahil edilmediği durumlarında gözden kaçabilmekte Tek başına ekzon 10 ise güvenilir bir yöntem değil Hromadnikova ve ark., 2005

43 RHD RHD ekzon 7 (+) ve RHD ekzon 10 (-) saptanması durumunda ekzon 7 PCR ı ekzon 10 a göre daha sensitif genellikle erken gebelik haftalarında (<10 gebelik haftası) düşük konsantrasyondaki fetal DNA dan kaynaklandığı düşünülmekte Örnek RhD (+) RHD ekzon 7 (-) ve RHD ekzon 10 (+) (Ct 35) olduğu durumda Rh varyantından söz edilebilir RhD (-) d(c)ce ya da RhD (+) olarak değerlendirilir RhD pseudogen (RHDΨ) veya RHD-CE-Ds hibrit gen Örnek RhD (+)

44 Gebelik süresince seri fetal DNA ölçümleri sonucu maternal plazmadaki hücre dışı serbest fetal DNA miktarının gebelik haftası arttıkça anlamlı olarak arttığı gözlemlenmiştir Üçüncü trimesterin sonlarına doğru, maternal dolaşımdaki hücre dışı serbest fetal DNA miktarında hızlı bir artış izlenmektedir Bu çalışmada da ekzon 7, ekzon 10 ve SRY DNA kopya sayıları gebelik haftası artıkça anlamlı bir şekilde artmış olarak saptandı

45 Sonuç Bu çalışmaya Rh (-) gebeleri aldığımız düşünüldüğünde; maternal genomda bulunmayan SRY ve RHD genlerinin saptanmış olması elde edilen sonuçların kesin olarak fetusa ait genetik materyalin varlığını göstermekte SRY (+) ve RHD (+) olgular dikkate alındığında SRY kopya sayısı artışı ile ekzon 7 ve ekzon 10 kopya sayıları arasındaki korelasyon anlamlı RHD (+) kız fetuslarda da ekzon 7 ve ekzon 10 arasındaki korelasyon yöntemin fetal genetik materyali belirlemede güvenilir olduğunu göstermekte

46 Anti-D dozunun 28. gebelik haftasında yapıldığı düşünüldüğünde; 28. gebelik haftası >28. gebelik haftası Fark yok Bu da RhD durumunu saptanmasının gebeliğin herhangi bir haftasında başarı ile gerçekleştirebileceğini göstermektedir

47 Klinik Klavuz < TL RhoGAM 300TL Test?? Danimarka Hollanda Finlandiya İngiltere İsveç Norveç Fransa İspanya Belçika

48

49 Gelecek

50 NIPT>NIPD WGS

51 Teşekkürler